乳脂肪是构成牛奶营养品质的主要基础物质之一，与牛奶的质量密切相关；促进乳腺内乳脂肪的合成、改进乳脂肪组成是改善牛奶品质的重要措施之一。因此，深入研究乳成分前体物(milk component precursor，MCP)对研究乳脂肪合成的调节机理、改进牛奶品质、保证优质牛奶生产具有重要的理论与指导意义。短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFA)乙酸和β-羟丁酸(β-hydroxybutyric acid,BHBA)是奶牛乳腺合成乳脂肪前体物(milk fat precursor,MFP)，乳腺中约50%的脂肪酸来源于SCFA在奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)内的从头合成，主要包括中短链脂肪酸(short and medium chain fatty acids,SMCFA)(C4 ∶ 0～C14 ∶ 0)及C16 ∶ 0。许多研究均表明，乙酸作为MFP在提高乳脂率、促进乳脂肪合成方面起着重要作用。陈杰等^[1]的研究报道，在奶牛饲粮中添加乙酸钠可使产奶量增加5.58%，乳脂率增加10.58%。乙酸钠也可称为“化学粗饲料”，在饲粮中添加乙酸钠，可增加瘤胃内乙酸比例、降低丙酸比例，从而提高乳脂率和产奶量。也有研究表明，通过阴外动脉或瘤胃灌注乙酸可提高乳脂肪和乳蛋白含量。Purdie等^[2]研究表明，奶牛阴外动脉灌注乙酸可显著增加乳脂率。孙满吉等^[3]在奶山羊阴外动脉灌注乙酸显著提高了乳脂率，并使乳腺摄取的MFP能转化为乳脂肪的效率提高了1.02%～2.04%。Maxin等^[4]的研究表明，瘤胃灌注乙酸使得乳脂率增加了6.5%，而且改变了乳脂肪组成。齐利枝等^[5]研究了不同浓度的乙酸对BMECs中乳脂肪合成的影响，结果指出乙酸对BMECs内脂滴形成及甘油三酯(triglycerides,TAG)的积累有显著的促进作用，同时指出在乙酸浓度为10~12 mmol/L时，能较好的促进过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)基因的表达。BHBA作为重要的MPF之一，主要由瘤胃上皮细胞吸收的丁酸转化而来，然而，关于BHBA对乳脂肪合成方面的影响研究却十分有限，结果也不尽一致。白鸽等^[6]在奶牛肝细胞的培养液中添加不同浓度的BHBA，结果表明，高浓度的BHBA可以抑制肝脏脂肪氧化和合成，从而影响MFP的供应，进一步影响乳脂肪的合成。孔庆洋^[7]利用体外法研究了不同浓度的丁酸钠对BMECs胞外TAG含量的影响，结果表明，随着丁酸钠浓度的增加，TAG含量显著增加，同时与乳脂肪合成相关基因的表达量也有升高的趋势。然而，Yonezawa等^[8]的研究发现，丁酸(1～10 mmol/L)以剂量依赖模式影响BMECs的TAG积累和脂滴形成，丁酸可能抑制脂肪的合成，促进BMECs内的β氧化。鉴于此，本试验以BMECs为模型，研究不同浓度的BHBA对细胞活力、乳脂肪合成及乳脂肪合成相关基因的相对表达量的影响，进一步明确BHBA对乳脂肪合成的促进作用及其可能机理。

DMEM/FA12培养液、胎牛血清(FBS)、催乳素、胰岛素转铁蛋白、表皮生长因子、胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(EDTA)均购自美国的Gibco公司，氢化可的松、四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)和β-羟丁酸钠均购自美国的Sigma公司，磷酸盐缓冲溶液(PBS，HyClone，美国)，无脂肪酸牛血清白蛋白(BSA，Equitech-Bio，美国)，RNAprep pure Cell/Bacteria Kit[天根生化科技(北京)有限公司]，PrimeScript RT Master Mix(TaKaRa，大连)和SYBR Premix Ex Taq^TM Ⅱ(TaKaRa，大连)。

BMECs采用胶原酶消化法获得。取健康荷斯坦奶牛乳腺组织，分离去除组织外层于深处取约1 cm³的组织块若干，放入预冷的PBS中。带入超净台用PBS将组织块洗净后，再剪去组织块表层并将组织块剪成糊状。加入0.5%胶原酶Ⅱ(GIBCO，美国)溶液于37 ℃的5%二氧化碳(CO₂)条件下消化1 h，每隔20 min轻轻摇晃离心管。消化液用孔径80目的细胞滤网过滤，收集细胞滤液，800×g离心5 min，弃上清。加入BMECs培养液，吹打均匀，转入25 cm²培养瓶中，于37 ℃的5%CO₂培养箱中培养。每日观察细胞的生长情况，待细胞生长至80%～90%融合度时，根据BMECs与成纤维细胞对胰蛋白酶消化敏感性不同，纯化BMECs并进行传代。本试验采用第3代传代细胞进行研究。将传至第3代的BMECs悬液接种于细胞培养板上，每孔加入含10%FBS的DMEM/F12培养液，于37 ℃的5%CO₂培养箱培养48 h。

将培养48 h的BMECs培养孔随机分为6个组，每个组4个重复。每孔加入含不同浓度BHBA的DMEM/F12培养液，培养液中的FBS用1 g/L无脂肪酸的BSA代替，并使反应体系中BHBA(以β-羟丁酸钠的形式进行添加)的最终浓度分别为0(对照)、0.58、1.16、2.32、4.64和9.28 mmol/L，将细胞培养板置于37 ℃、5%CO₂培养箱中继续培养48 h。

细胞活力的检测采用MTT比色法^[9]，以细胞相对增殖率(relative growth rate,RGR)表示。收集第3代的BMECs，用含10%FBS的DMEM/F12培养液悬浮细胞，将细胞悬浮液以1×10⁴个/孔接种于96孔培养板(Corning,3599)，置于37 ℃、5%CO₂培养箱中，培养48 h后吸出各孔内培养液，添加含不同浓度BHBA的DMEM/F12诱导培养液，继续培养48 h；在培养结束前4 h，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)；4 h后弃上清液，每孔加入100 μL DMSO，振荡10 min后，用全自动酶标仪(Synergy H4 Bio Tek,美国)检测490 nm波长下各培养孔的吸光度(OD_{490 nm})值。

RGR(%)=(试验组OD_{490 nm}/对照组OD_{490 nm})×100。

BMECs内脂滴的形成与TAG含量采用油红O染色法，其中TAG含量的测定根据Ramírez-Zacarías等^[10]的方法进行。将细胞悬浮液(1×10⁵个/孔)接种于24孔培养板，培养48 h后弃掉培养液，用PBS漂洗2次，每孔加入0.2 mL 4%多聚甲醛溶液固定细胞1 h；PBS漂洗2次，用0.5 mL油红O工作液浸染2 h，用PBS溶液漂洗直至干净，显微镜(Olympuse IX71，日本)下观察拍照；培养板置于32 ℃培养箱内将多余的水分蒸发，加入0.3 mL异丙醇萃取，然后将染液用移液枪吸出，用全自动酶标仪于510 nm波长处测吸光度(OD_{510 nm})值，以OD_{510 nm}值代表TAG含量。每个组3个重复。

BMECs内乳脂肪合成的相关基因包括：脂肪酸合成酶(FASN)、乙酰辅酶A羧化酶α(ACACA)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)、分化抗原簇 36(CD36)、脂肪酸结合蛋白3(FABP3)和 PPARG,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测。将每孔1×10⁵个细胞悬浮液接种于6孔培养板,培养48 h后提取RNA。细胞总RNA的提取采用RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit试剂盒，RNA的完整性和纯度用2%的凝胶电泳在电泳仪(Bio-Rad)上进行检测。反转录采用PrimeScript RT Master Mix试剂盒，反应体系为10 μL。RNA反转录后用SYBR Premix Ex Taq^TM Ⅱ试剂盒进行RT-PCR，反应体系为20 μL：SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL和dH₂O 7.2 μL。选用管家基因磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参基因。引物列表见表1。RT-PCR的反应程序为：95.0 ℃ 30 s；95.0 ℃ 30 s，退火温度30 s，72.0 ℃ 20 s，共40个循环；72 ℃ 7 min。熔解曲线程序为：70～95 ℃，每6 s升高0.5 ℃,共51个循环。每个组6个重复。采用2^-△△Ct法进行相对定量数据分析。

试验数据采用SAS 9.0软件的回归统计程序，对各项测试指标的BHBA处理剂量效应进行一次线性和二次曲线回归分析，P<0.05表示差异显著。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 引物序列及参数 Table 1 Primer sequences and parameters 基因 Genes 引物序列 Primer sequences (5′—3′) 基因库序列号 GenBank No. 长度 Length/bp 退火温度 Annealing temperature/ ℃ 参考文献 References 磷酸甘油醛脱氢酶 GAPDH 上游 Forward：GGGTCATCATCTCTGCACCT 下游 Reserve：GGTCATAAGTCCCTCCACGA XM_001252479 177 60 Zhou 等[11] 脂肪酸合成酶 FASN 上游 Forward：AGGACCTCGTGAAGGCTGTGA 下游 Reserve：CCAAGGTCTGAAAGCGAGCTG NM_001012669 85 62 本试验 设计 乙酰辅酶A 羧化酶α ACACA 上游 Forward：CATCTTGTCCGAAACGTCGAT 下游 Reserve：CCCTTCGAACATACACCTCCA AJ132890 101 58 Bionaz 等[12] 硬脂酰辅酶A 去饱和酶 SCD 上游 Forward：TCCTGTTGTTGTGCTTCATCC 下游 Reserve：GGCATAACGGAATAAGGTGGC AY241933 101 58 Bionaz 等[12] 分化抗原簇36 CD36 上游 Forward：CCTCTTGGCAACCACTTTCA 下游 Reserve：GCTTTGACACCCGAGTAACG BC103112 113 62 胡菡[13] 脂肪酸结合蛋白3 FABP3 上游 Forward：GAACTCGACTCCCAGCTTGAA 下游 Reserve：AAGCCTACCACAATCATCGAAG DN518905 102 62 Bionaz 等[12] 过氧化物酶体 增殖物激活受体γ PPARG 上游 Forward：CCAAATATCGGTGGGAGTCG 下游 Reserve：ACAGCGAAGGGCTCACTCTC NM_181024 101 62 Bionaz 等[12]

表1 引物序列及参数 Table 1 Primer sequences and parameters

表2结果表明，0.58～4.64 mmol/L BHBA组 RGR均高于对照组，而当BHBA浓度增加到 9.28 mmol/L时，RGR降低，并低于对照组。回归分析结果表明，RGR随着BHBA浓度的增加呈显著的二次曲线变化(P=0.041，R²=0.881 4)，二者呈显著的剂量依赖关系。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 BHBA对BMECs活力(相对增殖率)的影响 Table 2 Effect of BHBA on viability (RGR) of BMECs % 项目 Item β-羟丁酸浓度 BHBA concentration/(mmol/L) SEM P值 P-value 0 0.58 1.16 2.32 4.64 9.28 一次 Linear 二次 Quadratic 相对增殖率 RGR 100.00 107.98 107.26 106.30 106.38 91.56 0.01 0.113 0.041

表2 BHBA对BMECs活力(相对增殖率)的影响 Table 2 Effect of BHBA on viability (RGR) of BMECs

表3结果表明，尽管从数值上看，低浓度的BHBA(0.58～2.32 mmol/L)组TAG含量较高，高浓度的BHBA(4.64~9.28 mmol/L)组呈降低趋势，但经回归分析检验，随着BHBA浓度增加，BMECs内TAG含量没有显著的一次线性或二次曲线变化(P>0.05)。由图1的脂滴形成结果可以直观地看出，低浓度(0.58~2.32 mmol/L)的BHBA对BMECs内脂滴的形成有一定的促进作用，而高浓度(4.64~9.28 mmol/L)的BHBA对脂滴的形成促进效果减弱。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 BHBA对BMECs内TAG含量的影响 Table 3 Effect of BHBA on TAG content in BMECs 项目 Item β-羟丁酸浓度 BHBA concentration/(mmol/L) SEM P值 P-value 0 0.58 1.16 2.32 4.64 9.28 一次 Linear 二次 Quadratic 甘油三酯 TAG 0.081 0.095 0.096 0.093 0.089 0.086 0.00 0.663 0.645

表3 BHBA对BMECs内TAG含量的影响 Table 3 Effect of BHBA on TAG content in BMECs

图 1(Figure 1)

Fig. 1

图1 BHBA对BMECs内脂滴形成的影响 Fig. 1 Effect of BHBA on lipid droplet formation in BMECs(400×)

如表4所示，0.58~9.28 mmol/L BHBA组的FASN、ACACA、FABP3和PPARG基因相对表达量均在数值上高于对照组，其中FASN和FABP3基因相对表达量以1.16~2.32 mmol/L BHBA组的较高，ACACA和SCD基因相对表达量以0.58~1.16 mmol/L BHBA组的较高，PPARG基因相对表达量以4.64~9.28 mmol/L BHBA组的较高。所有BHBA组的CD36基因相对表达量均低于对照组。然而，经回归分析检验，FASN、ACACA、SCD、CD36、FABP3和PPARG的基因表达量随着BHBA浓度增加的均没有显著的一次线性或二次曲线变化(P>0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 BHBA对BMECs乳脂肪相关基因相对表达量的影响 Table 4 Effects of BHBA on therelative expression of genes involved in milk fat synthesis in BMECs 基因 Genes β-羟丁酸浓度 BHBA concentration/(mmol/L) SEM P值 P-value 0 0.58 1.16 2.32 4.64 9.28 一次 Linear 二次 Quadratic 脂肪酸合成酶 FASN 1.0 1.20 1.39 1.39 1.14 1.02 0.21 0.474 0.448 乙酰辅酶A羧化酶α ACACA 1.0 1.70 1.63 1.27 1.24 1.14 0.14 0.474 0.779 硬脂酰辅酶A去饱和酶 SCD 1.0 1.30 1.23 0.98 0.96 0.94 0.21 0.221 0.497 分化抗原簇36 CD36 1.0 0.67 0.85 0.86 0.77 0.77 0.11 0.499 0.777 脂肪酸结合蛋白3 FABP3 1.0 1.11 1.88 1.40 1.37 1.28 0.44 0.946 0.760 过氧化物酶体增殖物激活受体γ PPARG 1.0 1.09 1.16 1.48 1.77 1.82 0.31 0.317 0.536

表4 BHBA对BMECs乳脂肪相关基因相对表达量的影响 Table 4 Effects of BHBA on therelative expression of genes involved in milk fat synthesis in BMECs

细胞活力是用来反映细胞存活和增殖的指标。本研究结果发现，BHBA作为乳脂肪酸内源合成的前体物对BMECs活力的调节作用呈显著的浓度依赖关系，RGR随着BHBA浓度的增加呈显著的二次曲线增加，即低浓度的BHBA(0.58～4.64 mmol/L)可促进BMECs活力，而高浓度(9.28 mmol/L)则表现出抑制作用。目前关于SCFA对BMECs活力的研究报道极少，其机理还需要进一步探讨。

乳脂肪的主要成分是TAG，它在粗面内质网膜的表面合成，在细胞质中以脂滴的形式积累，不同大小的脂滴被质膜包裹后从细胞分泌出去^[14]。因此，BMECs内脂滴的形成和TAG含量直接反映了BMECs内乳脂肪的合成情况，与乳脂率密切相关。本研究结果表明，在BMECs培养液中添加不同浓度的BHBA，对细胞内脂滴的形成有一定促进效果，对TAG的积累尽管无显著的影响，但从总体趋势看，低浓度(0.58～2.32 mmol/L)的BHBA对TAG的积累有一定的促进作用，而高浓度(4.64~9.28 mmol/L)的BHBA有一定抑制效果。目前，关于BHBA对乳脂肪合成的影响及其机理研究报道甚少，结果也不尽一致。本研究结果提示，BHBA对BMECs内乳脂肪的合成有一定促进作用，且促进效果与BHBA的浓度有关。

FASN和ACACA是奶牛乳腺中参与脂肪酸从头合成的关键酶^[15]。孔庆洋^[7]在BMECs培养液中添加丁酸(0～1.25 mmol/L)，显著增加了细胞外TAG的含量，上调了FASN和ACACA的基因表达。然而，Yonezawa等^[8]的研究发现，1～10 mmol/L的丁酸以剂量依赖模式影响BMECs的TAG积累和脂滴形成，10 mmol/L的丁酸促进了细胞内TAG的积累，降低了乙酰辅酶A羧化酶的活性，但没有形成脂滴；提示丁酸可能抑制脂肪的合成，促进BMECs内的β-氧化；结果也指出，细胞内TAG的积累可能直接或间接地与BMECs的分化有关。本试验的研究结果发现，BHBA对BMECs的FASN和ACACA基因相对表达量影响经回归分析差异不显著，即BHBA作为MFP，其浓度和与从头合成有关的FASN和ACACA基因相对表达量无显著的一次线性或二次曲线的关系。SCD是单不饱和脂肪酸合成的主要酶，由于瘤胃氢化作用，乳腺摄取的脂肪酸中只有少量是饱和脂肪酸。SCD位于内质网上，它能在14烷酰-、16烷酰-和18烷酰-辅酶A的C9位上形成双键，但其主要底物是棕榈酰辅酶A和硬脂酰辅酶A^[16]。本试验的研究结果表明，经回归分析检验，BHBA浓度与SCD基因相对表达量无显著的一次线性或二次曲线的关系。目前关于BHBA对SCD基因相对表达量的影响尚未见报道，确切的结果还有待于进一步的探讨。

FABP3和CD36是奶牛乳腺中2种主要的长链脂肪酸(long chain fatty acids，LCFA)转运蛋白，在奶牛乳腺中FABP3和CD36基因的共表达提示这2种蛋白存在相近的功能关系^[17]。FABP3参与细胞内LCFA的转运，CD36主要将脂肪酸转运进入乳腺细胞，二者与BMECs对LCFA的摄取与转运有关。PPAR在奶牛的乳脂肪合成方面起重要调节作用^{[15, 18]}，对调节细胞的增殖与分化有一定作用^[19]。已发现的PPAR有3种亚型：PPARα、PPARβ/δ和PPARγ，各亚型的组织分布不同^[20]。然而，目前关于丁酸对FABP3、CD36和PPAR基因相对表达量的研究极少。Yonezawa等^[8]研究表明，BMECs培养液中分别添加10 mmol/L乙酸、丁酸或辛酸，均可显著上调细胞中CD36 mRNA表达量，但对PPARγ的蛋白质表达的下调作用不显著。然而，本试验的研究结果发现，BHBA浓度对FABP3、CD36和PPARγ基因相对表达量的影响结果经回归分析检验差异均不显著。造成这些结果不一致的原因尚不清楚，目前相关的研究报道也很少，值得进一步探讨。

综上所述，本试验主要研究了BHBA对BMECs内乳脂肪合成的促进作用，结果得出低浓度(0.58~2.32 mmol/L)的BHBA可促进脂滴的形成，高浓度(4.64~9.28 mmol/L)的促进效果减弱。在此基础上又从乳脂肪合成相关基因表达的角度探讨了其可能的影响机理，结果显示，0.58~9.28 mmol/L BHBA的对FASN、ACACA、SCD、FABP3、PPARγ和CD36基因的相对表达量均无显著一次线性或二次曲线的调节作用。由此可见，BHBA对BMECs内乳脂肪合成的促进作用是否与乳脂肪合成相关基因的表达量发生改变有关，还需要进一步探讨。

神经内分泌因素对乳脂肪和乳蛋白含量具有重要的调控作用。生长激素和催乳素可以调控奶牛乳脂肪和乳蛋白前体物的生成、摄取和利用。而乳脂肪和乳蛋白前体物也可以通过直接或间接作用调控牛垂体组织泌乳相关激素的合成和分泌。王建发^[21]的研究指出，BHBA不仅能作为能量物质直接参与机体能量代谢调控，还可作为中枢信号物质影响下丘脑能量稳态和激素分泌功能；BHBA可引起奶牛腺垂体细胞的生长激素和催乳素等内分泌激素的分泌量减少，进而影响乳蛋白与乳脂肪等乳成分的合成。因此，BHBA对乳脂肪合成的影响可能与神经内分泌有关，但确切的研究有待进一步探讨。

BHBA对BMECs活力的促进效果呈显著的二次曲线增加，即BHBA对BMECs活力呈浓度依赖关系；BHBA对细胞内乳脂肪的合成有提高的趋势。