自Topps等[1]首次发现反刍动物尿中尿囊素排泄量与瘤胃内容物中核酸浓度间存在正相关关系之后，国外研究人员经过几十年不懈努力，为评估反刍动物十二指肠食糜中微生物蛋白质(MCP)流量提供了一种不伤害动物的间接方法。Chen等[2]提出，应使用尿中嘌呤衍生物(PD)的排出量作为估计值，而不是单独使用尿囊素，特别是在采食量水平较低的情况下。此外，由于尿中PD排出量在不同动物品种间的变异很大[3]，不具通用性，各国的研究成果难以在我国反刍动物营养研究中简单套用，更难以使该成果来指导生产实践。为扩大该方法的使用范围，急需开展各品种反刍动 物的预测模型及相关基础研究[4]。大量研究表 明，尿中PD排出量与动物的干物质(DM)采食量及瘤胃表观可消化有机物(RADOM)采食量间呈正相关关系[5, 6, 7, 8, 9, 10]，而对饲粮瘤胃降解蛋白质(RDP)采食量与PD排出量的关系研究较少。据报道，牛尿中PD排出量与RDP采食量间具有线性相关[11]。关于生长小母牛的试验发现，谷物饲粮中补充RDP可显著增加尿中PD的排出量及瘤胃微生物氮(MN)合成量，但MN转化效率不受影响[12]。其他反刍动物的报道则很少。本试验旨在探讨在以低质粗饲料为基础饲粮的条件下，增加饲粮RDP水平对哈萨克羊育肥羊的氮沉积及尿中PD排出量的影响，以及RDP采食量与MN合成量的关系。
1 材料与方法 1.1 试验设计选取体重(30.0±2.8) kg的哈萨克羊育肥羊公羔3只，代谢笼内单笼饲养，自由饮水。采用3×3拉丁方试验设计，分别饲喂消化能(DE)与总可消化养分(TDN)相同、粗蛋白质(CP)(RDP)水平分别为11%(7.94%)、12%(9.02%)和13%(10.10%)的3种饲粮，均采用全混合日粮(TMR)形式饲喂，分别计作TMR1、TMR2和TMR3。每期15 d，其中预试期10 d，正试期5 d。试验饲粮组成及营养水平见表1。
 | 表1 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) |
试验羊只单笼饲养，第1天每只羊的饲粮供给量按体重的4.3%估计。于每天08:00和20:00等量饲喂2次，自由饮水。预试期每天08:00饲喂前清除前1天饲槽内的余料，称重，准确测定每只羊的采食量。正试期每天收集余料并称重取样，全部收集粪尿。采样时将粪样混匀，准确采集未受羊毛及杂物污染的新鲜粪样200 g，装入塑料袋中置于- 20 ℃冰柜保存；收尿前于桶中加入100 mL 10%的稀硫酸，使尿样pH调整至3.0以下，全收尿并记录尿量，取50 mL尿样置于冻存管中-20 ℃冰柜冷冻保存。每期正试期开始前和结束后羊只均称重并记录。
饲粮、余料、粪样分别在鼓风干燥箱内60 ℃烘干48 h后，空气中回潮24 h后称重，105 ℃烘4 h后测定干物质(DM)含量；饲粮、余料、粪样及尿样中粗蛋白质(CP)含量参照张丽英[14]的方法进行测定；饲粮、余料、粪样中有机物(OM)、中性洗涤纤维(NDF)含量参照张丽英[14]的方法进行测定。
尿中PD(包括尿囊素、尿酸、黄嘌呤和次黄嘌呤)排出量按Chen等[2]的方法进行测定。测定所用主要试剂有尿囊素(Fluka，分析纯)、尿酸(Sigma，纯度≥99%)、黄嘌呤氧化酶(Sigma,19.23 U/mL)、尿酸酶(Sigma,5 U/mg)标准品。
1.3 计算公式 1.3.1 采食量
TDN采食量(%)=OM采食量×
OM表观消化率/100；
RADOM采食量[g/(d·kg BW0.75)]=
DM采食量×饲粮OM含量×OM表观
消化率×0.65；
可发酵有机物(FOM)采食量[g/
(d·kg BW0.75)]=干物质采食量×
饲粮OM含量×OM瘤胃有效
降解率。
式中：3种饲粮OM瘤胃有效降解率为本实验室测定值[15]。
1.3.2 表观消化率
营养物质表观消化率(%)=
100×[营养物质采食量-粪中营养
物质的量]/营养物质采食量。
氮沉积量[g/(d·kg BW0.75)]=
氮采食量-粪氮-尿氮。
所有数据使用SAS 8.0统计软件的PROC ANOVA程序进行方差分析，并用SNK进行多重比较[16]。试验数据用平均值和标准误表示，P<0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 饲粮RDP水平对营养物质采食量和表观消化率影响由表2可见，DM和OM采食量在饲粮之间均无显著性差异(P>0.05)。TDN采食量饲粮间均无显著性差异(P>0.05)。RADOM采食量饲粮间无显著性差异(P>0.05)。饲粮DM、OM和NDF的全消化道表观消化率饲粮间均无显著性差异(P>0.05)。
| 表2 饲粮RDP水平对育肥羊营养物质采食量和表观消化率影响 Table 2 Effects of dietary RDP level on intake and apparent digestibility of nutrients of finishing sheep |
由表3可见，TMR3的氮采食量显著高于TMR1与TMR2(P<0.05)。随饲粮RDP水平的增加，粪氮的排出量不受影响(P>0.05)，尿氮的排出量趋于显著增加(P<0.10)，氮沉积量显著增加(P<0.05)。
| 表3 饲粮RDP水平对育肥羊氮代谢的影响 Table 3 Effects of dietary RDP level on nitrogen metabolism of finishing sheep g/(d·kg BW0.75) |
由表4可见，TMR3的尿中尿囊素排出量显著高于其他2组饲粮(P<0.05)，但尿中尿酸、黄嘌呤+次黄嘌呤的排出量饲粮间无显著性差异(P>0.05)。TMR3尿中PD排出量也显著高于其他2种饲粮(P<0.05)。尿囊素、尿酸、黄嘌呤+次黄嘌呤各自占PD的比例在饲粮间无显著性变化(P>0.05)，非常稳定，平均值分别为91.18%、3.76%和5.06%。PD排出量/DDM采食量、PD排出量/RADOM采食量有随饲粮RDP水平增加而增大，但饲粮间无显著差异(P>0.05)。
| 表4 饲粮RDP水平对育肥羊尿中PD的排出量的影响 Table 4 Effects of dietary RDP level on urinary PD excretion of finishing sheep |
由表5可见，增加饲粮RDP水平可以显著增大小肠吸收嘌呤量及瘤胃MN合成量(P<0.05)，但对MN转化效率各指标均无显著影响(P<0.05)。采食每千克RADOM和FOM对应的MN合成量的平均值分别为27.13和24.32 g/kg。采食每千克TDN和RDP对应的MCP转化效率分别为8.78%和59.69%，低于NRC(2001)[17]推荐的13%和90%，表明氮的转化效率不高，推测与粗饲料为品质较差的小麦秸和棉籽壳有很大关系。但MN合成量/RADOM采食量与RDP采食量(MN/RADOM)之间存在显著的直线相关关系(r=0.999 7,P=0.015 7)；直线回归分析表明，MN/RADOM=0.105 6±0.002 6RDP+16.011 3±0.275 2(R2=0.999 4,P=0.010 9)。
| 表5 饲粮RDP水平对育肥羊瘤胃MN合成量及转化效率的影响 Table 5 Effects of dietary RDP level on yield and conversion efficiency of MN in rumen of finishing sheep |
一般认为，增加饲粮CP水平对于提高DM与OM的表观消化率有正效应。本试验中未观测到DM和OM的表观消化率随饲粮CP(或RDP)水平增加而升高的规律，但TMR3组在数值上高于其他2组，这可能与本试验设计中RDP水平梯度差太小有关。由于饲料原料种类较单一，在保证3种饲粮的能量水平一致和NDF水平接近的条件下，无法使RDP的梯度拉大。增加RDP的采食量显著提高了氮沉积量。NDF表观消化率处理间未观测到显著性差异，表明3种饲粮在瘤胃的微生物发酵处于正常状态。
3.2 DM采食量对尿中PD排出量的影响DM采食量是影响反刍动物尿中PD排出量的重要因素之一。Carro等[6]研究表明体重相近的反刍动物随DM采食量的提高，尿中PD的排出量也会相应的增加。Chen等[7]认为，DM采食量的增加加快了瘤胃排空速率，减少原虫对细菌的吞食和自身分解，提高了微生物离开瘤胃的速度，提高了MCP转化效率，使尿中PD排出量升高。为研究饲粮RDP水平对尿中PD排出量的影响，本试验中基本保证了DM采食量在各期内动物间和饲粮间无显著性差异。 3.3 饲粮RDP水平对尿中PD的排出量的影响
IAEA[3]指出，不同种类反刍动物尿中PD排出量的变异很大，不同种和品种间很难直接比较。Liang等[18]发现本地黄牛和水牛的尿中黄嘌呤+次黄嘌呤排出量占PD排出量的1%~3%，且在相同饲粮条件下，黄牛尿中PD排出量显著高于水牛。这可能与水牛的黄嘌呤氧化酶活性比黄牛高有关。绵羊的血浆和小肠内没有黄嘌呤氧化酶，水牛尿中尿囊素排出量低于黄牛[19]；牦牛尿中PD由尿囊素(86%)和尿酸(14%)组成，且比例不受饲养水平及绝食代谢的影响[20]。东北梅花鹿尿中尿囊素占PD的比例为49%~56%，但尿酸的比例高于黄嘌呤+次黄嘌呤[21]。
东北梅花鹿尿中PD排出量与DDM和RADOM采食量间均存在显著的线性相关，每千克RADOM采食量PD排出量为2.6 mmol，远低于牦牛(13.6 mmol)、黄牛(18.5 mmol)、绵羊(17 mmol)[10]。Pérez等[21]发现尿中PD排出量与RADOM采食量线性相关，每100 g RADOM采食量的PD排出量为1.7 mmol。本试验计算得出的每千克RADOM的PD排出量为19.74~21.61 mmol，与Pérez等[21]的结果比较接近。
据Chen等[7]报道，在正常饲喂条件下，尿囊素大约占PD排出量的75%，而尿酸、黄嘌呤+次黄嘌呤分别占14%和11%，但这3种PD的相对比例不是恒定的。据马涛等[22]报道，饲喂不同精粗比饲粮的杜寒杂交绵羊公羊尿中尿囊素、尿酸、黄嘌呤+次黄嘌呤排出量占PD排出量的比例的变化范围分别为69.92%~84.76%、2.89%~7.58%和9.39%~25.04%。本次试验发现，哈萨克羊尿囊素占PD的比例高达90%以上，远远高出75%的比例。分析原因，可能有以下几个方面：第一，可能是本试验条件下测定的尿酸、黄嘌呤+次黄嘌呤值偏低，导致尿囊素的比例偏高；第二，可能和羊的品种有关，作者尚未见到有关哈萨克羊尿中PD组成成分的相关报道。
3.4 饲粮RDP水平对瘤胃MN合成量及转化效率的影响饲粮RDP提供瘤胃微生物生长的氮源，影响其生长效率和反刍动物尿中PD排出量。Lindberg等[23]发现，生长期反刍动物尿中内源PD排出量主要受CP水平的影响，随CP摄入量升高而增大。犊牛采食含15% CP饲粮的氮贮留和尿中PD排出量显著高于含11% CP饲粮组[24]。但黄鸿威等[25]报道，4~6月龄荷斯坦犊牛的尿中PD排出量虽然也随可消化蛋白质(DCP)的采食量增加而加大，但二者间的相关性较弱。Martín-Orúe等[12]发现，肉牛尿中尿囊素的浓度随饲粮中RDP水平的增加而增加，而尿酸的浓度则下降，该研究指出，谷物基础饲粮中的RDP对于肉牛瘤胃MN的合成来说是不够的，补充RDP可显著提高瘤胃MN的合成量，但不会影响转化效率。本试验也发现，增加RDP采食量可以显著提高PD的排出量及MN的合成量，且RDP采食量与MN合成量/RADOM采食量之间存在显著的正相关，不足之处就是3种饲粮的RDP水平梯度较小，处理间MN转化效率的差异未能达到显著水平。
4 结 论低质粗饲料条件下，将饲粮RDP水平由7.94%提高至10.10%，能够提高哈萨克育肥羊氮沉积量，促进瘤胃MCP的合成，但未能提高MCP的转化效率。
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