胆固醇广泛存在于各种组织和细胞中，对动物细胞膜的结构和功能至关重要，是人体必需的营养成分^[1]。然而，体内过多的胆固醇摄入和堆积会引起冠心病、动脉粥样硬化、高脂血症等疾病^{[2, 3]}。据世界卫生组织(WHO)预测，到2030年，将会有大约2 360万人死于心血管疾病^[4]。诸多体外和体内试验研究表明，乳酸菌及其发酵产品可通过胆盐水解酶同化、吸收和共沉淀等作用来降胆固醇^{[5, 6]}。王今雨等^[7]研究发现，植物乳杆菌NDC75017在体外发酵上清液、菌体洗涤液和细胞破碎液对胆固醇的脱除率分别为16.43%、26.35%和32.87%。Sohail等^[8]和Mikulski等^[9]报道，在饲粮中添加乳酸菌制剂可降低鸡血清和蛋中胆固醇含量。近年来，养殖业的快速发展给我国城乡居民提供了丰富的肉、蛋、奶资源，然这些动物性产品中含有较高的胆固醇，这在一定程度上影响了人类的健康，因而开发低胆固醇动物性产品具有重要的现实意义。徳氏乳杆菌属同型发酵乳酸菌， 主要应用于乳制品发酵工业，研究证实，其发酵产品和菌制剂具有降血清胆固醇功效，但其具体机制仍不清楚^{[10, 11]}。本研究旨在探讨无抗饲粮中添加德氏乳杆菌制剂对育肥猪胆固醇代谢的影响，为低胆固醇猪肉开发提供理论依据。

德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)由湖南农业大学动物科学技术学院功能微生物实验室筛选，武汉大学菌种保藏中心鉴定保藏(保藏号M207096)。菌种活化后，送至北京国家粮食局科学研究院生产包被为微胶囊菌粉制剂(活菌数≥1.01×10⁹ CFU/g)。

总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和总胆汁酸(total bile acids,TBA)检测试剂盒均购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。

试验饲粮参照NRC(1998)育肥猪(60~110 kg)营养需要推荐量配制，基础饲粮组成及营养水平见表1，饲粮均制成粉料。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % 原料 Ingredients 含量 Content 营养水平 Nutrient levels2) 含量 Content 玉米 Corn 67.83 代谢能 DE/(MJ/kg) 13.36 豆粕 Soybean meal 23.00 粗蛋白质 CP 15.50 麦麸 Wheat bran 4.00 钙 Ca 0.60 豆油 Soybean oil 2.00 总磷 TP 0.55 磷酸氢钙 CaHPO4 1.17 有效磷 AP 0.32 食盐 NaCl 0.40 赖氨酸 Lys 1.03 石粉 Limestone 0.60 蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys 0.59 预混料 Premix1) 1.00 苏氨酸 Thr 0.70 合计 Total 100.00 色氨酸 Trp 0.18 1)预混料为每千克饲粮提供The premix provides the following per kg of the diet：VA 2 512 IU，VD3 1 200 IU，VE 34 IU，VK3 1.5 mg，VB12 17.6 μg，核黄素 lactoflavin 2.5 mg，泛酸 pantothenic acid 6.8 mg，烟酸 niacin 20.3 mg，氯化胆碱 choline chloride 351 mg，Mn 10 mg，Fe 50 mg，Zn 50 mg，Cu 20 mg，I 0.3 mg，Se 0.3 mg。 2)营养水平均为计算值。Nutrient levels are calculated values.

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

选用健康、平均体重为(65.34±3.64) kg的杜×(长×大)育肥猪120头，随机分为2组，每组6个重复，每个重复10头(公母各占1/2)。对照组饲喂无抗基础饲粮，试验组饲喂无抗基础饲粮+0.1%德氏乳杆菌制剂。预试期7 d，试验期42 d。分别于试验第1、43天的08:00对每个重复猪进行空腹称重，同时全程记录每个重复猪总采食量、腹泻和发病情况。试验期第14、28、42天的08:00每个重复选1头猪(每组中公母各3头)进行前腔静脉采血(10 mL/头)，静置30 min后，3 000 r/min离心10~15 min，分离血清，并一式两份分装于Eppendorf管中，于-20 ℃冰箱中保存；同时试验期第12~14天、第26~28天、第40~42天，每个重复连续收集猪的新鲜粪便，将3 d的猪粪混匀后留取100 g，然后转入-20 ℃冰箱保存。试验结束后，从每个重复选取1头体重接近平均体重的阉公猪，停食、停水24 h后进行屠宰，分离肝脏、背最长肌和心脏，各组织选取相同部位10 g，用锡箔纸包裹后放入-80 ℃冰箱中保存。

饲养试验于2013年5月31日至2013年7月11日在湖南攸县天心502网岭四监区原种猪场进行。试验期间，每天的09：00和16：00各喂料1次，猪自由采食和饮水，其他饲养管理及免疫程序与猪场一致。

试验开始和结束时测定各个重复的体重，统计每个重复猪的总采食量、腹泻和发病情况，计算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)、料重比(F/G)、腹泻率和发病率。

平均日增重＝(每重复末期均重-每重复初期均重)/(试验天数×每重复头数)；

平均日采食量＝每重复总采食量/(试验天数×每重复头数)；

料重比＝平均日采食量/平均日增重；

腹泻率(%)＝[(每重复腹泻头数×腹泻天数)/(每重复头数×试验天数)]×100；

发病率(%)＝[(每重复发病头数×发病天数)/(每重复头数×试验天数)]×100。

从-20 ℃冰箱中取出血清样品，室温条件下解冻30 min，用移液枪吸取400 μL于干净的10 mL离心管中，利用迈瑞BS-200全自动生化分析仪测定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C和TBA的含量，所测指标严格按照相关试剂盒说明书进行操作。

参照Kim等^[12]报道的方法测定粪和组织中TC和TBA的含量。

TC含量测定：利用分析天平称样0.2 g左右，转入10 mL离心管，移取5 mL氯仿-甲醇(体积比为2 ∶ 1)混合液，充分匀浆。匀浆液4 000 r/min离心10 min，取2 mL上清移入10 mL干净离心管，65 ℃水浴条件下氮气(N₂)吹干，残渣中加5 mL甲醇溶解，用TC检测试剂盒在迈瑞BS-200全自动生化分析仪上测定样品中TC含量。

TBA含量测定：利用分析天平称样0.5 g左右，转入10 mL离心管，加入5 mL蒸馏水，充分匀浆。匀浆液4 000 r/min离心10 min，取400~600 μL上清，用TBA检测试剂盒在迈瑞BS-200全自动生化分析仪上测定样中TBA含量。

试验数据经Excel 2003软件整理，采用SPSS 17.0统计软件进行t检验，以P<0.05作为差异显著性判断标准，结果均以平均值±标准差(mean±SD)表示。

由表2可知，2组试验猪初均重差异不显著(P>0.05)，而经42 d饲喂，试验组末均重、平均日增重和平均日采食量分别较对照组提高了1.23%、5.11%和3.61%，料重比降低了1.25%，但差异均不显著(P>0.05)。腹泻率和发病率方面，与对照组相比，试验组分别降低了61.51%(P<0.01)和58.44%(P<0.05)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 德氏乳杆菌对育肥猪生产性能的影响Table 2 Effects of Lactobacillus delbrueckii on growth performance of fattening pigs 项目 Items 对照组 Control group 试验组 Experimental group 初均重 Average initial weight/kg 65.43±3.61 65.24±3.67 末均重 Average final weight/kg 91.06±3.17 92.18±4.88 平均日增重 ADG/g 610.24±50.08 641.43±54.24 平均日采食量 ADFI/g 1 960.51±109.46 2 031.19±123.34 料重比 F/G 3.21±0.15 3.17±0.16 腹泻率Diarrhea rate/% 8.34±1.02A 3.21±0.45B 发病率 Morbidity/% 10.13±3.11a 4.21±1.32b 同行数据肩标相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下表同。 Values with the same or no letter superscripts within the same row mean no significant difference (P>0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01). The same as below.

表2 德氏乳杆菌对育肥猪生产性能的影响Table 2 Effects of Lactobacillus delbrueckii on growth performance of fattening pigs

由表3可知，试验第14天，试验组猪的血清TC、TBA、TG、LDL-C含量较对照组降低了4.51%、36.67%、1.68%和6.92%，HDL-C含量、HDL-C/LDL-C较对照组分别提高了4.48%、14.71%，2组间除TBA含量差异显著(P<0.05)外，其余均无显著性差异(P>0.05)。试验第28天，2组间各血脂指标差异均不显著(P>0.05)，与 对照组相比，血清TC、TBA、TG含量分别降低了4.72%、7.47%、25.71%，LDL-C含量提高了0.83%。试验第42天，血清TBA含量较对照组降低了38.59%(P<0.05)，其余血脂指标差异均不显著(P>0.05)；TC、TG、LDL-C含量较对照组分别降低了7.22%、26.52%、6.30%；HDL-C含量和HDL-C/LDL-C较对照组提高了2.70%和10.34%。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 德氏乳杆菌对育肥猪血脂指标的影响 Table 3 Effects of Lactobacillus delbruecki on serum lipid indexes of fattening pigs 项目 Items 对照组 Control group 试验组 Experimental group 第14天 On day 14 总胆固醇 TC/(mmol/L) 2.44±0.61 2.33±0.33 总胆汁酸 TBA/(μmol/L) 178.05±7.78a 112.73±9.54b 甘油三酯 TG/(mmol/L) 1.19±0.43 1.17±0.32 高密度脂蛋白胆固醇 HDL-C/(mmol/L) 1.07±0.13 1.15±0.04 低密度脂蛋白胆固醇 LDL-C/(mmol/L) 1.59±0.49 1.48±0.16 高密度脂蛋白胆固醇/低密度脂蛋白胆固醇 HDL-C/LDL-C 0.68±0.22 0.78±0.05 第28天 On day 28 总胆固醇 TC/(mmol/L) 2.12±0.62 2.02±0.41 总胆汁酸 TBA/(μmol/L) 123.10±14.31 113.90±13.75 甘油三酯 TG/(mmol/L) 2.45±0.96 1.82±0.64 高密度脂蛋白胆固醇 HDL-C/(mmol/L) 1.06±0.17 1.06±0.21 低密度脂蛋白胆固醇 LDL-C/(mmol/L) 1.20±0.39 1.21±0.36 高密度脂蛋白胆固醇/低密度脂蛋白胆固醇 HDL-C/LDL-C 0.88±0.33 0.88±0.58 第42天 On day 42 总胆固醇 TC/(mmol/L) 1.94±0.51 1.80±0.94 总胆汁酸 TBA/(μmol/L) 113.98±6.04a 70.00±8.86b 甘油三酯 TG/(mmol/L) 4.83±0.52 4.41±0.52 高密度脂蛋白胆固醇 HDL-C/(mmol/L) 1.11±0.16 1.14±0.21 低密度脂蛋白胆固醇 LDL-C/(mmol/L) 1.27±0.27 1.19±0.34 高密度脂蛋白胆固醇/低密度脂蛋白胆固醇 HDL-C/LDL-C 0.87±0.49 0.96±0.53

表3 德氏乳杆菌对育肥猪血脂指标的影响Table 3 Effects of Lactobacillus delbruecki on serum lipid indexes of fattening pigs

由表4可知，试验第12~14天，与对照组相比，试验组粪中TBA含量提高了30.77%(P<0.05)，TC含量降低了19.35%(P<0.01)；第26~28天，试验组粪中的TBA和TC含量分别较对照组提高了6.25%和11.00%(P>0.05)；第40~42天，试验组粪中TBA含量较对照组提高了25.00%(P<0.05)，TC含量较对照组降低了12.83%(P>0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 德氏乳杆菌对育肥猪粪中TC和TBA含量的影响 Table 4 Effects of Lactobacillus delbruecki on the contents of TC and TBA in feces of fattening pigs mg/g 项目 Items 对照组 Control group 试验组 Experimental group 第12~14天 总胆汁酸 TBA 0.91±0.08b 1.19±0.23a From day 12 to day 14 总胆固醇 TC 0.62±0.35A 0.50±0.13B 第26~28天 总胆汁酸 TBA 0.96±0.38 1.02±0.28 From day 26 to day 28 总胆固醇 TC 0.31±0.17 0.42±0.12 第40~42天 总胆汁酸 TBA 0.76±0.26b 0.95±0.41a From day 40 to day 42 总胆固醇 TC 0.39±0.06 0.34±0.10

表4 德氏乳杆菌对育肥猪粪中TC和TBA含量的影响 Table 4 Effects of Lactobacillus delbruecki on the contents of TC and TBA in feces of fattening pigs

表5中的结果显示，试验组猪肝脏TBA含量较对照组降低了11.43%(P>0.05)；TC方面，试验组猪肝脏、心肌和背最长肌中含量分别较对照组降低了4.00%、1.76%和0.87%(P>0.05)。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 德氏乳杆菌对育肥猪相关组织中TC和TBA含量的影响 Table 5 Effects of Lactobacillus delbruecki on the contents of TC and TBA in related tissues of fattening pigs mg/g 项目 Items 对照组 Control group 试验组 Experimental group 肝脏总胆汁酸 TBA in liver 0.35±0.05 0.31±0.08 肝脏总胆固醇 TC in liver 4.00±0.57 3.84±0.64 心肌总胆固醇 TC in myocardium 2.84±0.47 2.79±0.60 背最长肌总胆固醇 TC in longissimus dorsi 2.31±0.34 2.29±0.48

表5 德氏乳杆菌对育肥猪相关组织中TC和TBA含量的影响 Table 5 Effects of Lactobacillus delbruecki on the contents of TC and TBA in related tissues of fattening pigs

诸多研究结果证实，在畜禽饲粮中添加单一或复合的乳酸菌制剂能改善畜禽健康状况和提高畜禽生产性能。孙建广等^[13]研究表明，在饲粮中添加0.10%发酵乳酸杆菌(活菌数≥10.2×10¹⁰ CFU/g)，育肥猪(50~90 kg)的平均日增重、平均日采食量分别提高了6.65%和1.47%，料重比降低了4.59%，效果与抗生素(金霉素)相当。Giang等^[14]报道，饲粮中添加复合乳酸菌制剂可提高育肥猪(54~89 kg)生产性能和养分消化率。王俊等^[15]在生长猪(50 kg左右)饲粮中添加10%发酵饲料，经60 d饲喂，试验组猪的料重比显著降低，日增重得到提高。本研究中在育肥猪饲粮中添加0.1%德氏乳杆菌微胶囊制剂(活菌数≥1.01×10⁹ CFU/g)，猪的平均日增重、平均日采食量增加，料重比降低，但差异均不显著。乳酸菌作为肠道有益菌群，其在肠道定植后，可通过调节微生态区系、加固肠道屏障功能、增加小肠绒毛长度和降低隐窝深度，来增强动物肠道的消化吸收功能，促进营养物质的消化吸收，提高动物生产性能^{[10, 16, 17]}。此外，在动物肠道定植的乳酸菌可通过其自身分泌物和刺激肠道免疫来改善和提高动物健康状况^{[18, 19]}。Toba等^[20]报道，德氏乳杆菌在动物肠道定植和产酸能力较强，能产生具有类似抗生素作用的物质(乳酸链球菌素等)，可起到抑制有害菌群的生长，对维护肠道健康具有重要作用。这为解释本研究中试验组腹泻率和发病率极显著或显著降低提供了理论依据。

相关研究表明，乳酸菌及其代谢物可改善和降低猪血脂指标。De Rodas等^[21]给高脂模型猪喂饲2.5×10¹¹ CFU/mL嗜酸乳杆菌，结果发现猪血清TC和TBA含量分别降低了11.8%和23.9%，研究推测嗜酸乳杆菌可能通过调控胆汁酸肠肝脏循环来影响血清TC含量。研究发现，利用嗜酸乳杆菌发酵乳喂猪，56 d后猪血清TC、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)和TG含量均呈现下降趋势^[22]。Liong等^[23]报道，在猪饲粮中添加益生素(含乳酸杆菌)，猪血清TC和LDL-C含量显著降低，而HDL-C含量显著增加。本研究中，整个试验期(42 d)2组猪的血清TG含量呈上升趋势，这可能是由于随体重的增加，猪沉积脂肪的能力增加，使得血清TG含量升高，但德氏乳杆菌组各阶段所测TG含量均较对照组低，说明德氏乳杆菌具有减缓机体脂肪沉积的作用。2组血清TC含量随时间延长均呈下降趋势，可能是由于育肥猪脂肪沉积能力增加，使得机体胆固醇合成原料来源减少，从而出现试验期内血清TC含量下降，而相比对照组，德氏乳杆菌组在各阶段测得的TC含量均较低，说明德氏乳杆菌可降低育肥猪血清TC含量，这与上述研究结果相一致。TBA是由胆固醇在肝脏中代谢而来^{[24, 25]}，试验期，德氏乳杆菌组猪血清TBA含量较对照组低，这在一定程度上反映出机体TC含量相应较对照组低，这与试验中所观察到的血清TC含量变化规律相吻合，说明机体TC含量降低，相应会使胆汁酸合成量减少。血清HDL-C含量可反映机体胆固醇清除能力^[24]，试验中德氏乳杆菌组血清HDL-C含量较对照组高，说明该组胆固醇清除能力加强，清除能力增强有助于降低机体血清TC含量，这与试验中所测血清TC含量较对照组降低相一致。LDL-C是机体运输胆固醇的主要形式，其将肝脏中的TC运输到全身各处组织细胞共其利用，机体LDL-C含量升高一方面说明机体血清TC含量增加，另一方面也可反映机体细胞利用胆固醇的情况^[26]。血液中LDL-C含量的长期过高会引发心血管疾病^[27]，试验中2组的血清LDL-C含量随时间延长呈下降趋势，HDL-C/LDL-C呈上升趋势，说明机体调节胆固醇的能力均正常，且德氏乳杆菌组具有一定的调节能力。

国内外研究已证实，乳酸菌在体外和体内均具有降胆固醇含量功效。在体外乳酸菌通过非代谢和代谢途径来降解胆固醇含量，非代谢途径与乳酸菌对胆固醇的共沉淀作用和吸收作用有关，代谢降解是由于乳酸菌在生长过程中能分泌胆盐水解酶(BSH)等酶系，从而将胆固醇降解成其他物质，导致其含量降低^[28]。Lye等^[29]在体外利用荧光标记技术研究乳酸菌对胆固醇代谢作用，结果发现，培养基中的胆固醇有部分转化为粪烯醇。王俊国等^[30]研究发现，具有胆盐水解酶活性的发酵乳杆菌能增加小鼠粪便中的TC、TBA及短链脂肪酸含量。许女等^[31]研究发现，体外具有降胆固醇作用的植物乳杆菌MA2可增加大鼠粪中的TC和TG的含量。于志会等^[32]在小鼠饲粮中添加植物乳杆菌C88，小鼠粪便中TC和TG质量分数显著提高，说明植物乳杆菌C88可将饲粮中过多的胆固醇排出体外。本试验结果显示，添加0.1%德氏乳杆菌制剂可促进粪中胆固醇和胆汁酸的排泄，这与上述研究结果基本一致。

乳酸菌进驻动物肠道后，可调节肠道对食物中胆固醇及随胆汁进入肠道的胆固醇和胆汁酸的消化吸收，可将一部分胆固醇和胆汁酸转化为粪固醇和粪胆酸排出体外。王俊国等^[30]研究发现，具有胆盐水解酶活性的发酵乳杆菌能降低小鼠肝脏中的TC含量。Higurashi等^[33]将接种有瑞士乳杆菌的奶酪饲喂大鼠后发现大鼠肠系膜的脂肪组织总量减少。徐晶雪等^[34]报道乳酸菌具有降低血清TC含量，抑制肝脏胆固醇堆积的功能。肠道对胆固醇和胆汁酸吸收作用降低相应会使肝脏中胆固醇合成加强，肝脏中合成的胆固醇一部分可以通过血液运输满足外周组织细胞的需求，一部分代谢合成胆汁酸来弥补肠道胆汁酸的损失，剩下部分供肝细胞利用。本研究中，试验组猪肝脏中TC和TBA含量降低可能与德氏乳杆菌的肠道调节作用有关。由肠道吸收和肝脏合成胆固醇经血液运输至全身各组织细胞供其所需，肠道吸收的胆固醇减少，会引起血清中TC含量降低，机体可通过自身细胞合成和利用储备胆固醇来维持机体胆固醇平衡，这样一来相应组织中的TC可能会降低。王巍等^[35]在肉鸡饲料中添加乳酸菌(活菌数为10⁹ CFU/g饲料)，经56 d饲喂，对肌肉中TC含量检测分析发现，添加乳酸菌制剂的试验组胸肌组织和腿肌组织中TC含量降低，而肝脏中TC含量没有显著变化。本试验中，经42 d饲喂，试验组背最长肌和心肌中TC含量有降低，但差异不显著。

饲粮中添加0.1%德氏乳杆菌制剂具有改善育肥猪生产性能和血脂状况，促进粪中胆固醇和胆汁酸的排泄的效应。