镁是动物必需的矿物元素，是体内第4丰富的阳离子，仅次于钠、钾、钙离子，几乎参与了体内绝大多数的能量代谢过程，可催化或激活300多种酶促体系，特别是一系列的ATP酶所必需的辅助因子。对镁的研究以往主要集中于畜禽类，尤其是对反刍动物的研究。成年反刍动物对镁的利用率低，需要量较大，因而容易出现缺镁症状，如青草抽搐症等^{[1, 2, 3, 4, 5, 6]}。目前对于水产动物镁营养的研究还很有限，有研究表明，因海水中富含镁，海水养殖种类如真鲷(Chrysophrys major)一般不会出现缺乏症^[7]。而饲料中缺镁时，淡水鱼如鲤(Cyprinus carpio L.)、虹鳟(Salmo gairdneri)则会出现生长缓慢、肌肉软弱、痉挛惊厥、白内障、骨骼变形、食欲减退、死亡率升高等缺乏症^{[8, 9]}；摄食镁缺乏饲料的虹鳟，其肌肉、幽门垂盲囊和鳃丝还会发生组织学变化，骨骼中的镁含量下降等^[10]。

鱼类对镁需求量的研究已有一些报道^{[8, 9, 11, 12, 13, 14]}，在这方面甲壳动物虾、蟹类的报道还非常有限。早期的研究发现，日本囊对虾(Penaeus japonicas)饲料中添加0.3%的镁时可达到最佳的生长速度^[15]。Cheng^[16]等研究了饲料中添加镁对淡水养殖条件下凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei)生长的影响，发现饲料中镁添加量为2.60～3.46 g/kg时最有利于其生长。目前，镁的添加对蟹类生长性能的影响还未见报道。近年来的一些研究表明，在动物饲粮中额外添加镁，特别是有机镁，能起到抗氧化^[17]、抗应激^[18]等效果。镁对动物抗氧化机能影响的研究主要集中在对鼠类的基础研究方面^{[19, 20, 21]}，在禽类上也有一些这方面的报道^{[22, 23, 24, 25]}，在水产动物方面目前仅见关于添加镁对草鱼抗氧化能力影响的初步报道^[26]，还未见镁对虾、蟹类抗氧化能力影响的相关报道。本试验拟以中华绒螯蟹幼蟹为研究对象，以L-天门冬氨酸镁的形式添加镁，研究饲料中镁的添加量对中华绒螯蟹幼蟹生长性能、体成分及抗氧化能力的影响，以期补充和完善中华绒螯蟹的营养需要资料，同时也可以为其饲料配方的完善提供参考。 1 材料与方法 1.1 试验饲料

以酪蛋白和明胶作为蛋白质源，鱼油和大豆油作为脂肪源配制基础饲料，其组成及营养水平见表1。以L-天门冬氨酸镁(上海源叶生物科技有限公司生产，镁含量8.3%)为镁源，在基础饲料中分别添加0、1.5、3.0、4.5、6.0和7.5 g/kg镁，制成6种试验饲料，试验饲料中对应的镁含量实测值分别为0.98、1.43、3.40、4.79、6.65和7.98 g/kg。各饲料原料经粉碎机粉碎后过80目筛，按逐级放大原则将原料称重后混匀，然后加适量的水混合均匀，用绞肉机加工成直径约2 mm的颗粒，保存于-20 ℃冰箱中备用。 1.2 试验动物与饲养管理

试验用中华绒螯蟹幼蟹购于上海崇明养殖场，取回后先于30 m³水泥池中暂养2周。试验开始时，选出大小相近、平均体重为(2.97±0.01) g的幼蟹，随机分为6个组，每组5个重复，以重复为单位置于80 cm×60 cm×60 cm的水族箱里饲养，每箱投放30只幼蟹。每天投喂试验饲料2次(09:00和16:00)，投喂2 h后吸取粪便和残饵，每天换水1/3左右。养殖期间，保持溶氧浓度6.47~8.89 mg/L，水温24.5~16.0 ℃，氨氮浓度<0.01 mg/L，pH 8.0±0.4。养殖试验持续10周。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % 项目 Items 含量 Content 原料 Ingredients 酪蛋白 Casein 38.0 明胶 Gelatin 9.0 玉米淀粉 Corn starch 25.0 鱼油 Fish oil 3.0 大豆油 Soybean oil 3.0 卵磷脂 Lecithin 1.0 诱食剂 Attractant1) 3.0 胆固醇 Cholesterol 0.5 维生素预混料 Vitamin premix2) 4.0 矿物质预混料 Mineral premix3) 4.0 氯化胆碱 Choline chloride 0.5 纤维素 Cellulose 7.0 羧甲基纤维素钠 CMC-Na 2.0 合计 Total 100.0 营养水平 Nutrient levels 粗蛋白质 Crude protein 41.8 粗脂肪 Crude lipid 8.83 1)诱食剂为每千克饲料提供Attractant provided the following per kg of the diet：甘氨酸 glycine 6 g，丙氨酸 alanine 6 g，谷氨酸 glutamic acid 6 g，甜菜碱 betaine 12 g。 2)每千克维生素预混料含有 Contained the following per kg of vitamin premix:VA 350 000 IU，VD3 450 000 IU，VE 20 g，VK3 7.5 g，VB1 10 g，VB2 10 g，VB6 12 g，VB12 20 mg，烟酰胺 nicotinamide 40 mg，叶酸 folic acid 3 g，泛酸钙 calcium pantothenate 30 g，生物素 biotin 100 mg，VC 60 g,肌醇 inositol 60 g。 3)每千克矿物质预混料含有 Contained the following per kg of mineral premix：NaH2PO4 100 g，KH2PO4 215 g，Ca(H2PO4)2·2H2O 265 g，CaCO3 105 g，乳酸钙 calcium lactate 165 g，AlCl3·2H2O 12 g，ZnSO4·7H2O 5.11 g，柠檬酸亚铁 calcium lactate 0.61 g，MnSO4·4H2O 1.43 g，KI 0.58 g，CuCl2 0.51 g，CoCl2·6H2O 1.76 g，KCl 28 g，Si2O3 100 g。

表1 基础饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

养殖试验结束后，对每个水族箱中的幼蟹分别进行计数、称重，各组生长性能相关指标的计算公式如下：

存活率(survival ratio,SR,%)=[(N₀-N_t)/N₀]×100；
增重率(weight gain rate，WGR，%)=[(W_t-W₀)/W₀]×100；
饲料系数(feed conversion ratio，FCR)=W_F/(W_t-W₀)；
日摄食率(daily feeding rate,DFR，%)=W_F×100/[T×(W_t+W₀)/2]。

式中:N₀为试验开始时的幼蟹数量(只)；N_t为养殖过程中死亡的幼蟹数量(只)；W_t为幼蟹终末均重(g)；W₀为幼蟹初始均重(g)；W_F为试验蟹实际摄食的饲料均重(g)；T为试验周期(d)。

称重后，从每个水族箱中随机选取5只幼蟹用于全蟹体成分测定，剩余的幼蟹置于冰上麻醉后，用1 mL注射器采集血淋巴，然后解剖取肝胰腺，置于-80 ℃保存备用。血淋巴于4 ℃冰箱凝结24 h后，5 000 r/min离心10 min后分离血清，于-80 ℃保存备用。 1.4 指标测定 1.4.1 全蟹常规营养成分测定

参考AOAC(1995)^[27]的标准方法测定全蟹常规营养成分。其中，粗蛋白质含量采用杜马斯燃烧法测定；粗脂肪含量采用索氏抽提法测定，以石油醚为抽提剂；水分含量采用105 ℃烘干至恒重法测定；粗灰分含量采用马福炉灼烧(550 ℃)法测定。 1.4.2 全蟹钙、镁含量测定

全蟹钙、镁含量分别采用《食品中钙的测定》(GB/T 5009.92—2003)和《食品中铁、镁、锰的测定》(GB/T 5009.90—2003)中方法，使用美国珀金埃尔默公司的AA-300型火焰原子吸收仪测定。 1.4.3 肝胰腺和血清中还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量测定

肝胰腺和血清中GSH和MDA含量采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定，操作步骤按照使用说明进行。其中，GSH含量是采用比色定量法进行测定的，其原理是二硫代二硝基苯甲酸与巯基化合物反应时能产生一种黄色化合物，对其比色可得到GSH含量。MDA含量是采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)法进行测定的，其原理是过氧化脂质降解产物中的MDA可与TBA缩合，形成红色产物，在532 nm处有最大吸收峰。 1.5 统计方法

所有数据均采用SPSS 17.0进行处理。试验数据用平均值±标准误(mean±SE)表示，采用单因素方差分析，当组间有显著差异时，用Duncan氏法进行多重比较，差异显著水平为P<0.05。中华绒螯蟹幼蟹饲料中镁的最佳添加量采用SAS 2.1进行二次回归法分析^[28]。 2 结 果 2.1 生长性能

各组中华绒螯蟹幼蟹的增重率、存活率、日摄食率和饲料系数的统计结果见表2。幼蟹增重率随着镁添加量的升高呈先增加后降低的趋势，但各组之间无显著差异(P>0.05)。幼蟹存活率的趋势与增重率相似，其中添加3.0 g/kg镁组的存活率最高。随着饲料中镁添加量的升高，饲料系数先降低后升高，但各组之间无显著差异(P>0.05)。幼蟹的日摄食率在2.82%～3.02%之间，各组间亦无显著差异(P>0.05)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 饲料中镁添加量对中华绒螯蟹幼蟹生长性能的影响 Table 2 Effects of Mg supplementation on growth performance of juvenile Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) (n=5) 镁添加量 Mg supplementation/(g/kg) 初始均重 IABW/g 终末均重 FABW/g 增重率 WGR/% 饲料系数 FCR 日摄食率 DFR/% 存活率 SR/% 0 2.97±0.01 4.95±0.13 66.85±4.53 2.17±0.15 3.02±0.07 77.33±1.94 1.5 2.97±0.01 5.04±0.07 69.99±2.22 2.02±0.07 2.95±0.03 82.00±2.71 3.0 2.97±0.01 5.08±0.06 71.07±2.03 1.89±0.05 2.82±0.03 88.00±2.26 4.5 2.97±0.01 5.01±0.12 68.60±4.16 2.02±0.14 2.90±0.06 80.00±2.98 6.0 2.97±0.01 4.98±0.11 67.89±3.78 2.03±0.26 2.91±0.05 78.00±3.89 7.5 2.97±0.01 4.96±0.16 67.29±5.60 2.11±0.15 2.96±0.08 76.67±1.05 P值 P-value 0.910 0.970 0.970 0.651 0.287 0.051 同列数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。 Values in the same column with different letter superscripts mean significant difference(P<0.05). The same as below.

表2 饲料中镁添加量对中华绒螯蟹幼蟹生长性能的影响 Table 2 Effects of Mg supplementation on growth performance of juvenile Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) (n=5)

由表3可知，各添加镁组的全蟹粗蛋白质含量均高于未添加镁组，但各组之间无显著差异(P>0.05)；全蟹粗脂肪、水分和粗灰分含量各组之间亦无显著差异(P>0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 饲料中镁添加量对中华绒螯蟹幼蟹全蟹常规营养成分的影响(湿重基础) Table 3 Effects of Mg supplementation on common nutrientional components in whole-body of juvenile Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) (wet weight basis,n=5) % 镁添加量 Mg supplementation/(g/kg) 水分 Moisture 粗灰分 Ash 粗蛋白质 Crude protein 粗脂肪 Crude lipid 0 67.39±1.30 17.79±0.99 10.94±0.07 3.61±0.06 1.5 66.65±1.27 17.74±0.83 11.20±0.09 3.67±0.03 3.0 68.88±0.62 16.07±0.54 11.38±0.10 3.50±0.03 4.5 68.91±0.44 16.08±0.57 11.29±0.15 3.52±0.08 6.0 67.74±0.41 17.14±0.54 11.26±0.03 3.65±0.05 7.5 68.77±0.23 16.23±0.61 11.31±0.08 3.48±0.19 P值 P-value 0.328 0.305 0.077 0.530

表3 饲料中镁添加量对中华绒螯蟹幼蟹全蟹常规营养成分的影响(湿重基础) Table 3 Effects of Mg supplementation on common nutrientional components in whole-body of juvenile Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) (wet weight basis,n=5)

由表4可知，随着饲料中镁添加量的升高，全蟹中镁含量也随之升高；钙含量则在未添加镁组有更多的沉积，导致此组的钙镁比也是最高的。然而，上述指标各组之间并未出现显著差异(P>0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 饲料中镁添加量对中华绒螯蟹幼蟹全蟹钙、镁含量及钙镁比的影响(干重基础) Table 4 Effects of Mg supplementation on the contents of Ca and Mg,and Ca/Mg in whole-body of juvenile Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) (dry weight basis,n=5) 镁添加量 Mg supplementation/(g/kg) 镁 Mg/% 钙 Ca/% 钙镁比 Ca/Mg 0 0.30±0.04 21.00±0.58 69.40±1.98 1.5 0.31±0.03 19.33±0.33 62.32±5.08 3.0 0.34±0.03 18.00±1.53 53.80±1.83 4.5 0.38±0.03 18.00±1.00 53.17±3.13 6.0 0.39±0.05 16.33±0.67 42.79±4.80 7.5 0.44±0.05 18.00±2.08 41.99±3.59 P值 P-value 0.525 0.201 0.063

表4 饲料中镁添加量对中华绒螯蟹幼蟹全蟹钙、镁含量及钙镁比的影响(干重基础) Table 4 Effects of Mg supplementation on the contents of Ca and Mg,and Ca/Mg in whole-body of juvenile Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) (dry weight basis,n=5)

各组中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺、血清中GSH和MDA含量的统计结果见表5。肝胰腺和血清中GSH含量呈现相同的趋势，均随着饲料中镁添加量的升高先升高后降低，并在添加3.0 g/kg镁组达到最大值，且其肝胰腺中GSH含量显著高于添加7.5 g/kg镁组(P<0.05)，血清中GSH含量显著高于未添加镁组(P<0.05)。肝胰腺和血清中MDA含量呈现的趋势也是一致的，即随着饲料中镁添加量的升高先降低再升高，其中添加3.0 g/kg镁组显著低于其他各组(P<0.05)。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 饲料中镁添加量对中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺和血清中GSH及MDA含量的影响 Table 5 Effects of Mg supplementation on the contents of GSH and MDA in serum and hepatopancreas of juvenile Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) (n=5) 镁添加量 Mg supplementation/(g/kg) 肝胰腺GSH Hepatopancreas GSH/ (mg/g prot) 血清GSH Serum GSH/ (nmol/L) 肝胰腺MDA Hepatopancreas GSH/ (nmol/mg prot) 血清MDA Serum MDA/ (nmol/mL) 0 618.19±16.35ab 116.53±14.45a 9.58±0.09e 13.77±0.90d 1.5 623.51±26.90ab 138.78±23.86ab 4.02±0.32c 11.87±0.36c 3.0 753.65±69.45b 178.29±2.64b 2.21±0.04a 5.88±0.45a 4.5 770.92±27.38b 165.34±17.45ab 3.10±0.10b 8.02±0.39b 6.0 692.23±57.79ab 139.77±12.63ab 4.22±0.09c 10.38±0.69c 7.5 576.03±87.66a 135.46±24.91ab 5.09±0.16d 11.99±0.04c P值 P-value 0.001 0.021 0.001 0.001

表5 饲料中镁添加量对中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺和血清中GSH及MDA含量的影响 Table 5 Effects of Mg supplementation on the contents of GSH and MDA in serum and hepatopancreas of juvenile Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) (n=5)

以肝胰腺中GSH含量为判据，采用二次回归模型进行拟合发现，当饲料中镁添加量为3.76 g/kg (饲料中镁含量为4.39 g/kg)时，中华绒螯蟹幼蟹的抗氧化能力最佳(图1)。

图1

Fig. 1

图1 肝胰腺中GSH含量与镁添加量的关系 Fig. 1 The relationship between hepatopancreas GSH content and Mg supplementation

镁是甲壳动物蜕皮所必需的矿物质元素，有研究表明，仅从水中吸收的镁不足以维持水产动物的正常生长，饲料中缺少镁会使得虹鳟^[8]、孔雀鱼^[11]等水产动物生长缓慢、活动呆滞，严重时还会导致死亡率升高。本试验中，未添加镁组虽没有表现出明显的镁缺乏症，但与添加镁组相比，中华绒螯蟹幼蟹的生长仍受到了一定的影响，且其存活率要低于添加镁组。已有的对甲壳动物研究的报道显示，在日本囊对虾饲料中添加0.3%的镁时，个体增重率最高，达到最佳的生长状态^[15]。以增重率为判据进行多项式回归分析发现，淡化养殖条件下，饲料中添加镁2.60～3.46 g/kg时最有利于凡纳滨对虾的快速生长^[16]。根据中华绒螯蟹的生长特点和生物学特性，随着幼蟹的生长和试验后期气温的逐渐下降，该阶段的幼蟹蜕皮频率有所降低，从而影响了蟹体的增重率。根据本实验室多年的实践经验，适当延长饲养周期有助于减少温度和蜕皮频率下降对幼蟹生长性能的影响，并取得较为客观的实际生长率^[29]。本试验各 组间的增重率虽无显著差异，但是当镁添加量为3.0 g/kg时幼蟹获得了最大的增重率，与有关凡纳滨对虾镁需求量的研究结果^[16]相一致。

本试验以L-天门冬氨酸镁为镁源，试验结束时，各添加镁组中华绒螯蟹幼蟹全蟹的粗蛋白质含量普遍高于未添加镁组。镁对甲壳动物体蛋白质等成分影响的研究暂未见报道，迄今仅见Wang等^[26]对草鱼的研究发现，饲料中添加镁可以促进蛋白质在草鱼体内的沉积。有关镁促进机体蛋白质沉积的作用机理，Vormann^[30]认为镁参与了蛋白质综合体的形成，进而促进了机体蛋白质的合成和沉积。

孔雀鱼^[11]、斑点叉尾 ^[12]、虹鳟^[8]、大西洋鲑^[13]、鲤^[9]等饲料中镁添加量不足时，会导致组织钙含量显著升高，甚至发生组织钙化，本试验得到的结果与以上报道相似。镁是钙的天然拮抗剂，镁可竞争性抑制钙离子(Ca²⁺)通道，阻止大量Ca²⁺进入细胞膜；同时镁可以增加细胞膜Ca²⁺泵的活性，增加Ca²⁺排出。当饲料中缺镁时，则Ca²⁺将会大量进入并沉积在机体的细胞内^[31]。本试验中，未添加镁组中华绒螯蟹幼蟹全蟹钙含量是最高的，推测是饲料中镁缺乏时，Ca²⁺大量进入细胞内并沉积，结果提示长时间缺乏镁将会导致机体组织的钙化。

MDA是自由基攻击机体生物膜上的多不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化而产生的脂质过氧化物^[32]。本研究发现，饲料中添加适量的镁可以显著提高中华绒螯蟹肝胰腺和血清中GSH含量，同时显著降低MDA含量，提示饲料中添加适量的镁可以增强机体抗氧化能力。从已有的研究来看，镁的抗氧化作用主要是通过促进GSH的合成来实现的。GSH通过与谷胱甘肽氧化还原酶系共同抑制脂质过氧化的发生，阻断新自由基的产生，间接地清除了体内的自由基；同时，GSH也可以直接清除自由基，GSH作为谷胱甘肽过氧化物酶的底物，可从H₂O₂处接受电子，发生自身氧化，从而阻断 羟自由基(·OH)生成^[33]。本试验测得的GSH含量变化趋势恰好与MDA相反，随着镁添加量的升高先增加后降低，进一步验证了镁的适量添加可以在一定程度上增加GSH含量，抑制脂质过氧化作用的发生。有学者认为，镁是GSH合成及生物合成所需ATP的辅助因子，因此镁的缺乏抑制了GSH的合成^[34]。也有学者认为，GSH的合成需要2种酶：谷氨酰半胱氨酸合酶和谷胱甘肽合酶，而镁是这2种酶的辅酶，因此，镁的添加会影响到GSH的合成，进而影响机体抗氧化性能的发挥^[35]。细胞内GSH的含量对维持细胞抵抗氧化损伤的能力起着重要的作用，GSH含量的降低意味着机体内氧化程度加重，因此GSH含量的多少是衡量生物体抗氧化能力大小的重要因素^[36]。本试验结果显示，当镁添加量为3.76 g/kg时，中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺中GSH含量最高，此时幼蟹的抗氧化能力最佳。Wang等^[26]研究得出，在饲料中添加适量的镁可以提高草鱼的抗氧化能力，减少MDA含量，支持了本试验所得的结果。 4 结 论

以L-天门冬氨酸镁为镁源，当镁的添加量为3.0～4.5 g/kg时，中华绒螯蟹幼蟹获得了较好的生长效果；以肝胰腺GSH含量为判据，采用二次回归模型进行拟合发现，当饲料镁添加量为3.76 g/kg(饲料中镁含量为4.39 g/kg)时，中华绒螯蟹幼蟹可获得最强的抗氧化能力。