间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类具有低免疫原性、独特的免疫调节作用和减轻炎症效应的成体干细胞，能在体外大量扩增，还可以作为免疫调节剂在器官移植过程中发挥作用。在畜牧业高速发展的今天，脐带MSCs(UC-MSCs)的移植研究已经引起各国专家学者的关注，而移植UC-MSCs在牛、羊等畜牧生产中的应用及其在动物体内的免疫调节作用鲜见报道，需进一步研究。近几年的研究发现，MSCs在特定条件下具有良好免疫抑制能力^[1]。MSCs可以抑制T淋巴细胞、B淋巴细胞和树突状细胞的增殖及因子分泌，并且在临床上可以减轻移植后移植物抗宿主病(graftversus host disease,GVHD)的发生率^{[2, 3, 4, 5]}。有报道称，移植的骨髓MSCs能保护受损组织，降低自由基的含量，提高抗氧化酶的活性^{[6, 7]}。鲁刚^[8]研究表明，移植UC-MSCs能够参与炎症组织的细胞迁移，对早期重度烧伤动物具有较好的保护效应，并通过促进宿主自身细胞增殖修复损伤组织。尽管之前报道的UC-MSCs在人、鼠的临床治疗领域有很广阔的应用前景，但在牛、羊及畜牧生产上应用和研究报道很少，所以本试验对健康荷斯坦公犊进行UC-MSCs移植，探讨其对公犊血清免疫和抗氧化水平的影响，为进一步研究UC-MSCs的移植特性提供试验依据，同时也为UC-MSCs在畜牧生产中的应用提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 试验设计

选取年龄、体重相近荷斯坦公犊28头，分为2组，每组14头，采集2头新生胎牛的脐带组织，无菌环境下用2只镊子分别夹住脐带边缘，小心的撕去脐带外膜，再去除血管，获得华尔通氏胶，用含1%青霉素-链霉素的磷酸盐缓冲液(PBS)反复漂洗华尔通氏胶。将组织块剪成1 mm³大小，转移至无菌离心管中，加入多重消化酶，同时加入青霉素、链霉素、硫酸庆大霉素和两性霉素B，置于培养箱内1 h左右。消化结束后，0.22 μm过滤，2 000 r/min离心20 min，弃上清后加入PBS重悬，室温下1 200 r/min离心10 min，用10%胎牛血清(FBS)完全培养基再次重悬，转移至T75培养瓶中，记为P0代细胞，置于37 ℃、5% CO₂培养箱培养，培养成功的UC-MSCs进行传代、冻存、复苏，茜素红染色检测其体外诱导成骨分化能力，油红O染色法检测其体外诱导成脂能力，取可诱导分化为成脂、成骨细胞的UC-MSCs按3×10⁵个/kg BW(稀释至8 mL)颈静脉注射至公犊体内，对照组注射等量生理盐水分别与1、2、3、4、5月龄各注射1次，共5次。试验期150 d。 1.2 基础饲粮与饲养管理

基础饲粮参照NRC(1997)犊牛营养需要标准配制，其组成及营养水平见表1。饲养试验于2013年7月16日至2013年12月17日在新疆维吾尔自治区昌吉市思源村胜利一队牛养殖场进行。2组牛在同一栏由同一饲养员饲养，试验组和对照组牛饲粮组成、营养水平和管理条件均相同，每天在08：00、15：00和22：00饲喂，自由饮水。试验期间，保持圈舍通风、卫生、干燥，营造舒适的环境条件，每天观察牛的健康状况。 1.3 样品采集与处理

分别于1、2、3、4、5、6月龄时对每头公犊空腹颈静脉采集血液5 mL，3 500 r/min离心15 min，收集血清-20 ℃保存。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) % 项目 Items 含量 Content 原料 Ingredients 玉米 Corn 48.00 玉米纤维 Corn fiber 4.00 豆粕 Soybean meal 26.00 玉米蛋白粉 Corn gluten meal 2.80 麦芽根 Malt root 5.00 玉米干酒糟及其可溶物 Corn DDGS 5.00 酵母粉 Yeast powder 1.10 石粉 Limestone 1.10 磷酸氢钙 CaHPO4 1.50 酸化剂 Acidulant 0.15 糖 Sugar 2.00 乳清粉 Whey powder 1.60 食盐 NaCl 0.65 赖氨酸 Lysine(98%) 0.10 预混料 Premix1) 1.00 合计 Total 100.00 营养水平 Nutrient levels2) 干物质 DM 87.01 粗蛋白质 CP 18.15 净能 NE/(MJ/kg) 3.65 粗脂肪EE 3.20 粗灰分 Ash 9.00 粗纤维 CF 8.03 钙 Ca 1.21 磷 P 0.64 1)预混料为每千克饲粮提供Premix provided the following per kg of the diet：VA 2 240 IU,VD 275 IU,VE 24 IU,Zn 32 mg,Fe 50 mg,Cu 8 mg,Mn 40 mg,I 0.32 mg,Co 0.10 mg,Se 0.22 mg。 2)实测值Measured values。

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis)

分别于1、2、3、4、5、6月龄进行空腹称重，并计算公犊平均日增重。 1.4.2 血清免疫和抗氧化水平测定

免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素6(IL-6)、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性均委托北京华英生物有限公司进行测定。 1.5 数据分析

试验数据用SPSS 18.0进行单因素方差分析，用独立样本t检验进行差异显著性分析，结果用平均值±标准差表示，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。 2 结 果 2.1 移植UC-MSCs对公犊体重的影响

由表2可知，试验组公犊体重在1、2、3月龄时与对照组相比差异不显著(P＞0.05)，4、5、6月龄时较对照组分别提高3.71、4.57和9.22 kg，差异显著(P＜0.05)。试验组公犊平均日增重在2、5月龄时与对照组相比差异不显著(P＞0.05)，3、4 月龄时显著高于对照组(P＜0.05)，而在6月龄时 极显著高于对照组(P＜0.01)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 移植UC-MSCs对公犊体重、平均日增重的影响 Table 2 Effects of UC-MSCs transplantation on BW and ADG of bull calves 项目 Items 组别 Groups 月龄 Month of age 1 2 3 4 5 6 体重 对照 Control 53.64±2.86 73.00±2.99 93.81±2.83 116.68±3.59b 137.79±3.22b 160.07±3.68b BW/kg 试验 Test 52.96±2.93 73.54±2.71 94.44±2.55 120.39±3.29a 142.36±2.94a 169.29±2.54a 平均日增重 对照 Control 650.00±0.11 690.00±0.09b 762.30±0.87b 703.70±0.03 742.70±0.05B ADG/g 试验 Test 690.00±0.12 700.00±0.03a 865.00±0.12a 732.30±0.05 897.70±0.04A 同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)。下表同。 Values in the same column with different small letter superscripts mean significant difference (P＜0.05),and with different capital letter superscripts mean significant difference (P＜0.01). The same as below.

表2 移植UC-MSCs对公犊体重、平均日增重的影响 Table 2 Effects of UC-MSCs transplantation on BW and ADG of bull calves

由表3可知，移植UC-MSCs 2月龄时试验组血清IgG含量极显著高于对照组(P＜0.01)；4月龄时试验组血清IgA含量极显著高于对照组(P＜0.01)；5月龄时，试验组血清IgG含量极显著高于对照组(P＜0.01)；6月龄时，试验组血清IgA、IgG含量均显著高于对照组(P＜0.05)。其他月龄时表现差异不显著(P＞0.05)。移植UC-MSCs试验组血清IL-2含量在3月龄极显著低于对照组(P＜0.01)；4月龄时，试验组血清IL-2含量显著低于对照组(P＜0.05)；其他各月龄血清IL-1、IL-2和IL-6含量均差异不显著(P＞0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 移植UC-MSCs对公犊血清免疫水平的影响 Table 3 Effects of UC-MSCs transplantation on serum immune levels of bull calves 项目 Items 组别 Groups 月龄 Month of age 1 2 3 4 5 6 免疫球蛋白A 对照 Control 0.57±0.13 0.70±0.15 0.80±0.15 0.71±0.15B 0.72±0.17 0.72±0.09b IgA/(mg/mL) 试验 Test 0.72±0.16 0.67±0.13 0.77±0.12 0.81±0.09A 0.70±0.12 0.86±0.16a 免疫球蛋白M 对照 Control 2.07±0.41 2.45±0.36 2.72±0.17 2.66±0.29 2.59±0.35 2.75±0.24 IgM/(mg/mL) 试验 Test 2.48±0.36 2.42±0.40 2.72±0.16 2.75±0.24 2.69±0.28 2.81±0.26 免疫球蛋白G 对照 Control 10.27±1.62 10.90±1.76B 10.18±1.14 10.35±1.14 10.57±0.60B 9.51±1.01b IgG/(mg/mL) 试验 Test 9.66±1.01 11.33±1.52A 9.81±1.09 10.13±0.95 11.36±1.34A 10.46±1.51a 干扰素γ 对照 Control 57.36±12.73 45.23±13.63 55.59±13.25 50.74±11.51 53.12±13.75 60.93±16.37 IFN-γ/(pg/mL) 试验 Test 56.88±18.26 58.63±15.09 55.32±14.46 49.66±15.02 58.56±12.67 56.17±19.51 白细胞介素1 对照 Control 2.53±0.61 2.47±0.35 2.30±0.26 2.42±0.81 1.88±0.35 1.91±0.55 IL-1/(pg/mL) 试验 Test 2.61±0.68 2.43±0.55 2.33±0.33 2.31±0.64 1.70±0.35 2.05±0.53 白细胞介素2 对照 Control 32.35±2.49 39.52±6.00 40.41±5.60B 39.84±6.46b 34.95±4.85 37.84±6.24 IL-2/(pg/mL) 试验 Test 35.44±3.51 41.82±5.34 36.59±3.06A 37.40±4.58a 36.21±5.84 40.73±4.65 白细胞介素6 对照 Control 153.26±22.42 136.93±24.86 151.07±29.58 121.60±12.58 129.73±28.25 118.94±13.90 IL-6/(pg/mL) 试验 Test 160.84±46.75 153.30±22.22 148.20±33.17 117.89±14.68 132.43±17.46 124.91±19.30

表3 移植UC-MSCs对公犊血清免疫水平的影响 Table 3 Effects of UC-MSCs transplantation on serum immune levels of bull calves

由表4可知，5月龄时，试验组血清SOD活性显著高于对照组(P＜0.05)；6月龄时，试验组血清 SOD活性极显著高于对照组(P＜0.01)；其他月龄 时表现差异不显著(P＞0.05)。在整个试验期，移植UC-MSCs的试验组血清MDA含量均低于对照组血清MDA含量，2~6月龄差异极显著(P＜0.01)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 移植UC-MSCs对公犊血清抗氧化水平的影响 Table 4 Effects of UC-MSCs transplantation on serum antioxidant levels of bull calves 项目 Items 组别 Groups 月龄 Month of age 1 2 3 4 5 6 丙二醛 对照 Control 4.78±1.80 4.83±1.82B 4.04±1.39B 4.45±1.79B 3.86±0.44B 3.71±0.26B MDA(nmol/mL) 试验 Test 4.01±1.25 3.67±1.05A 3.77±1.10A 3.84±0.51A 3.41±1.00A 3.18±0.69A 超氧化物歧化酶 对照 Control 55.56±2.67 69.12±4.27 75.43±6.70 82.40±4.34 103.19±8.41b 91.43±17.70B SOD(U/mL) 试验 Test 58.80±3.80 72.68±3.56 76.21±5.07 89.67±7.27 107.48±6.12a 101.73±6.20A

表4 移植UC-MSCs对公犊血清抗氧化水平的影响 Table 4 Effects of UC-MSCs transplantation on serum antioxidant levels of bull calves

本试验中，试验组公犊体重在4、5、6月龄时均显著高于对照组；试验组平均日增重在3、4月龄时显著高于对照组，试验组平均日增重在4月龄时较对照组增加102.7 g，提高了13.47%，而在6月龄时，试验组平均日增重极显著高于对照组，较对照组提高了20.87%。说明移植UC-MSCs可以促进公犊的生长。有报道指出，当MSCs注射到胚胎或新生动物体内，它们可以迁移分化并产生多种不同的细胞类型^{[9, 10]}；沈君等^[11]采用静脉注射MSCs的方法处理大脑创伤的大鼠，移植7 d后发现注射侧大脑半球MSCs的沉积率明显高于对侧，且干细胞主要存在于损伤区域边缘。马晓伟等^[12]研究表明，注射骨髓MSCs可促进大鼠的蛋白质沉积和合成，对其增重产生影响。邵伟^[13]研究发现，移植UC-MSCs 2个月后可显著提高试验绵羊的平均日增重。本试验注射UC-MSCs 3个月后，它在犊牛体内可能定植于某些组织器官中，发挥其迁移归巢特性，将其分泌的各种细胞因子及生长因子根据机体内环境需要归巢到不同组织中，在增加公犊体重和平均日增重上发挥了更大的潜能，加快了试验组公犊的生长发育速度。因此可以说注射UC-MSCs在提高犊牛生产性能方面是一种新型的方法，具有广阔的应用前景，但本试验不足以阐明其真正的分化和促生长机制，尚需进一步研究证明。 3.2 移植UC-MSCs对荷斯坦公犊血清免疫水平的 影响 3.2.1 移植UC-MSCs对荷斯坦公犊血清IgA、IgG、IgM含量的影响

本试验中，移植UC-MSCs后试验组公犊血清IgM、IgA、IgG含量升高。2月龄时，试验组血清的IgG含量极显著高于对照组，IgG是血清免疫球蛋白的主要成分，它占总的免疫球蛋白的75%，说明注射UC-MSCs能够增强其血清免疫力。已有研究报道，体外条件下，MSCs对淋巴细胞增殖有明显的抑制作用，但浓度较低时反而促进其增殖，并可促进免疫球蛋白的分泌^[14]。在血和脾的淋巴细胞中，MSCs会轻微增加IgG和IFN-γ的产量^[15]。这与本试验结果一致。但大量的体外试验证明，MSCs在受到某些细胞因子的刺激后对淋巴细胞的增殖和分化具有很强的抑制作用；而MSCs在自身免疫性疾病中的临床治疗效果也证明MSCs对淋巴细胞具有免疫抑制作用，可抑制免疫球蛋白的分泌^{[16, 17]}。这与本试验结果不符，一方面可能是因为本试验是在体内进行，与体外试验条件的简单和可控因素相比，体内特别是发生炎症的机体内微环境相对比较复杂，影响因素繁多；另一方面因为本试验是同种异体移植，与自体移植效果存在差异，可能是同种异体组织和UC-MSCs的共移植导致免疫应答，对B淋巴细胞的免疫调节作用发生改变，从而使免疫球蛋白分泌增加，但其具体调节机制还不完全清楚，尚需进一步研究。 3.2.2 移植UC-MSCs对荷斯坦公犊血清IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-6含量的影响

本试验中，2~4月龄时，试验组血清IFN-γ含量均低于对照组，且持续下降。这表明UC-MSCs可以降低IFN-γ含量，促进体内炎症缓解，稳定机体的免疫环境。研究表明，MSCs除了影响巨噬细胞的分泌因子谱，即降低促炎因子的分泌、提高抗炎因子的分泌之外，也提高了巨噬细胞对凋亡细胞的清除能力，促进炎症的缓解^[18]。也有报道证实,移植的MSCs对大鼠受损组织有保护作用,能显著减少促炎因子含量,减轻炎症反应程度^{[19, 20]}。这与本试验结果一致。

试验结果表明，4月龄时，试验组血清IL-2含量极显著低于对照组，5月龄时，试验组血清IL-2含量也显著低于对照组，表明试验组注射UC-MSCs可降低IL-2含量，进而减少体内组织毒性反应，提高机体免疫水平。移植的UC-MSCs对主要由辅助性T淋巴细胞分泌的IL-6含量并无显著影响，有试验表明，MSCs只能抑制T细胞的增殖，但对T细胞的活性并无显著作用^[16]。 3.3 移植UC-MSCs对荷斯坦公犊血清抗氧化水平的影响

本试验中，公犊1月龄时，试验组和对照组血清MDA含量、SOD活性差异不显著；移植UC-MSCs后，2~6月龄整个试验组血清MDA含量明显下降，且均极显著低于对照组，而试验组血清SOD活性均高于对照组，在6月龄时表现差异极显著。这表明移植UC-MSCs能显著降低血清MDA含量，提高SOD活性，增强机体清除自由基的能力。有试验证明，BMSCs能降低肾脏辐射损伤大鼠血清MDA含量，提高SOD活性^{[21, 22]}，这与本试验结果相似。说明UC-MSCs可能通过降低自由基的产生，提高抗氧化酶活性，增强机体清除自由基的能力，减轻细胞及组织的损伤程度。但移植UC-MSCs作为一种新颖有效的治疗途径，在畜牧业的实际应用中还有许多亟待解决的问题，如UC-MSCs的移植途径、最佳注射剂量及时间和远期的效果及安全性等仍需进一步探究。 4 结 论

① 移植UC-MSCs能提高公犊的体重和平均日增重，加快试验公犊的生长发育速度，提高其生长性能。

② 移植UC-MSCs能促进公犊血清免疫球蛋白IgA、IgG分泌，提高公犊机体免疫力，有利于公犊的健康生长。

③ 移植UC-MSCs能大幅度降低公犊血清炎症因子IL-2含量，减少体内炎症发生。

④ 移植UC-MSCs能够显著降低公犊血清MDA含量，提高SOD活性，增强机体清除自由基的能力。