2. 成都美溢德生物技术有限公司, 成都 610222
2. Chengdu Mytech Biotechnology Co., Ltd., Chengdu 610222, China
大豆蛋白是猪饲粮主要的蛋白质原料，常见仔猪饲粮中总用量达到15%~20%[1]。但大豆蛋白分子质量大，需经过仔猪胃肠道复杂的消化过程才能被吸收利用[2, 3]；另外，其抗营养因子含量高，极易损害仔猪肠道健康[4, 5]。因此，大豆蛋白在仔猪上的消化利用率低，成为影响仔猪饲粮蛋白质利用效率的主要因素，使仔猪的生长受到抑制。研究发现，将大豆蛋白降解不仅可以提高大豆蛋白的可消化性[5, 6, 7]，还能产生部分大豆活性肽[7, 8]。肽在动物体内具有以下功能：1)促进氨基酸吸收，加速蛋白质合成[9, 10]；2)提高矿物元素利用效率[11, 12, 13]；3)促进肠道生长发育，维持肠道健康[14]等。因此，饲粮应用大豆蛋白降解物能够提高仔猪生长性能[15, 16, 17, 18]，提高饲粮钙(Ca)、磷(P)的表观消化率[19, 20, 21]，促进肠道绒毛发育[20, 22, 23]等。
目前，大豆蛋白降解以发酵[5]或酶解[7]工艺生产，降解程度主要通过酸溶蛋白(分子质量<2 000 u)和抗营养因子含量评价，从而进一步判断其可消化利用性；但由于生产工艺条件不同，产品质量参差不齐[16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27]。调查发现，市场以发酵大豆蛋白为主，仅有部分酶解大豆蛋白，其产物中酸溶蛋白含量低于10%，抗营养因子清除率低于50%，且鲜有功能肽的报告[28]。因此，提高大豆蛋白降解物中肽含量，降低抗营养因子，增加功能肽是提高大豆蛋白利用的关键。根据猪生理需求，结合大豆蛋白结构特点，经组合液态酶解形成的大豆酶解蛋白(enzymolytic soybean meal，ESM)，其酸溶蛋白含量达到28%以上，抗营养因子清除率90%以上，同时富含肠道修复和抗氧化的功能肽。它不仅为仔猪提供了直接吸收、高效沉积的氮，同时，还可以提高仔猪的消化吸收能力，从而改善生长性能。本试验旨在仔猪饲粮中添加不同水平的ESM，探索ESM最适添加水平，研究ESM对仔猪矿物质利用和消化道健康的影响，为生产应用提供理论参考依据。 1 试验材料与方法 1.1 试验材料
ESM由成都美溢德生物技术有限公司(商品名“富力肽”)提供。ESM采用大豆蛋白为原料，经组合液态酶解工艺生产，粗蛋白质(CP)含量在45%以上，使用三氯乙酸沉淀法测定酸溶蛋白即小肽含量在28%以上(其中二肽和三肽占小肽的87%以上)，同时富含部分生物活性肽，原料中抗营养因子被有效清除。ESM营养成分与抗营养因子组成见表1。
 | 表1 大豆酶解蛋白营养成分与抗营养因子组成 Table 1 Composition of nutrients and anti-nutritional factors of ESM |
试验采用单因素试验设计，选择120头体重为(10.79±1.59) kg健康“杜长大”(DLY)仔猪，随机分为6个组，每组4个重复，每个重复5头。6个组分别饲喂饲粮1~6。饲粮1(19%CP)以进口鱼粉、豆粕、膨化全脂大豆为主要蛋白质源，豆油为主要脂肪源，并添加维生素和矿物元素预混料配制而成。饲粮2(18%CP)在饲粮1的基础上降低1%CP，通过调整蛋白质原料和能量原料的用量，保证营养物质供给平衡。饲粮3~6在饲粮2的基础上分别以1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的ESM替代等量玉米(表2)。 1.3 饲养管理
试验地点在四川成都新益洲养殖有限公司。每日饲喂4次(07:00、12:00、16:00、20:00)，每天07:00饲喂前记录余料量之后清干净料槽再饲喂。每晚饲喂后，根据当日投喂量估算第2天采食量并将料称好放于相应的料桶中。每天观察仔猪的采食情况，如果有突发异常情况使采食下降，及时找出原因并采取相应措施。饲养期准确记录各重复的体重。其他饲养管理按照养殖场正常程序进行。试验期共计36 d。 1.4 样品采集和处理
饲料样：配制饲粮时，6个组的饲粮在每袋相同位置各取150 g，混匀后按四分法收集饲料样，-20 ℃保存，用于测定水分、有机物、粗灰分、CP、Ca、P、酸不溶灰分含量。
粪样：饲养试验进行到第3周开展为期4 d的消化试验。采用内源指示剂法，用酸不溶灰分为指示剂，部分收粪。消化试验期间每天早、中、晚喂料后收集新鲜未污染粪样，按照粪样重量5%比例加入10%浓盐酸。以重复为单位，各重复试验猪群的粪样混匀，取样10%，在65 ℃烘箱中烘至恒重，室温下回潮24 h，称重，记录，粉碎过40目筛，装密封袋保存于-20 ℃，用于测定水分、有机物、粗灰分、CP、Ca、P、酸不溶灰分含量。
| 表2 试验饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 2 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) |
血清样：试验结束时，每个重复随机选1头猪进行空腹采血，用真空采血管从前腔静脉采非抗凝血10 mL，室温下倾斜放置30 min，3 500 r/min离心10 min后，分离血清，置于-20 ℃冷冻保存，用于血清二胺氧化酶(DAO)活性和Ca、P含量测定。
内脏样：饲养试验结束后，禁食12 h后称重。在屠宰前1 h喂料，每个重复选取1头中等体重猪只进行放血处死。迅速打开腹腔分离及结扎肠段将十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠分段取下(所有猪只取相同位置)。采集盲肠和结肠食糜，立即进行菌群数量测定。取十二指肠、空肠、回肠中段约3 cm肠段放入4%甲醛溶液中做组织切片测定绒毛高度和隐窝深度。取左侧股骨测定骨骼中Ca、P含量。将采集的样品液氮迅速冷冻，再转入-20 ℃冰箱中保存备用。 1.5 测定指标及方法 1.5.1 生长性能
试验期间每日记录给料量和余料量，计算采食量。试验开始前1天和试验结束前1天，猪空腹12 h称重，计算平均日采食量、平均日增重及料重比。
平均日增重(ADG，kg/d)=(试验结束体重-试验初始体重)/试验天数； 平均日采食量(ADFI，kg/d)=(试验期内给料量-试验期内余料量)/试验天数； 料重比(F/G)=平均日采食量/平均日增重。
1.5.2 营养物质表观消化率饲料和粪便中CP、粗脂肪、粗灰分含量的测定参照张丽英主编《饲料分析及饲料质量检测技术(第2版)》；Ca含量参照GB/T 6436—2002用乙二胺四乙酸(EDTA)络合滴定法测定；P含量参照GB/T 6437—2002用钼黄比色法测定。酸不溶灰分含量按照GB/T 23742—2009。某营养物质消化率按以下公式计算：
某营养物质消化率(%)=100-100×b×c/(a×d)。
式中：a为饲料中某营养物质含量(%)；b为粪中某营养物质含量(%)；c为饲料中酸不溶灰分含量(%)；d为粪中酸不溶灰分含量(%)。 1.5.3 血清和股骨Ca、P含量
血清Ca、P含量测定均采用南京建成生物工程研究所检测试剂盒，Ca含量采用甲基百里香酚蓝比色法，P含量采用磷钼酸法。
股骨的前处理参照Gao等[29]的方法进行，股骨经蒸煮、去肉和筋腱，烘干后再在乙醇 ∶ 苯(2 ∶ 1)混合液中浸泡7 d后脱脂，于105 ℃烘干到恒重后称得脱脂干股骨重，继而在550 ℃灰化后称得粗灰分重，股骨Ca、P含量与饲料和粪便Ca、P含量测定方法相同。 1.5.4 肠道绒毛高度和隐窝深度
将甲醛溶液固定的十二指肠、空肠、回肠肠段用酒精脱水后，再用石蜡切片包埋，切片厚度6 μm，苏木素-伊红(HE)染色。采用图像分析处理系统，每个样品观察3张不连续性切片(保存相片)。每个样品各测10个绒毛高度和隐窝深度，测量后统计其平均值，计算绒毛高度/隐窝深度(V/C)。 1.5.5 肠道分泌型免疫球蛋白A(sIgA)含量和血清DAO活性
回肠黏膜sIgA含量、血清DAO活性使用南京建成生物工程研究所检测试剂盒，sIgA含量用酶联免疫法、DAO活性用酶解法测定。 1.5.6 盲结肠乳酸杆菌和大肠杆菌数量
乳酸菌数量测定用MRS培养基，大肠杆菌数量测定用伊红-美蓝培养基。乳酸菌、大肠杆菌数量的测定采用点种法。首先用灭菌生理盐水对食糜进行倍比稀释；然后每个样品取3个稀释度点样，每个稀释度点3个重复，取其平均值作为最终结果。培养相应时间后，分别对其进行菌落计数，结果以lg(CFU/g)表示。 1.6 数据处理分析
试验数据先采用Excel 2007处理，再采用SPSS 17.0软件进行统计分析，结果用平均值±标准差表示。试验2~6组采用(one-way ANOVA)单因素方差分析，差异显著者采用Duncan氏法多重比较检验；试验第1组和第4组采用独立样本t检验。以P<0.05作为差异显著性判断标准。 2 结 果 2.1 ESM对仔猪生长性能的影响
从表3可知，与18%和19%CP组相比，添加ESM的18%CP饲粮对仔猪增重、平均日采食量和平均日增重的影响差异均不显著(P>0.05)，但在18%CP+1.0%和1.5%ESM组仔猪增重、平均日采食量和平均日增重都高于其他组。
| 表3 大豆酶解蛋白对仔猪生长性能的影响 Table 3 Effects of ESM on growth performance of piglets |
从表4可知，与18%组相比，ESM显著提高了饲粮干物质、有机物、CP、粗灰分表观消化率(P<0.05)，当ESM添加到1.5%时达到最大值。与19%CP组相比，18%CP+1.5%ESM组干物质、有机物、CP、粗灰分表观消化率显著提高(P<0.05)。
| 表4 大豆酶解蛋白对仔猪饲粮营养物质表观消化率的影响 Table 4 Effects of ESM on the apparent digestibility of dietary nutrients of piglets |
与18%CP组对比，18%CP+1.5%和2.0%ESM组饲粮Ca表观消化率显著提高(P<0.05)，18%CP+1.0%、1.5%和2.0%ESM组饲粮P表观消化率显著提高(P<0.05)。与19%CP组相比，18%CP+1.5%ESM组显著提高了饲粮P表观消化率(P<0.05)。 2.3 ESM对仔猪血清Ca、P含量和骨骼粗灰分、Ca、P含量的影响
从表5可知，随ESM添加水平增加，血清Ca、P先增后减，其中18%CP+1.5%和2.0%ESM组Ca含量高于其他组，而18%CP+1.0%ESM组P含量高于其他组，但与18%CP组差异不显著(P>0.05)。与19%CP组相比，18%CP+1.5%ESM组显著提高了血清Ca含量(P<0.05)。
| 表5 大豆酶解蛋白对仔猪血清Ca、P含量和骨骼粗灰分、Ca、P含量的影响 Table 5 Effects of ESM on the contents of Ca and P in serum and ash,Ca and P in bone of piglets mmol/L |
骨骼粗灰分、Ca、P含量随ESM添加水平增加而先增后减，与18%CP组相比，18%CP+1.0%和2.0%ESM组显著提高了Ca、P含量(P<0.05)。与19%CP组相比，18%CP+1.5%ESM组骨骼Ca含量显著提高(P<0.05)，粗灰分、P含量无显著差异(P>0.05)。 2.4 ESM对仔猪肠道绒毛高度、隐窝深度及V/C的 影响
从表6可知，与18%CP组相比，ESM对十二肠绒毛高度无显著影响(P>0.05)，但18%CP+2.0%ESM组空肠、18%CP+2.5%ESM组回肠绒毛高度显著提高(P<0.05)；ESM对仔猪各小肠道隐窝深度无显著影响(P>0.05)。仔猪各小肠道V/C随ESM呈先增后减趋势，与18%CP组相比，18%CP+2.0%ESM组十二指肠和空肠的V/C显著增加(P<0.05)，18%CP+1.5%ESM组回肠V/C显著增加(P<0.05)。与19%CP组相比，18%CP+1.5%ESM组十二指肠绒毛高度显著降低(P<0.05)，但各肠道隐窝深度和V/C无显著变化(P>0.05)。
| 表6 大豆酶解蛋白对仔猪肠道绒毛高度、隐窝深度及V/C的影响
Table 6 Effects of ESM on villus height,crypt depth and the ratio of villus height to crypt depth in intestines of piglets
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从表7可知，与18%CP组对比，18%CP+1.5%、2.0%和2.5%ESM组显著降低了血清DAO含量(P<0.05)，其中18%CP+1.5%ESM组极显著降低(P<0.01)。回肠黏膜sIgA含量随ESM添加水平增加而提高，与18%CP组对比，18%CP+1.5%、2.0%和2.5%ESM组回肠黏膜sIgA含量显 著提高(P<0.05)。与19%CP组相比，18%CP+ 1.5%ESM组DAO活性显著降低(P<0.05)。
| 表7 大豆酶解蛋白对仔猪血清二胺氧化酶活性、回肠黏膜分泌型免疫球蛋白A含量的影响 Table 7 Effects of ESM on DAO in serum and sIgA in ileum mucosa of piglets |
从表8可知，与18%CP组相比，ESM可提高盲肠、结肠乳酸杆菌数量及乳酸杆菌/大肠杆菌，其中18%CP+1.5%、2.0%和2.5%ESM组均达到显著水平(P<0.05)。与18%CP组相比，18%CP+ 1.0%和1.5%ESM组盲肠、结肠大肠杆菌数量无显著差异(P>0.05)。与19%CP组相比，18%CP+1.5%ESM组盲肠和结肠乳酸杆菌数量、乳酸杆菌/大肠杆菌极显著提高(P<0.01)。
| 表8 大豆酶解蛋白对仔猪盲肠和结肠菌群的影响
Table 8 Effects of ESM on microflora in cecum and colon of piglet
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ESM通过改善仔猪饲粮营养成分表观消化率来提高仔猪采食量和增重。本试验中，降低饲粮1%CP同时添加1.5%ESM可以显著提高仔猪饲粮有机物和CP表观消化率，从而提高平均日采食量、平均日增重，但差异不显著。Sun等[18]用2%酶解豆粕(酸溶蛋白含量20.35%)替代1.2%鱼粉，饲粮保持等能等氮，仔猪平均日增重提高了16.29%、平均日采食量提高了15.83%。Zhou等[16]在仔猪饲粮添加3%酶解豆粕(酸溶蛋白含量24.57%)平均日增重提高了41.4%。付晓等[19]在仔猪饲粮使用7%酶解豆粕(酸溶蛋白含量14.11%)等量替代豆粕，饲粮蛋白质水平提升了0.44%，平均日增重、平均日采食量分别提高了72.52、61.14 g/d，料重比降低了8.86%。以上研究结果与本试验结果相似，但改善幅度有差异，这可能有2方面原因。第一，不同工艺条件生产的酶解蛋白中肽含量和组成不同，抗营养因子含量有差异。本试验采用组合液态酶解工艺，酸溶蛋白含量28%，比以上研究物质肽含量高，因此，生产中使用量低于其他研究也可达到较好生产效果。第二，使用方案不同。其他研究直接添加或部分替代豆粕、鱼粉等蛋白质原料，提高了饲粮CP水平，而本试验降低CP水平增加ESM，以肽形式提供氮源。Gibert等[28]研究发现，二肽、三肽具有吸收速度快、耗能低，能够消除与游离氨基酸吸收之间竞争的特性，肽可提高动物对蛋白质吸收利用；另外，李硕[30]研究发现，大豆产生的小分子肽具有生物活性，增强动物消化功能，提高饲料转化利用率。本次试验结果表明，降低饲粮1%CP同时添加1.0%~1.5%ESM可以提高仔猪生长性能。 3.2 ESM促进仔猪对矿物质的利用
饲粮矿物质的表观消化率反映机体对Ca、P的消化吸收程度，矿物质进入血液后参与合成和分解代谢；血清Ca、P含量反映机体Ca、P代谢动态状况；骨骼粗灰分、Ca和P含量反映机体对Ca、P沉积能力[29]。ESM通过提高血清和骨骼粗灰分、Ca、P含量证实了仔猪对饲粮粗灰分、Ca、P利用程度改善；降低1%CP同时添加ESM可以提高饲料Ca利用。结果表明，ESM促进了仔猪对矿物质利用。付晓等[26]在仔猪饲粮使用7%酶解豆粕，饲粮Ca和P表观消化率分别提高了34.99%和25.04%。王石等[23]选择25日龄断奶仔猪，在断奶后1~21 d使用1.5%谷朊粉酶解物等比例替代血浆蛋白粉，仔猪饲粮Ca消化率提高了10.30%。体外试验证实，植物蛋白降解物中肽能与Ca、Fe、锌(Zn)等形成螯合物，如大豆分离蛋白酶解物和大米蛋白酶解物可与Ca、Zn等离子螯合[11, 12, 13]，从而促进动物对矿物质吸收利用。因此，ESM促进矿物质利用与肽具有螯合矿物质特性有关[11, 12, 13]，一方面ESM含有部分螯合形式的Ca有利于吸收，另一方面ESM中肽与饲粮中矿物质螯合，促进饲粮矿物质利用，在生产上表现为促进仔猪骨骼发育。 3.3 ESM维持仔猪肠道健康 3.3.1 ESM促进仔猪肠道发育
肠道正常发育是仔猪对饲粮消化吸收的基础，小肠道绒毛高度、隐窝深度、V/C综合反映小肠功能状态[31, 32]。ESM通过改善仔猪空肠、回肠绒毛高度和各小肠段隐窝深度来促进肠道绒毛的发育；同时，通过降低饲粮蛋白质水平同时添加1.5%ESM也提高了C/V， 促进肠道绒毛发育。表明，ESM可促进肠道绒毛发育，提高仔猪对营养物质消化吸收能力。这与王恬等[15]、张晶等[20]、潘翠玲等[22]研究报道基本一致，ESM促进肠道发育可能是酶解产物中某些活性肽可作为肠黏膜上皮细胞发育的能源底物，有效促进肠黏膜组织发育[33, 34]。 3.3.2 ESM维持仔猪肠道结构完整
仔猪肠道组织发育及功能发挥依赖于肠道绒毛细胞结构的完整性。DAO有95%以上分布于肠道黏膜细胞，当肠道黏膜细胞通透性增加会进入血液，血清DAO活性反映肠上皮细胞成熟度和完整性[35, 36]。肠道黏膜组织特异性免疫应答产物sIgA参与肠道局部免疫，在消化道黏膜防御机制中发挥重要作用[36]。仔猪饲粮添加1.5%和2.0%ESM降低血清DAO活性和提高sIgA含量，从而促进肠道上皮细胞完整性和肠道免疫；降低饲粮蛋白质水平使用1.5%ESM也能降低仔猪血清DAO活性、提高回肠黏膜sIgA含量。表明，ESM促进肠道消化吸收功能的正常发挥；同时，增强肠道免疫能力，减少肠道病原菌感染机会，从而保证肠道处于健康状态。这可能与ESM含有部分大豆活性肽有关，活性肽提高肠道黏膜免疫，促进sIgA分泌，减少病原微生物入侵，进一步降低肠上皮细胞损伤[35, 36]。 3.3.3 ESM优化仔猪肠道菌群结构
仔猪肠道微生态系统由多种菌群组成，主要存在于盲肠和结肠。研究发现，猪正常肠道菌群包括乳酸杆菌、双歧杆菌属等有益菌群，以及大肠杆菌属等有害菌群[37]。动物肠道健康状况下菌群处于平衡状态，当有害菌大量增殖占优势时，动物则会出现腹泻等临床症状。ESM提高仔猪盲肠、结肠乳酸杆菌数量和乳酸杆菌/大肠杆菌；降低饲粮蛋白质水平同时添加1.5%ESM可提高盲肠、结肠乳酸杆菌数量和乳酸杆菌/大肠杆菌。表明，ESM能优化肠道菌群结构。本次研究结果与Zhou等[17]研究结果相似，这可能是由于饲粮添加ESM促进了肠道发育，提高了饲粮营养物质整体利用效率，减少了进入大肠内未消化营养物质，从而优化肠道后段的菌群结构。
ESM中所含二肽、三肽和活性肽可通过促进肠道绒毛发育、增强肠道黏膜免疫、减少肠上皮细胞损伤来提高仔猪消化能力，使饲粮有机物、CP表观消化率提高；减少进入后肠未消化的营养物质，优化肠道菌群结构，进一步改善肠道内环境。同时，通过螯合矿物质元素，提高血清和骨骼Ca、P含量，从而提高饲粮Ca、P利用率，有利于仔猪骨骼发育。因此，ESM通过促进骨骼发育和肠道健康，加快仔猪生长速度。 4 结 论
饲粮添加1.0%~1.5%ESM可促进仔猪肠道绒毛发育、维持肠道结构完整、优化肠道菌群，从而保证消化道健康；可提高仔猪对Ca、P的吸收与沉积，从而促进骨骼生长发育。
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