在家禽代谢能值的测定中，饲料原料间测值的可加性是检验测定方法是否成立的基本原则之一^[1]。近年来，动物营养学国家重点实验室在基于单胃动物仿生消化系统(SDS-1)和模拟消化液测定饲料有效能值的方法学研究上，已对测试结果的重演性、影响因素进行了一系列研究^{[2, 3, 4]}。在此基础上，进一步检验该方法系统的可加性，是确立仿生消化法能否用于估测饲料能量生物学效价的决策依据之一。目前，在生物学试验中，测定方法的可加性检验一般采用配对或两样本t检验的统计方法对组合后样品中待测物浓度(剂量)的实测值与计算值进行显著性检验^{[5, 6, 7]}。近年来，在医学上采用SAS的ANCOV分析2个或多个因素间所引起的生物学效应是否具有可加性^[8]。该方法的思路是通过分析因素组合后生物学效应的实测值与根据单一因素的效应与因素间组合的比例获得的计算值之间的回归直线与y(实测值)=x(计算值)是否有显著性差异来判别其是否具有可加性。本试验中，仿生消化法的测试结果及数据变异的可加性也适合用SAS REG模块的TEST选项分析计算值对实测值的线性回归来判别。因此，本试验采用该统计方法，通过分析仿生消化法测试数据的平均值、方差、变异系数的可加性，为仿生消化法能否用于饲料酶水解物能值(enzyme hydrolysate gross energy,EHGE)的测定提供科学依据。

选用玉米、大豆粕、棉籽粕、小麦麸4种常用饲料原料。采用四分法取样后用万能粉碎机粉碎并过40目筛。充分混合均匀，贮存于样品瓶中-20 ℃保存备用。饲料原料及其营养成分见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 饲料原料及其营养成分(干物质基础) Table 1 Feedstuffs and their nutrient contents (DM basis) % 饲料原料Feedstuffs 营养成分 Nutrient contents 干物质 Dry matter 粗蛋白质 Crude protein 粗纤维 Crude fiber 粗脂肪 Ether extract 粗灰分 Ash 总能 Gross energy/(MJ/kg) 玉米 Corn 86.93 8.50 2.30 2.99 1.61 18.49 大豆粕 Soybean meal 89.41 48.82 5.96 3.04 6.77 19.75 棉籽粕 Cottonseed meal 88.57 41.38 21.51 0.89 6.60 19.35 小麦麸 Wheat bran 89.90 20.40 8.71 4.39 6.47 19.24 营养成分为实测值。Nutrient contents are determined values.

表1 饲料原料及其营养成分(干物质基础) Table 1 Feedstuffs and their nutrient contents (DM basis)

采用单因素完全随机设计，共12个处理(表2)，其中处理1~4分别为4种单一饲料原料饲粮，处理5~12为2种或2种以上的饲料原料按不同比例组合制备的8种饲粮。每个处理5个重复，每个重复1根消化管。在仿生消化系统中以鸭模拟消化液及流程分别测定各处理的干物质消化率(dry matter digestibility,DMD)和EHGE。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 试验饲粮组成 Table 2 Composition of experimental diets 项目Items 含量(风干基础)Content (air-dry basis)/% 含量(干物质基础) Content (DM basis)/% 玉米 Corn 大豆粕 Soybean meal 棉籽粕 Cottonseed meal 小麦麸 Wheat bran 玉米 Corn 大豆粕 Soybean meal 棉籽粕 Cottonseed meal 小麦麸 Wheat bran 处理1 Treatment 1 100 100.00 处理2 Treatment 2 100 100.00 处理3 Treatment 3 100 100.00 处理4 Treatment 4 100 100.00 处理 5 Treatment 5 80 20 78.99 21.01 处理6 Treatment 6 60 40 58.50 41.50 处理7 Treatment 7 80 20 79.42 20.58 处理8 Treatment 8 60 40 59.14 40.86 处理9 Treatment 9 80 20 79.17 20.83 处理10 Treatment 10 60 30 10 58.57 31.16 10.27 处理11 Treatment 11 60 20 20 58.82 20.86 20.32 处理12 Treatment 12 60 20 10 10 58.73 20.83 10.14 10.30

表2 试验饲粮组成 Table 2 Composition of experimental diets

鸭的仿生消化过程参照赵峰等^[9]关于SDS-1测定鸭饲料EHGE的操作过程进行。透析袋的型号与前处理、胃缓冲液、小肠前段缓冲液、小肠后段缓冲液按照《鸭饲料酶水解物能值测定技术规程》^[10]进行制备。模拟消化液的制备如下：

模拟鸭胃液：称取387.5 kU的胃蛋白酶(Sigma，P7000)溶解于250 mL pH 2.0的盐酸溶液中(42 ℃下标定pH)，缓慢搅拌直至溶解。临用前配制。

模拟鸭小肠液：称(量)取淀粉酶(Sigma，A3306)110.43 kU，胰蛋白酶(Amersco，0785)29.92 kU，糜蛋白酶(Amersco,0164)10.73 kU溶解于25 mL去离子水中，并缓慢搅拌直至溶解。临用前配制。

SDS-1模拟鸭消化过程的主要步骤列于表3。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 鸭体外仿生消化操作过程 Table 3 Procedure of in vitro simulated digestion for ducks 时间 Time/h 操作 Operation 手动/自动 Manual/automatical 0 上样：玉米的上样量为2 g(风干基础)，大豆粕、棉籽粕和小麦麸的上样量为1 g(风干基础)，精确到0.000 2 g 手动 将消化管固定在SDS-1的消化平台上，连接好管道。在SDS-1控制软件中选择鸭的仿生消化程序后，在主界面点击开始消化 手动 开始胃阶段的消化 自动 4 胃消化停止，胃缓冲液排出 自动 去离子水清洗3次，每次清洗泵入1 500 mL去离子水，每次清洗循环40 min后排出清洗液 自动 6 小肠前段缓冲液泵入消化管，循环30 min 自动 6.5 注入模拟小肠液，在SDS-1控制软件，点击继续消化小肠前段缓冲液继续循环，开始小肠前段模拟消化 手动自动 14 小肠前段模拟消化结束，缓冲液排出。小肠后段缓冲液注入，开始小肠后段模拟消化 自动 21.5 小肠后段模拟消化结束，缓冲液排出 自动 去离子水清洗6次，每次清洗泵入1 500 mL去离子水，每次清洗循环40 min后排出清洗液 自动 25.5 消化产物清洗结束 自动 未消化残渣Undigested residues 转移至已知绝干重量的90 mm培养皿中，65 ℃下烘干至无水痕后105 ℃烘干至恒重 手动

表3 鸭体外仿生消化操作过程 Table 3 Procedure of in vitro simulated digestion for ducks

按GB/T 6435—2006^[11]测定水分并计算其干物质含量，并根据ISO 9831 ∶ 1998^[12]的规定测定待测饲料和未水解残渣的总能。

酶空白对照值参照严峰等^[13]的数据进行计算，其中干物质的残留量为0.044 5 g/样，能量残留量为442 J/样。

根据单因素完全随机设计，以SAS 9.0^[14]的MEANS模块对基本统计量进行分析。通过TTEST模块的Paired选项对饲粮DMD、EHGE及其方差和变异系数的实测值与计算值间的差异进行配对t检验。以REG模块通过TEST选项分析饲粮DMD、EHGE及其方差和变异系数计算值对实测值的回归斜率与截距分别与1和0的显著性差异来判断实测值与计算值是否相等而检验是否具有可加性。其中数据计算公式如下：

饲料或饲粮DMD(%),DMD=

饲粮DMD计算值(%)，

饲料或饲粮EHGE(MJ/kg),

饲粮EHGE计算值(MJ/kg),

DMD或EHGE方差，

DMD或EHGE方差计算值，

DMD或EHGE变异系数，

DMD或EHGE变异系数计算值，

式中：M₁为饲料样品干物质重量(g)；M₂为残渣干物质重量(g)；R为消化酶空白的残留量(g)；ai为饲粮中该饲料原料所占比例(%)；DMDi为饲粮中第i个饲料原料的DMD值(%)；GE₁为饲料样品总能值(MJ/kg)；GE₂为残渣总能值(MJ/kg)；RE为消化酶空白残留的总能(MJ/kg)；EHGE_i为饲粮中第i个饲料原料的EHGE值(MJ/kg)；Xi为第i个测定值；V(Xi)为重复测定该饲料原料DMD或EHGE的方差；S为标准差； 为计算的饲粮DMD或EHGE的平均值。

由表4可见，由玉米、大豆粕、棉籽粕和小麦麸按不同比例配合成8个饲粮后，通过SDS-1仿生消化获得的8个饲粮DMD实测值的平均值显著高于计算值的平均值(分别为70.15%和69.48%，P=0.000 9)。但从DMD的计算值对实测值的线性回归看，模型的决定系数为0.993 3(P<0.05)，截距与0无显著性差异(截距=1.77，P=0.468 3)，斜率与1无显著性差异(截距=0.98，P=0.647 4)。这表明8个饲粮的DMD实测值对计算值的一元线性回归模型与y=x这一直线相重合。DMD实测值的方差和变异系数分别显著低于计算值的方差和变异系数(分别为0.05%²和0.09%²，P=0.000 2；0.29%和0.44%，P=0.001 0)。在计算值的方差对实测值方差的线性回归，计算值变异系数对实测值变异系数的线性回归上，模型的决定系数分别为0.020 8(P>0.05)和0.115 7(P>0.05)，这表明它们之间没有线性关系，因此，DMD实测值的方差、变异系数与计算值相应变量的一元线性回归模型同y=x这一直线不重合。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 饲粮干物质消化率的平均值、方差、变异系数的实测值与计算值 Table 4 The determined and calculated values for mean,variance and CV of DMD of diets 项目Items 平均值 Mean/% 方差 Variance/%2 实测值 实测值 Determined value 计算值 Calculated value 差值 Difference 实测值 Determined value 计算值 Calculated value 差值 Difference 实测值 Determined value 计算值 Calculated value 差值 Difference 处理1 Treatment 1 77.39 0.18 0.55 处理2 Treatment 2 66.33 0.13 0.53 处理3 Treatment 3 38.09 0.10 0.81 处理4 Treatment 4 47.87 0.06 0.52 处理5 Treatment 5 75.35 75.07 0.28 0.03 0.12 -0.09 0.22 0.46 -0.24 处理 6 Treatment 6 72.93 72.80 0.13 0.09 0.08 0.01 0.42 0.40 0.02 处理7 Treatment 7 70.26 69.30 0.96 0.03 0.12 -0.09 0.24 0.50 -0.26 处理8 Treatment 8 61.85 61.33 0.52 0.03 0.08 -0.05 0.26 0.46 -0.20 处理9 Treatment 9 72.15 71.24 0.91 0.06 0.12 -0.06 0.33 0.48 -0.15 处理10 Treatment 10 72.02 70.91 1.11 0.04 0.08 -0.04 0.29 0.39 -0.10 处理11 Treatment 11 67.76 67.10 0.66 0.05 0.07 -0.02 0.33 0.40 -0.07 处理12 Treatment 12 68.87 68.06 0.81 0.03 0.07 -0.04 0.23 0.39 -0.16 平均值 Mean1) 70.15 69.48 0.67 0.05 0.09 -0.05 0.29 0.44 -0.15 P值 P-value2) 0.000 9 0.000 2 0.001 0 回归分析参数估计 Parameter estimates of regression3) 截距 Intercept 1.77 0.06 0.51 P值 P-value4) 0.468 3 0.157 0 0.089 2 斜率 Slope 0.98 -0.13 -0.51 P值 P-value5) 0.647 4 0.022 9 0.040 2 决定系数 R2 0.993 3 0.020 8 0.115 7 P值 P-value6) <0.000 1 0.733 1 0.409 7 1)8个饲粮干物质消化率、方差或变异系数的平均值。Mean,variance and CV of dry matter digestibility of 8 diets. 2)采用配对t检验实测值与计算值相等的显著性水平。The significant level for testing H0: determined values=calculated values by paired t-test. 3)干物质消化率、方差、变异系数实测值对计算值的回归。Regression of determined values on calculated values for mean,variance and CV of dry matter digestibility. 4)无效假设 ∶ 截距=0；备择假设 ∶ 截距≠0。H0 ∶ intercept=0; Hα ∶ intercept≠0. 5)无效假设 ∶ 斜率=1；备择假设 ∶ 斜率≠1。H0 ∶ slope=1; Hα ∶ slope≠1. 6)回归模型的显著性。Significance of regression models.

表4 饲粮干物质消化率的平均值、方差、变异系数的实测值与计算值 Table 4 The determined and calculated values for mean,variance and CV of DMD of diets

由表5可见，通过SDS-1仿生消化获得的8个饲粮EHGE实测值的平均值与计算值的平均值无显著性差异(分别为13.21和13.21 MJ/kg，P=0.965 3)。从EHGE的计算值对实测值的线性回归看，模型的决定系数为0.991 0(P<0.05)，截距与0无显著性差异(截距=0.04，P=0.941 9)，斜率与1无显著性差异(截距=1.00，P=0.940 0)。这表明8个饲粮的EHGE实测值与计算值的一元线性回归模型与y=x这一直线相重合。EHGE实测值的方差平均值与计算值的方差平均值无显著差异[分别为0.01和0.01 (MJ/kg)²，P=0.681 1]，而实测值变异系数的平均值与计算值的变异系数平均值有显著性差异(分别为0.50%和1.00%，P=0.003 6)。在计算值的方差对实测值方差的线性回归，计算值变异系数对实测值变异系数的线性回归上，模型的决定系数分别为0.200 0(P>0.05)和0.080 5(P>0.05)，这表明它们之间没有线性关系，因此，EHGE实测值的方差、变异系数与计算值相应变量的一元线性回归模型同y=x这一直线不重合。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 饲粮酶水解物能值的平均值、方差、变异系数的实测值与计算值 Table 5 The determined and calculated values for mean,variance and CV of enzymeal hydrolysate gross energy of diets 项目Items 平均值 Mean/% 方差 Variance/%2 实测值 实测值 Determined value 计算值 Calculated value 差值 Difference 实测值 Determined value 计算值 Calculated value 差值 Difference 实测值 Determined value 计算值 Calculated value 差值 Difference 处理1 Treatment 1 14.35 0.04 1.36 处理2 Treatment 2 13.80 0.01 0.53 处理3 Treatment 3 7.61 0.01 0.94 处理4 Treatment 4 9.04 0.01 0.64 处理5 Treatment 5 14.26 14.23 0.03 0.01 0.02 -0.01 0.20 1.09 -0.89 处理 6 Treatment 6 14.12 14.12 0.00 0.02 0.01 0.01 0.87 0.84 0.03 处理7 Treatment 7 13.05 12.96 0.09 0.01 0.02 -0.01 0.54 1.20 -0.66 处理8 Treatment 8 11.64 11.60 0.04 0.01 0.01 0.00 0.20 1.03 -0.83 处理9 Treatment 9 13.15 13.24 -0.09 0.01 0.02 -0.01 0.48 1.17 -0.69 处理10 Treatment 10 13.68 13.63 0.05 0.01 0.01 0.00 0.26 0.85 -0.59 处理11 Treatment 11 12.89 12.87 0.02 0.02 0.01 0.01 1.09 0.91 0.18 处理12 Treatment 12 12.86 13.01 -0.15 0.01 0.01 0.00 0.37 0.89 -0.52 平均值 Mean1) 13.21 13.21 0.00 0.01 0.01 0.00 0.50 1.00 -0.50 P值 P-value2) 0.965 3 0.681 1 0.003 6 回归分析参数估计 Parameter estimates of regression3) 截距 Intercept 0.04 0.02 1.14 P值 P-value4) 0.941 9 0.009 2 0.246 9 斜率 Slope 1.00 -0.40 -0.64 P值 P-value5) 0.940 0 0.005 2 0.112 4 决定系数 R2 0.991 0 0.200 0 0.080 5 P值 P-value6) <0.000 1 0.266 6 0.496 0 1)8个饲粮酶水解物能值、方差、变异系数的平均值。Mean,variance and CV of enzyme hydrolyzate gross energy of 8 diets. 2)采用配对t检验实测值与计算值相等的显著性水平。The significant level for testing H0: determined values=calculated values by paired t-test. 3)酶水解物能值及其方差与变异系数实测值对计算值的回归。Regression of determined values on calculated values for mean,variance and CV of enzyme hydrolyzate gross energy. 4)无效假设 ∶ 截距=0；备择假设 ∶ 截距≠0。H0 ∶ intercept=0; Hα ∶ intercept≠0. 5)无效假设 ∶ 斜率=1；备择假设 ∶ 斜率≠1。H0 ∶ slope=1; Hα ∶ slope≠1. 6)回归模型的显著性。Significance of regression models.

表5 饲粮酶水解物能值的平均值、方差、变异系数的实测值与计算值 Table 5 The determined and calculated values for mean,variance and CV of enzymeal hydrolysate gross energy of diets

在饲粮的配制中，人们假设某一可消化养分的含量等于各原料分别提供的相应可消化养分的累计。因此，在饲料能量与氨基酸生物学效价测定方法的探讨中，可加性的检验显得非常重要。同时，它也是反映方法是否灵敏的依据之一^[15]。目前，在检验测试结果可加性的统计方法上，分为3类：1)以单个饲粮实测值为样本均值，以计算值为总体均值，通过t检验统计计算值与实测值差异的显著性^{[5, 6, 7, 16]}；2)评估计算值与实测值的差异是否在测定方法的误差范围内^[1]；3)设置一系列不同待测物含量水平的处理，通过线性回归分析计算值对实测值的线性模型是否符合斜率等于1，截距等于0，从而得出在该测试范围内方法是否具有可加性^[8]。从这3类判别方法的依据看，第1类t检验是根据样本均值与整体平均值(或两样本均值)的差是否处于μ=0的t分布函数95%的分布区间内来判断实测值与计算值是否相等，而不考虑方法对样本间测值的内在联系；第2类是根据方法的测试误差判断实测值与计算值是否相等，在理论上与t检验类似，只是将这一差异的判断 尺度相对固定，而不考虑样本测试值的变异；第3 类通过计算值对实测值的回归直线的斜率是否等于1与截距是否等于0，而判断一系列实测值与计算值的关系是否符合y=x这一通过原点的直线，既考虑了不同处理水平样本平均值与整体的差异，也考虑了方法对样本间测值的内在联系。因此，该统计方法在判断可加性上更为客观、科学^[8]。

3.2 仿生消化系统测试结果可加性的检验

在排空强饲法测定鸡饲料的代谢能值上，Sibbald^[5]得出了玉米、小麦、大豆粕、鱼粉、苜蓿、牛油的真代谢能(TME)值在10个鸡饲粮中具有可加性。Hong等^[6]得出大麦与菜籽粕的TME值在鸭饲粮中具有可加性。在仿生消化法测定鸡饲料EHGE的可加性上，Zhao等^[7]得出玉米、大豆粕、棉籽粕的EHGE在3个饲粮中均具有可加性。由此可见，现有的饲料能量的生物学效价测定方法在一定范围内均具有满意的可加性。本研究中，由4个饲料原料配制成8个饲粮后，每个饲粮的DMD实测值均稍高于计算值，由此使得配对t检验差异显著。然而，DMD实测值与计算值的平均差异为0.67%(7个饲粮两者的差异均不超过1%)，且这一差异在单胃动物仿生消化系统测试允许的误差范围内^[2]。与此同时，通过回归分析表明，饲粮DMD的实测值与计算值分布在y=x这一直线上。由此表明，4种饲料原料的DMD在8个饲粮中是可加的。同样，在EHGE上，t检验的结果与线性回归均表明4种饲料原料的EHGE在8个饲粮中也是可加的。这主要是由于在仿生消化中，模拟消化液内消化酶的浓度是根据体内消化酶的活性制备，而这一消化酶的活性相对于饲料底物是过量的^[17]，因此，饲料中底物的量与化学结构决定了测试结果，从而使得其具有可加性。然而，在DMD与EHGE的方差与变异系数上，原料的测试结果的方差与变异系数在饲粮中都不具有可加性。这是由于饲粮在实测值中重复的变异与单一饲料原料的变异相似，甚至低于单一饲料的变异，因此，实测值的方差或变异系数低于计算值的相应值。

仿生消化法测定玉米、大豆粕、棉籽粕、小麦麸的DMD和EHGE在饲粮中具有可加性，然而测试数据的方差与变异系数不具有可加性。