β-羟基-β-甲基丁酸(β-hydroxy-β-methylbutyrate,HMB)是亮氨酸代谢的一种中间产物，在肌肉蛋白质代谢中发挥着重要作用。HMB由Nissen等[1]于1988年首次发现，亮氨酸代谢的第1步是将氨基转运给α-酮异己酸(α-ketoisocaproic acid,KIC)，在胞内KIC-双加氧酶的作用下进一步生成HMB。自1996年亚特兰大奥运会获得金牌的游泳运动员披露训练中补充了HMB后，HMB逐渐引起运动学界和医学界的普遍关注，目前HMB已作为一种增大肌肉体积减少体脂的营养补剂被广泛使用。
胚蛋给养是20世纪80年代出现的一种家禽早期营养技术，其做法是在孵化的晚期(如18胚龄)从羊膜腔中注入含有不同成分的营养液，以达到改善鸡的孵化率和鸡雏质量，促进消化道生长发育、改善雏鸡出壳时及随后生长发育的效果。早期研究表明在孵化的晚期从羊膜腔中注入HMB提高了出雏时肉仔鸡体重和肌肉重[2, 3, 4]。Kornasio等[5]发现胚蛋给养HMB显著提高了肉鸡14日龄时胸肌重和胸肌率，表明HMB对肉鸡孵化后的肌肉生长有持续的正面效果。本课题组前期试验发现肉鸡出雏后饲粮中添加HMB能显著提高肉鸡42日龄时胸肉率，添加0.05%以上HMB-Ca组血液胰岛素(INS)含量均显著高于对照组[6]。此外，胚蛋给养碳水化合物对小肠有营养作用，能够促进杯状细胞的发育 [7]。
可见，大量研究表明胚蛋给养HMB对肉用家禽体重和肌肉发育具有促进作用，且研究主要集中在肠道消化吸收功能的改善及其机制等方面，而关于胚蛋给养HMB对肉鸡肌肉发育和内分泌系统相互作用的报道甚少。因此，本试验旨在研究胚蛋给养HMB对肉仔鸡生长性能、胸肌生长、肌肉品质、血浆生化和激素指标的影响，并且初步探讨胚蛋给养HMB调控肉鸡生长的相关机理，为HMB在胚蛋给养中的应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料HMB产品纯度99%，购自北京中生瑞泰科技有限公司。
1.2 试验动物与分组孵化阶段：选用260枚爱拔益加(AA)鸡商品代受精蛋(种鸡36周龄)随机分成2组，组1在孵化第17.5胚龄注射1 mL含0.1% HMB的生理盐水，组2注射相同剂量的生理盐水作为对照组。孵化条件：温度37.8 ℃，相对湿度60%，每1.5 h翻蛋1次，第19天停止翻蛋，每隔4 h记录1次孵化温度和相对湿度。孵化第10天照蛋，去除未受精蛋和死胚蛋。孵化第17.5胚龄进行注射，注射前用75%酒精浸润的脱脂棉球在注射点附近擦拭消毒，注射器针头长度以种蛋短轴的1/2稍长为宜，注射完立即用石蜡封口。
饲养阶段：肉仔鸡出壳后，从每个组中各选取健康、接近平均体重的48只公雏分配6个笼子(100 cm×90 cm×65 cm)饲养，每笼8只鸡，双层笼养，饲养期为42 d，分为前期(1～21 d)和后期(22～42 d)2个阶段。饲养管理按《AA肉鸡饲养管理手册》进行，试验饲粮参照NRC(1994)和NY/T 33—2004，并结合《AA肉仔鸡的饲养管理手册》配制，基础饲粮组成及营养水平见表1，试验期间自由采食和饮水。
 | 表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) |
出雏当日，统计出雏数量，计算孵化率，并以每40只为单位称重，计算初生重。
分别于肉仔鸡的1、21和42日龄，于09:00之前，以重复为单位空腹称重，统计体重、平均日增重(ADG)；试验期间每天以重复为单位，记录鸡只的耗料量，计算试验前期、后期及全期的平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)；每天记录死淘鸡只，计算死淘率。
1.3.2 胴体组成及肌肉品质 1.3.2.1 全净膛率、胸肌率、腿肌率和腹脂率分别在21、42日龄从每个重复中选取1只接近平均体重的肉仔鸡，颈动脉杀鸡取血，随后测定全净膛率、胸肌率、腿肌率和腹脂率。计算公式如下：
全净膛率(%)=100×全净膛重／活重；
胸肌率(%)=100×胸肌重／全净膛重；
腿肌率(%)=100×腿肌重／全净膛重；
腹脂率(%)=100×腹脂重／(全净膛重+腹脂重)。
1.3.2.2 肌肉pH用pH Spear防水笔型数显pH计(EUTECH公司，新加坡)测定屠宰后45 min内胸肌的pH(pHi)和在4 ℃存放24 h后胸肌的pH(pHu)，并计算pH下降值(ΔpH)。测定时将电极头完全包埋在肉样中，每个样品测2次，取其平均值。pH计使用前需用pH 4.00、6.86和9.18的标准缓冲液进行校正。
1.3.2.3 滴水损失屠宰后45 min内称取形状规则的胸肌(30±1) g(W1)放于封口袋中，并向袋中充入氮气使之膨胀，尽量减少肉样与封口袋内壁接触，悬吊于4 ℃冰箱内，24 h时取出肉样用滤纸轻轻拭去肉样表层汁液后称重(W2)。计算公式如下：
滴水损失(%)=100×(W1-W2)/W1。
1.3.2.4 蒸煮损失测过24 h滴水损失后的肉样装入封口袋中放回4 ℃冰箱内，至72 h时取出用吸水纸吸干肉样表面水滴，将肉样修整为长宽高分别为2 cm×2 cm×1 cm的规则形状，称重(W1)，将肉样置于封口袋内后抽去袋内空气封住袋口，务必使肉样表面与塑料袋紧帖。将装有肉样的封口袋置于80 ℃水浴中，加热，至肉样的中心温度为74 ℃时，取出，流水冷却至室温，然后打开封口袋用滤纸擦去肉样表面水分后称重(W2)。计算公式如下：
蒸煮损失(%)=100×(W1-W2)/W1。
1.3.2.5 剪切力将测完蒸煮损失的肉样，按肌纤维走向修成2块长×宽×高为2.0 cm×1.0 cm×0.5 cm的条形肉样，上机时，肌纤维走向与刀口垂直。采用TMS-Pro嫩度分析仪(弗吉尼亚食品技术有限公司，美国)，参数设置为传感器最大负荷100 N，垂直位移速度150 mm/min，跨度6 mm。以牛顿为单位，每个肉样测试3次，取2块肉样的6次测定值的平均值为最终剪切力。
1.3.3 器官指数在21和42日龄屠宰鸡只时，摘取肝脏和免疫器官(胸腺、脾脏和法氏囊)，称重并计算各器官指数。计算公式如下：
器官指数(g/kg)=器官重量(g)/活体重(kg)。
1.3.4 血浆生化及激素指标分别于21和42日龄，翅静脉采血3 mL，抗凝管存放，于1 800×g 4 ℃离心10 min，取上清液分装，冻存于-20 ℃备测。血浆生化指标：总蛋白、尿酸和肌酐含量测定采用全自动生化分析仪(KHB ZY-310)测定，试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司。血浆中生长激素(GH)、甲状腺素(T4)、三碘甲腺原氨酸(T3)和INS含量采用相应的125I标记的RIA kits放射免疫试剂盒(北方生物技术研究所，北京)测定。所有试剂盒在使用前，先对血浆进行梯度稀释，依据标准曲线确定加样量。每个血浆样品检测1次以避免批次间变异。
1.4 数据统计分析试验数据采用SPSS 15.0软件的one-way ANOVA先进行方差齐次性检验，再进行F检验和LSD多重比较。以P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著，以“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析 2.1 胚蛋给养HMB对肉仔鸡生长性能的影响由表2可以看出，与对照组相比，HMB组肉仔鸡体重在1、21和42日龄时分别提高了1.9(P<0.05)、41.8(0.05<P<0.10)和85.4 g(P>0.10)；1～21日龄和1～42日龄时HMB组平均日增重高于对照组(0.05<P<0.10)；HMB组的料重比在1～21日龄和1～42日龄时显著降低(P<0.05)，在22～42日龄HMB组料重比低于对照组(0.05<P<0.10)。HMB组和对照组平均日采食量无显著差异(P>0.05)。胚蛋给养HMB对肉仔鸡孵化率无显著影响(P>0.05)。
| 表2 胚蛋给养HMB对肉仔鸡生长性能的影响Table 2 Effects of in ovo feeding of HMB on growth performance in broilers |
由表3可以看出，肉仔鸡的全净膛率和腹脂率在整个生长期均无显著差异(P>0.05)；21日龄时，与对照组相比，HMB组胸肌率提高了2.4%(P<0.05)，腿肌率提高了6.4%(P<0.01)；42日龄时，HMB组胸肌率和腿肌率变化趋势不明显，分别比对照组提高了0.8%和0.7%(P>0.05)。肌肉品质方面，HMB对肉鸡胸肌pHi、pHu和ΔpH的影响不显著(P>0.05)，且对照组和HMB组间滴水损失、蒸煮损失和剪切力未发现显著差异(P>0.05)。
| 表3 胚蛋给养HMB对肉仔鸡胴体组成及肌肉品质的影响Table 3 Effects of in ovo feeding of HMB on carcass composition and meat quality in broilers |
由表4可以看出，胚蛋给养HMB对肉仔鸡肝脏相对重量和免疫器官指数无显著影响(P>0.05)。胚蛋给养HMB肉鸡21日龄时胸腺指数和42日龄脾脏指数有降低的趋势，而42日龄肝脏指数有升高的趋势(0.05<P<0.10)。
| 表4 胚蛋给养HMB对肉仔鸡器官指数的影响Table 4 Effects of in ovo feeding of HMB on organ indices in broilers |
由表5可以看出，HMB组对肉仔鸡血浆生化指标(总蛋白、尿酸、肌酐含量)的影响总体不明显，其中21日龄时血浆中肌酐含量有降低的趋势，但未达到统计学显著水平(P>0.05)。与对照组相比，HMB组21和42日龄血浆T3、T4、GH和INS含量均无显著变化(P>0.05)。除42日龄T4外，HMB组血浆激素含量在数值上均高于对照组，其中21日龄T3含量升高了17.9%，42日龄GH含量升高了23.2%，42日龄INS含量升高了25.2%。
| 表5 胚蛋给养HMB对肉仔鸡血浆生化及激素指标的影响Table 5 Effects of in ovo feeding of HMB on plasma biochemical and hormone indexes in broilers |
亮氨酸是畜禽体内重要的支链氨基酸，而HMB是亮氨酸代谢的一种中间产物，其能够提高肉仔鸡的生长性能和屠宰性能[8,9,10]。Buyse等[8]研究结果表明，在肉仔鸡饲粮中添加300 mg/kg的HMB，14日龄时体重显著高于对照组。关于胚蛋给养HMB的应用，Uni等[3]报道,在孵化后期注射HMB能提高出雏体重5%～6%，增加胸肌重6%～8%，且直到试验结束(25日龄)仍然保持较高的胸肌重。在本试验中，注射HMB有提高雄性肉仔鸡出雏体重和生长期体重的趋势，结果与Uni等[3]报道一致。本研究还发现，胚蛋给养HMB并不影响肉仔鸡平均日采食量，但可提高肉仔鸡的平均日增重，从而提高饲料效率。Tako等[2]在肉鸡的胚胎后期注射碳水化合物和HMB到羊膜腔中，发现注射HMB后可以显著提高出壳时空肠绒毛长度、宽度和表面积，并提高蔗糖酶和异麦芽糖酶活性。在火鸡上的试验也表明,卵内给养HMB能提高初生火鸡空肠蔗糖酶、麦芽糖酶和亮氨酸氨基肽酶的活性[9]，同时钠葡萄糖共转运载体、肽转运载体、蔗糖-异麦芽糖酶、氨肽酶mRNA表达水平也显著增加[10]。因此，HMB促进肉仔鸡早期生长的作用与促进肠道发育和消化酶活性增强有关。
3.2 胚蛋给养HMB对肉仔鸡胴体组成及肌肉品质的影响目前为止，关于胚蛋给养HMB对上市日龄肉仔鸡胴体组成及肌肉品质影响的报道还很少。Moore等[11]研究显示，HMB可增加肉仔鸡出壳后48 h肌卫星细胞分裂的活性，促进出雏后肌肉的早期生长。肉禽的肌肉产量与肌细胞数量密切相关，而肌细胞快速增殖仅能维持出生后的数天，在生长早期肌细胞数量即基本固定而不再增加，因此肌肉生长促进剂的效应可能会随着日龄的增加而逐渐减弱。本试验也发现注射HMB能够明显提高肉仔鸡生长前期(1～21 d)生长性能，前期胸肌率和腿肌率显著高于对照组，促进肌肉生长的作用明显，但在生长后期(22～42 d)的促进作用相对不明显，可能与HMB刺激早期肌细胞增殖有关，需进一步探索。本试验研究发现，胚蛋给养HMB不影响肉仔鸡上市日龄时的胸肌pH、滴水损失、蒸煮损失和剪切力，表明胚蛋给养HMB不会降低肉仔鸡的肌肉品质。乔璇等[6]发现饲粮中添加0.1%的HMB-Ca可使肉仔鸡42日龄胸肌率提高4.88%，表明HMB对肌肉蛋白质的沉积有积极作用。胚蛋给养HMB是否影响肉仔鸡肌肉蛋白质含量尚不清楚，对此有待于在肌肉蛋白质周转代谢方面开展研究。
3.3 胚蛋给养HMB对肉仔鸡血浆生化指标及器官指数的影响器官指数是反映机体组织器官发育的重要指标。血浆总蛋白和尿酸含量可反映家禽蛋白质代谢状况和肾脏功能，血浆肌酐是机体肌肉代谢的产物，其含量可反映肾脏肾小球的滤过能力。本试验中，肉仔鸡的肝脏和免疫器官指数未发生变化，血浆总蛋白、尿酸和肌酐含量在2个组间也无显著差异，表明胚蛋给养HMB不影响肉仔鸡生长发育阶段的器官发育、器官功能和蛋白质代谢状况。
3.4 胚蛋给养HMB对肉仔鸡血浆激素指标的影响禽类胚胎发育、早期生长和体内代谢激素指标密切相关。垂体分泌的GH是一种合成代谢激素，它能够促进氨基酸掺入到肌肉蛋白并刺激细胞外胶原沉积，控制骨骼和肌肉细胞功能[12]。禽类出雏早期生长速度较快，血浆中GH含量较高，随着生长速度的降低，血浆GH含量也显著下降[13]。INS是促进合成代谢、维持血糖相对稳定的重要激素，它既促进蛋白质合成，又抑制蛋白质分解[14]，是作为观测动物机体代谢水平的重要指标之一。甲状腺激素能促进胃、肠道对糖的吸收和肝糖原的分解，加速体内物质氧化过程，促进蛋白质的合成，有利于组织和器官的分化。甲状腺激素T3可进入靶细胞内，与核内特异受体结合，使合成RNA的物质如苹果酸酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、鸟氨酸氨基转移酶活性，细胞色素C、GH含量增加，加速RNA的合成，从而增加蛋白质的合成速率[15]。Lu等[16]研究发现血浆T3和T4含量与鸡的胚胎发育呈强的正相关。本试验并未观测到注射HMB组相对于对照组肉仔鸡血清中GH、INS和甲状腺激素含量发生显著性变化。
Foye等[9]研究显示火鸡胚胎注射HMB后，出壳时和3日龄时血液中INS和INS样生长因子(IGFs，包括IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ)含量均显著升高。此外，给小鼠服用320 mg/(kg·d) HMB可显著提高肝脏IGF-Ⅰ mRNA表达水平和血清中IGF-Ⅰ含量[17]。IGF-Ⅰ具有强的促生长作用，特别是在调控肌肉增殖和分化过程中具有关键性作用。最新研究表明IGF-Ⅰ能够上调肌肉生长决定因子基因肌细胞生成素(MyoG)和生肌调节因子4(MRF4)的表达水平，进而诱导成肌细胞的分化和增殖，并且上调生肌决定因子(MyoD)和生肌因子5(Myf5)表达水平来诱导肌卫星细胞激活[18]。因此，胚蛋给养HMB可能通过增加IGFs的合成进而促进蛋白质的合成，然而本试验未对机体内IGFs含量的变化进行检测，还需要进一步深入研究。
本试验发现，HMB影响肉仔鸡生长发育的主要阶段在生长早期，而试验指标的测定集中在21和42日龄，未能同步跟踪相关代谢变化。动态监测肉仔鸡出雏后IGFs相关生长因子变化以及肌肉蛋白质周转规律，将有助于揭示胚蛋给养HMB影响肉仔鸡肌肉发育的机理，这也将是后续研究工作值得关注的重点。
4 结 论① 胚蛋给养HMB能够明显增加肉仔鸡初生重和早期体重，提高肌肉产量，改善饲料效率。
② 胚蛋给养HMB的促生长作用随肉仔鸡日龄增加而逐渐减弱。
③ 胚蛋给养HMB的促生长作用与血浆甲状腺激素、GH和INS关联不大，需要进一步探究。
④ 胚蛋给养HMB对肉仔鸡的孵化率、器官发育和肌肉品质无显著影响。
| [1] | NISSEN S,KUHLMAN G,ROTH J A.Modulation of ovine lymphocyte function by leucine and leucine metabolites[J]. Amino Acids,1990,86(4):817-820. ( 1)
|
| [2] | TAKO E,FERKET P R,UNI Z.Effects of in ovo feeding of carbohydrates and beta-hydroxy-beta-methylbutyrate on the development of chicken intestine[J]. Poultry Science,2004,83(12):2023-2028. (2)
|
| [3] | UNI Z,FERKET P R,TAKO E,et al.In ovo feeding improves energy status of late-term chicken embryos[J]. Poultry Science,2005,84(5):764-770. (3)
|
| [4] | FOYE O T,UNI Z,FERKET P R.Effect of in ovo feeding egg white protein,beta-hydroxy-beta-methylbutyrate,and carbohydrates on glycogen status and neonatal growth of turkeys[J]. Poultry Science,2006,85(7):1185-1192. (1)
|
| [5] | KORNASIO R,HALEVY O,KEDAR O,et al.Effect of in ovo feeding and its interaction with timing of first feed on glycogen reserves,muscle growth,and body weight[J]. Poultry Science,2011,90(7):1467-1477. (1)
|
| [6] | 乔璇,岳洪源,计峰,等.β-羟基-β-甲基丁酸钙对肉仔鸡生长性能、屠宰性能和血液激素的影响[J]. 中国畜牧兽医,2011,38(8):5-9. (2)
|
| [7] | SMIRNOV A,TAKO E,FERKET P R,et al.Mucin gene expression and mucin content in the chicken intestinal goblet cells are affected by in ovo feeding of carbohydrates[J]. Poultry Science,2006,85(4):669-673. (1)
|
| [8] | BUYSE J,SWENNEN Q,VANDEMAELE F,et al.Dietary β-hydroxy-β-methylbutyrate supplementation influences performance differently after immunization in broiler chickens[J]. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition,2009,93(4):512-519. (1)
|
| [9] | FOYE O T,FERKET P R,UNI Z.The effects of in ovo feeding arginine,β-hydroxy-β-methyl-butyrate,and protein on jejunal digestive and absorptive activity in embryonic and neonatal turkey poults[J]. Poultry Science,2007,86(11):2343-2349. (3)
|
| [10] | FOYE O T,ASHWELL C,UNI Z,et al.The effects of intra-amnionic feeding of arginine and/or β-hyroxy-β-methylbutyrate on jejunal gene expression in the turkey embryo and hatchling[J]. Poultry Science,2009,8(5):437-445. (2)
|
| [11] | MOORE D T,FERKET P R,MOZDZIAK P E.The effect of early nutrition on satellite cell dynamics in the young turkey[J]. Poultry Science,2005,84(5):748-756. (1)
|
| [12] | VASILATOS-YOUNKEN R,SCANES C G.Growth hormone and insulin-like growth factors in poultry growth:required,optimal,or ineffective?[J]. Poultry Science,1991,70(8):1764-1780. (1)
|
| [13] | 王星,吴红专,贺东生,等.鸡生长激素研究进展[J]. 中国家禽,1998,20(10):25-26. (1)
|
| [14] | 陈杰.家畜生理学[M]. 3版.北京:中国农业出版社,2003. (1)
|
| [15] | 李震钟.家畜环境生理学[M]. 北京:中国农业出版社,1995. (1)
|
| [16] | LU J W,MCMURTRY J P,COON C N.Developmental changes of plasma insulin,glucagon,insulin-like growth factors,thyroid hormones,and glucose concentrations in chick embryos and hatched chicks[J]. Poultry Science,2007,86(4):673-683. (1)
|
| [17] | GERLINGER-ROMERO F,GUIMARÃES-FERREIRA L,GIANNOCCO G,et al.Chronic supplementation of β-hydroxy-β-methyl-butyrate (HMβ) increases the activity of the GH/IGF-I axis and induces hyperinsulinemia in rats[J]. Growth Hormone&IGF Research,2011,21(2):57-62. (1)
|
| [18] | LIU H H,WANG J W,ZHANG R P,et al.In ovo feeding of IGF-1 to ducks influences neonatal skeletal muscle hypertrophy and muscle mass growth upon satellite cell activation[J]. Journal of Cellular Physiology,2012,227(4):1465-1475. (1)
|