2. 四川通威饲料股份有限公司科研中心, 成都 610041
2. Aqua-Feed Research and Development Center, Sichuan Tongwei Feed Industry Co., Ltd., Chengdu 610041, China
缬氨酸(Val)属于支链氨基酸之一，最先是从动物胰脏的浸提液中分离出来的，1906年Fisher分析出其化学结构为α-氨基异戊酸。缬氨酸在生物体的正常生命活动中，尤其是神经系统的正常运转中起重要作用，缬氨酸的缺乏会导致哺乳动物神经功能的衰退。缬氨酸是对母猪泌乳性能尤为重要的一种支链氨基酸，在母猪饲粮中添加缬氨酸可以提高母猪的免疫能力[1, 2]；在大白鼠上的研究发现，支链氨基酸能够显著提高谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活力[3, 4]。此外，饲料中添加缬氨酸可以一定程度提高草鱼(Ctenopharyngodon idellus)[5]、印度野鲮(Labeo udaipurensis)[6]、异育银鲫(Carassius auratus gibelio)[7]等动物的生长性能。
缬氨酸是大部分水生动物的必需氨基酸之一[8, 9, 10, 11, 12]。目前，对水生动物缬氨酸需要量的研究较少，并且不同的评价指标和试验条件导致结果差异较大[8]。在甲壳类动物上，关于缬氨酸需要量的研究仅见于日本对虾(Penaeus japonicus)和斑节对虾(Penaeus monodon)，其结果分别为2.8%[13]和3.4%[11](占饲料蛋白质的百分比)。
目前，凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)幼虾的赖氨酸[14]、精氨酸[15]和苏氨酸[16]需要量已研究确定，其缬氨酸需要量则尚未见报道。因此，本试验拟在以往研究[14, 15, 16]的基础上，进一步探讨凡纳滨对虾幼虾对饲料中缬氨酸的需要量，以期完成凡纳滨对虾幼虾对10种必需氨基酸需要量的数据库，并为其高效环保饲料的开发和利用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计和饲料的制备试验饲料以鱼粉和豆粕为主要蛋白质源，根 据凡纳滨对虾全虾的氨基酸组成比例[17, 18]，在饲料中添加晶体氨基酸以满足凡纳滨对虾幼虾除缬氨酸外其他必需氨基酸的需要。饲料中缬氨酸的添加水平分别为0、0.08%、0.16%、0.24%、0.32%、0.40%，各组饲料实测缬氨酸含量(干物质基础)分别为1.56%、1.64%、1.72%、1.82%、1.90%、1.96%。试验饲料组成及营养水平见表1，其氨基酸组成见表2。
 | 表1 试验饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) |
| 表2 试验饲料的氨基酸组成(干物质基础) Table 2 Amino acid composition of experimental diets (DM basis) |
按照表1配方，各种原料粉碎过80目筛，然后准确称量，氨基酸以及微量添加成分采取逐级扩大法混合均匀，再添加油和卵磷脂以及30%左右 的水，混匀，用双螺杆挤压机(华南理工大学机械 工程研究所制造)压制成粒径为1.0和1.5 mm的颗粒饲料。自然风干至水分含量约10%，然后分组装入封口袋后在-20 ℃冷冻保存备用。
1.2 试验管理
饲养试验在广东恒兴集团国家863计划海水养殖种子工程南方基地的营养车间进行，试验所用的凡纳滨对虾幼虾购自广东恒兴集团虾苗厂。试验虾选用当年人工孵化的同一批虾苗。正式试验前，试验虾一直暂养于500 L玻璃钢桶中，并以虾片和商业饲料饱食投喂。选择体重在0.3 g左右的凡纳滨对虾幼虾540尾为试验对象，随机分为6组，每组(饲料)3个重复，每个重复(养殖桶)30尾。每天投喂4次，日投喂量为其体重的8%~10%，投喂时间分别为07:00、12:00、17:00以及21:00，早、晚投喂量为总投喂量的60%，投喂1 h后观察其摄食情况，以调整其投喂量。前期每隔2 d换水1次，中、后期每天换水1次。试验用水采用砂滤的天然海水，试验期间不间断充气，试验水温为26~31 ℃，pH为7.6~7.8，盐度为29~31 mg/L，养殖试验持续8周。
1.3 样品采集试验结束后饥饿24 h，称重并记录存活尾数。每桶随机取5~7尾虾，保存于-20 ℃冰箱，用于全虾常规营养组成分析。每桶另随机取10尾虾，于第4步足基部血窦取血，置于1.5 mL离心管中于4 ℃冰箱放置过夜后，5 000 r/min离心10 min，取血清置于-80 ℃冰箱备用，用以测定血清中天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)以及碱性磷酸酶(AKP)活力。取血后的对虾分别从头胸甲处及尾部剥离肝胰腺以及肌肉，保存于-20 ℃冰箱，以分析肝胰腺中酶活力及肌肉中酶活力和常规营养组成。
1.4 计算公式及分析方法增重率(weight gain ratio,WGR，%)=100×(终末体重－初始体重)/初始体重；
特定生长率(specific growth rate,SGR，%/d)=100×(ln终末体重-ln初始体重)/试验天数；
成活率(survival rate,SR，%)=100×试验结束时存活虾尾数/试验开始时投放虾尾数；
蛋白质沉积率(protein retention rate，PRR,%)=100×(终末体重×终末虾粗蛋白质含量-初始体重×初始虾粗蛋白质含量)/(饲料摄取量×饲料粗蛋白质含量)；
饲料效率(feed efficiency,FE)=(终末虾总重+死虾总重-初始虾总重)/(投饲总量×饲料干物质含量)；
饲料干物质溶失率(%)=100×(饲料干重-饲料浸泡后干重)/饲料干重；
缬氨酸溶失率(%)=100×[浸泡前缬氨酸含量-浸泡后缬氨酸含量×(1-饲料干物质溶失率/100)]/浸泡前缬氨酸含量。
试验样品的水分、粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量按照AOAC(1984)方法测定。将样品在105 ℃下烘至恒重测定水分含量；采用凯氏定氮法(总氮×6.25)测定粗蛋白质含量；采用索氏提取法(以石油醚为提取液)测定粗脂肪含量；采用550 ℃马福炉灼烧法测定粗灰分含量。饲料的氨基酸组成采用盐酸水解法测定，具体操作为：取干燥样品50 mg，加6 mol/L的盐酸约5 mL，真空封管，在110 ℃烘箱内水解24 h后过滤，定容至50 mL。氨基酸分析仪(日立L-8800)分析条件：1)进样量20 μL；2)泵1流速0.4 mL/min，压力10.5 MPa；3)泵2流速0.35 mL/min，压力0.8 MPa；4)分离柱温度50 ℃；5)反应柱温度136 ℃。
根据生长性能测定结果，选择缬氨酸含量为1.82%的饲料进行缬氨酸溶失率的测定[15, 16]。缬氨酸溶失率的测定参照Cruz-Suarez等[19]的方法，具体为：称取5 g饲料样品置于盛有1 000 mL养殖试验海水的烧杯中，分别浸泡30、60和90 min后取出烘干称重，粉碎后测定缬氨酸含量。
血清、肝胰腺及肌肉中酶活力采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行测定。
1.5 数据统计分析采用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析，先对数据作单因素方差分析(one-way ANOVA)，统计间若有显著差异，再进行Duncan氏法多重比较，以P<0.05表示差异显著。
2 结 果 2.1 饲料中缬氨酸含量对凡纳滨对虾幼虾生长性能的影响饲料样品在养殖试验海水中浸泡30、60和90 min后的缬氨酸含量和溶失率见表3，其溶失率分别为16.81%、18.76%和21.30%。
| 表3 饲料在海水中浸泡不同时间后的缬氨酸溶失率(干物质基础) Table 3 Val dissolve-loss rate of diet immersed in seawater with different time (DM basis) |
由表4可知，随着饲料缬氨酸含量的增加，增重率和特定生长率先随之升高，并均在缬氨酸含量为1.82%时达到最大，但随着饲料缬氨酸含量的进一步增加，增重率和特定生长率出现不同程度下降。以增重率为判据，根据折线模型得出凡纳滨对虾幼虾的缬氨酸需要量为占饲料干物质的1.79%(占饲料蛋白质的4.48%，图1)。蛋白质沉积率和饲料效率随着饲料中缬氨酸含量的增加先升高后降低，均在缬氨酸含量为1.82%时达到最大，且饲料效率显著高于缬氨酸含量为1.56%、1.64%和1.96%时(P<0.05)，蛋白质沉积率显著高于缬氨酸含量为1.56%时(P<0.05)。凡纳滨对虾幼虾的成活率不受饲料中缬氨酸含量的显著影响(P>0.05)。
| 表4 饲料中缬氨酸含量对凡纳滨对虾生长性能的影响(平均值±标准差) Table 4 Effects of dietary Val content on growth performance of juvenile Pacific white shrimp,Litopenaeus vanname (mean±SD,n=3) |
 | 图1 饲料中缬氨酸含量与凡纳滨对虾幼虾增重率的关系 Fig. 1 Relationship between dietary Val content and WGR of juvenile Pacific white shrimp,Litopenaeus vannamei |
2.2 饲料中缬氨酸含量对凡纳滨对虾幼虾全虾和肌肉常规营养组成的影响
由表5可知，全虾中粗蛋白质含量在缬氨酸含量为1.72%时达到最高，进一步提高饲料中缬氨酸含量则有不同程度的降低；肌肉中粗蛋白质含量在缬氨酸含量为1.96%时达到最高，显著高于缬氨酸含量为1.56%和1.72%时(P<0.05)；饲料中缬氨酸含量对全虾和肌肉中水分、粗脂肪和粗灰分含量的影响均不显著(P>0.05)。
| 表5 饲料中缬氨酸含量对凡纳滨对虾幼虾全虾和肌肉常规营养组成的影响(平均值±标准差) Table 5 Effects of dietary Val content on common nutrient composition in whole body and muscle of juvenile Pacific white shrimp,Litopenaeus vannamei (mean±SD,n=3) |
由表6可知，血清中最高ALT活力出现在缬氨酸含量最高组(缬氨酸含量为1.96%的组)，与缬氨酸含量为1.82%的组差异不显著(P>0.05)，但二者均显著高于缬氨酸含量为1.64%的组(P<0.05)，其余各组间没有显著差异(P>0.05)；血清中AST活力在缬氨酸含量为1.72%的组达到最高，并且显著高于缬氨酸含量为1.90%的组(P<0.05)，其余各组间没有显著差异(P>0.05)。
| 表6 饲料中缬氨酸含量对凡纳滨对虾幼虾血清和组织中酶活力的影响(平均值±标准差) Table 6 Effects of dietary Val content on enzyme activities in serum and tissues of juvenile Pacific white shrimp,Litopenaeus vannamei (mean±SD,n=3) |
肝胰腺中最高ALT活力也出现在缬氨酸含量最高组，并显著高于缬氨酸含量为1.56%、1.64%和1.72%的组(P<0.05)，其余各组间没有显著差异(P>0.05)；饲料中缬氨酸含量对肝胰腺中AST活力未产生显著影响(P>0.05)；肝胰脏AKP活力随着饲料中缬氨酸含量的增加先升高后降低，在缬氨酸含量为1.82%~1.96%时显著高于缬氨酸含量为1.56%~1.64%时(P<0.05)。
肌肉中ALT活力表现为缬氨酸含量为1.56%、1.64%、1.72%的组显著高于缬氨酸含量为1.82%、1.90%、1.96%的组(P<0.05)，其余各组间没有显著差异(P>0.05)；肌肉中AST活力在缬氨酸含量为1.96%的组达到最高值，并显著高于其余各组(P<0.05)，其次是缬氨酸含量为1.90%的 组，显著高于缬氨酸含量为1.72%、1.82%的组 (P<0.05)，其余各组间无显著差异(P>0.05)。
3 讨 论
由试验结果可知，经过8周的养殖试验，没有额外添加缬氨酸的对照组各项生长指标均低于饲料中额外添加缬氨酸的各组，最佳的生长性能和饲料利用出现在缬氨酸含量为1.82%的组，以增重率为指标，凡纳滨对虾幼虾对饲料中缬氨酸的需要量为占饲料干物质的1.79%(占饲料蛋白质的4.33%)。这一结果(以占饲料蛋白质的百分比表示)高于以增重率为判定指标的斑节对虾(3.4%)[11]、日本对虾(2.8%)[13]所得结果，与以特定生长率为判定指标的异育银鲫(4.53%)[7]所得结果相近，高于以生长性能为判定指标的斑点叉尾鮰(3.0%)[20]、鲤鱼(3.6%)[21]、湖鳟(1.8%～2.2%)[10]、白鲟(3.3%)[22]所得结果，高于以饲料效率和蛋白质沉积率为判定指标的麦瑞加拉鲮鱼(3.8%)[6]、南亚野鲮(3.75%)[23]所得结果，高于以增重率为判定指标的尼罗罗非鱼(2.8%)[24]、虹鳟(1.7%～3.4%)[25]所得结果，低于以特定生长率和饲料效率为判定指标的大黄鱼(4.84%)[26]和鲈鱼(5.02%)[26]所得结果，低于以增重率、特定生长率和肌肉RNA/DNA为判定指标的草鱼(4.88%)[5]所得结果。综合上述水生动物缬氨酸需要量的研究结果可知，不同水生动物对缬氨酸的需要量不同，这种差异可能与试验动物种类、饲料的组成及适口性、试验动物的大小、投喂次数及水平、试验条件等因素的差异有关[25, 27]。在本试验中，饲料中缬氨酸含量从1.56%增加到1.82%时，凡纳滨对虾的增重率、特定生长率和蛋白质沉积率均显著升高。此外，有研究表明，半精制饲料或是实用饲料中氨基酸的组成比例，以及试验动物需求一致性和试验动物对饲料中氨基酸的消化率不同也会影响试验动物对氨基酸的需要量[28]。
Millamena等[11]用纯合饲料研究了斑节对虾幼虾对缬氨酸的需要量为占饲料干物质的1.35%(占饲料蛋白质的3.40%)，而Teshima等[13]用理想氨基酸模式得出日本对虾对缬氨酸的需要量为占饲料干物质的1.4%(占饲料蛋白质的2.8%)，都低于本试验得出的结果，这归因于不同种类对虾对缬氨酸的需要量不同。结果的差异也可能是由试验用基础饲料的蛋白质源以及蛋白质水平不同所引起。本试验采用鱼粉和豆粕为主要蛋白质源，而斑节对虾试验中采用酪蛋白和明胶为主要蛋白质源，适口性和氨基酸比例的不平衡可能是引起生长性能差异的主要原因。此外，试验用虾的规格和发育阶段、饲养管理和其他养殖条件也可能影响试验结果[27]。
从本试验结果可以看出，饲料中适宜含量的缬氨酸可提高凡纳滨对虾幼虾的生长性能和饲料效率，这一结果与在斑节对虾[11]、异育银鲫[7]、草鱼[5]、鲈鱼[29]以及建鲤[12, 30]上所得结果类似。饲料中缬氨酸含量超过1.82%后凡纳滨对虾幼虾的生长性能出现降低，可能是由于过量的缬氨酸会对生物体产生毒性和引起应激反应，导致耗费更多的能量用于脱氨基作用[31, 32]。有研究表明，饲料中过量的组氨酸会引起对虾肝胰腺的坏死[33, 34]，在本试验中，饲喂高缬氨酸含量饲料后，除影响凡纳滨对虾幼虾的生长性能外，没有发现相应的病理症。此外，在本试验中，凡纳滨对虾幼虾的成活率不受饲料缬氨酸含量的显著影响，这个结果与斑节对虾[11]和日本对虾[13]的研究结果类似。
本试验中，凡纳滨对虾幼虾全虾中粗蛋白质含量在缬氨酸含量为1.72%时达到最高，继续提高缬氨酸含量全虾中粗蛋白质含量没有随之提高，这一结果和麦瑞拉加鲑鱼[6]和建鲤[12]的研究结果相似。肌肉中粗蛋白质含量的最高值出现在缬氨酸含量为1.96%时，说明缬氨酸可以提高肌肉中蛋白质的沉积，这一结果与在草鱼[5]上的研究结果一致。然而，有研究者对异育银鲫[7]和鲈鱼[26]缬氨酸需要量的研究表明，饲料中缬氨酸含量对其体组成没有显著影响，造成这种差异的原因可能与试验动物的品种、规格以及营养素、环境因子有关。
ALT和AST是机体最重要的2种转氨酶，广泛分布于机体的各组织器官，通常存在于细胞膜、细胞质和线粒体中，这2种酶在机体蛋白质和氨基酸代谢中起重要作用，其活力与氨基酸代谢强弱有关[7]。肝脏是生物体进行各项生命活动的酶活反应场所，故ALT和AST在肝脏中活力较高。在本试验中，血清、肝胰腺和肌肉中ALT活力和血清和肌肉中AST活力受饲料中缬氨酸含量的影响显著，而肝胰腺中的AST活力不受饲料中缬氨酸含量的显著影响，且低缬氨酸含量组对虾的血清和肌肉中ALT和AST活力较低。此试验结果表明饲料中氨基酸的含量越高，机体氨基酸分解代谢就越旺盛，过高或过低的缬氨酸含量都会导致氨基酸不平衡,氨基酸的分解需要消耗能量,从而降低了蛋白质和饲料的利用率,导致生长受到抑制，这和本试验的生长性能结果是一致的，而在草鱼[5]的研究中也得出相似的结果。同时，成活率和肝胰腺损害没有直接关系，这一结果和斑节对虾[35]以及低盐度下凡纳滨对虾[36]的研究结果一致。
AKP是动物体内一种重要的解毒体系[37]，在甲壳动物体内，AKP还与动物对海水中钙质吸取、磷酸钙沉积、甲壳素分泌及形成直接相关[38]。本试验中，饲料中缬氨酸含量显著影响了凡纳滨对虾肝胰腺中AKP的活力，在缬氨酸含量为1.90%时达到最大值。这说明饲料中适宜含量的缬氨酸可以激活凡纳滨对虾肝胰腺中的AKP，有利于水解焦磷酸，以清除其对钙化作用的抑制，同时增加磷酸根(PO3-4)的浓度，有利于骨母组织钙化[39]。
由于晶体氨基酸在水中存在溶失问题[40]，因此本试验对饲料溶失率进行了测定。其结果与精氨酸[15]和苏氨酸的溶失率测定结果[16]较为相似。本试验在缬氨酸需要量的确定中，核减了缬氨酸在海水中浸泡30 min的溶失部分[15, 16]，得到凡纳滨对虾幼虾对缬氨酸的实际需要量为占饲料干物质的1.53%(占饲料蛋白质的3.83%)。因此，在生产实践中，若涉及晶体氨基酸的添加量时，应考虑到溶失率问题，以免造成氨基酸摄入不足，影响生长。
4 结 论以增重率为指标，通过折线回归模型得到凡纳滨对虾幼虾的缬氨酸需要量为占饲料干重的1.79%(占饲料蛋白质的4.48%)，考虑到晶体氨基酸在海水中的溶失，以缬氨酸在海水中浸泡30 min内溶失率为16.81%计，核定凡纳滨对虾幼虾实际的缬氨酸需要量为占饲料干重的1.53%(占饲料蛋白质的3.83%)。
致谢：感谢宁波大学海洋学院鱼类营养实验室全体成员对本试验提供的支持和帮助，感谢恒兴集团863海水养殖种子基地提供试验场所和养殖系统使试验得以顺利进行。
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