肌醇又称环己六醇，是一种水溶性维生素，在脂肪代谢中起到重要作用，能阻止脂肪的过度积累，保护肝脏健康。肌醇可由机体合成，主要合成部位是动物的肝脏、肾脏、大脑和睾丸^[1,2,3,4,5]。肌醇是细胞膜磷脂的一种组成成分，在医药及保健领域中都有很重要的作用^[6]，体内肌醇含量还会对葡萄糖和蔗糖浓度产生显著影响^[7]。在饲料中添加肌醇对鱼类的主要作用表现为提高饲料利用率，促进肝脏和其他组织中的脂肪代谢，增强鱼类的抗氧化能力，提高生长性能。当饲料肌醇含量过低时会影响水生动物的正常生长，易出现厌食、皮肤受损伤等症状^[8]。目前，有关肌醇缺乏或过量引起的组织病理学研究较少，仅见于建鲤^[9]。

哲罗鲑隶属于鲑形目(Salmoniformes)，鲑科(Salmonidae sp.)，鲑亚科(Salmoninae)，哲罗鱼属(Hucho)。哲罗鲑属大型名贵鱼类，个体较大者体重可达50 kg以上，适合栖息在水温20 ℃以下湍急的溪流里，生长速度较快，具有较高的经济价值。哲罗鲑为冷水性鱼类，主要分布区域为俄罗斯、蒙古，以及我国黑龙江的呼玛河、乌苏里江上游及新疆的哈纳斯湖，近年来由于生态环境遭到破坏，资源量逐年下降，现已被列入《中国濒危动物红皮书：鱼类》^[10]。目前，该鱼的驯化养殖已获得成功^[11]，在我国十几个省市(如黑龙江、吉林、山东等)逐步开始推广养殖。有关哲罗鲑肌醇需要量的研究已见报道^[12]，但尚无肌醇对哲罗鲑的组织病理学研究。因此，本试验拟在饲料中添加不同剂量的肌醇，探讨肌醇对哲罗鲑组织病理学的影响，以及通过对哲罗鲑肝脏超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的测定来评定肌醇对哲罗鲑抗氧化能力的影响，旨在为该鱼的营养性研究提供基础性资料，并为哲罗鲑的推广养殖提供理论依据和指导。 1 材料与方法 1.1 试验材料

肌醇购自美国Sigma公司，纯度≥99%。

选择平均体重为(2.83±0.44) g健康的哲罗鲑630尾，随机分至21个养殖槽(40 cm×30 cm×30 cm)内，每槽30尾。 1.2 试验设计与试验饲料

试验共设7个组，每个组3个重复(养殖槽)，每个重复30尾鱼。参照文献^[13]的营养标准，以酪蛋白、明胶、鱼粉为蛋白质源，以鱼油为脂肪源，以糊精为糖源配制基础饲料。基础饲料中肌醇含量为99.8 mg/kg，在基础饲料中分别添加0、100、200、400、600、800和5 000 mg/kg的肌醇，由基础饲料中肌醇含量加实际肌醇添加量，计算推测各试验饲料肌醇含量应分别为99.8、199.8、299.8、499.8、699.8、899.8和5 099.8 mg/kg。基础饲料组成及营养水平见表 1。饲料原料粉碎后过60目筛，制成粒径为1.0 mm的颗粒料，自然风干，于-20 ℃冰箱中保存。 1.3 饲养管理

试验鱼以商用饲料预饲7 d，试验正式开始前饥饿24 h。流水[流速(0.3~0.4)×10^-3 m³/h]饲养，养殖期间水温9.5~15.2 ℃，溶氧浓度＞8.0 mg/L，pH为7.5~7.8。每天投喂4次，分别在07:00、10:30、14:00和17:00饱食投喂，以吃饱而没有剩料为原则，各组的投喂量尽量保持一致。每2周称1次体重，以调整投喂量。试验期为8周。 1.4 样品采集

试验结束后，鱼体饥饿24 h后，每个养殖槽随机取3尾鱼于冰盘上解剖，取出肝脏，去除肠道脂 肪 和内含物，用预冷生理盐水(0.86%氯化钠溶 液)洗净，用滤纸吸干表面水分后称重。加入9倍体积的预冷生理盐水，冰水浴中用高速组织匀浆机匀浆，4 ℃条件下3 500 r/min离心10 min，取上清液作为肝脏组织粗酶液，置于-80 ℃冰箱中保存待测。另在99.8、499.8、5 099.8 mg/kg组各养殖槽中随机取1尾鱼，取其前肠、肝脏，置于Bouin氏液中固定，待做石蜡组织切片。

表 1

Table 1

表 1(Table 1)

表 1 基础饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % 项目 Items 含量 Content 原料 Ingredients 酪蛋白 Casein 34.00 鱼粉 Fish meal 23.00 明胶 Gelatin 10.00 糊精 Dextrin 20.00 鱼油 Fish oil 6.30 大豆卵磷脂 Soybean lecithin 2.00 磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)2 1.00 羧甲基纤维素钠 CMC-Na 2.60 矿物质预混料 Mineral premix1) 0.20 维生素预混料 Vitamin premix2) 0.30 添加剂 Additive3) 0.60 合计 Total 100.00 营养水平 Nutrient levels 粗蛋白质 CP 52.3 粗脂肪 EE 7.2 肌醇 Myo-inositol/(mg/kg) 99.8 1)维生素预混料为每千克饲料提供The vitamin premix provides the following of the diet：VK 5 mg，VA 15 000 IU，VD3 3 000 IU，VB1 15 mg，VB2 30 mg，VB6 15 mg，VB12 0.5 mg，VC 1 000 mg，VE 60 mg，烟酸 nicotinic acid 175 mg，叶酸 folic acid 5 mg，生物素 biotin 2.5 mg，泛酸钙 calcium pantothenate 50 mg。 2)矿物质预混料为每千克饲料提供The mineral premix provides the following of the diet:Fe (as ferrous sulfate) 25 mg，Cu (as copper sulfate) 3 mg，Mn (as manganese sulfate) 15 mg，I (as potassium iodide) 0.6 mg，Zn (as zinc sulfate) 60 mg。 3)添加剂为每千克饲料提供The additive provides the following per kg of the diet：氯化胆碱 choline chloride 2 g，防霉剂 antimildew 0.5 g,MgO 2 g,抗氧化剂 antioxidant 0.5 g,二甲基-β-丙酸噻亭(诱食剂) DMPT (feed attractant) 1 g。

表 1 基础饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

SOD活性、MDA含量均采用试剂盒进行测定，试剂盒为南京建成生物工程研究所生产，操作严格按照试剂盒说明进行。

SOD活性具体测定方法为黄嘌呤氧化酶法，其原理是通过黄嘌呤及其氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度；当样品中含有SOD时，则对超氧阴离子自由基专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值。SOD活性单位定义为每毫克组织蛋白质在1 mL反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为1个SOD活性单位(U)。

MDA含量具体测定方法为硫代巴比妥酸(TBA)法，其原理是过氧化脂质降解产物中的MDA可与TBA结合，形成红色产物，在532 nm处有最大吸收峰。 1.6 石蜡组织切片的制作

将固定于Bouin氏液中的肠道、肝脏组织块进行石蜡包埋切片，苏木精-伊红(HE)染色，普通光学显微镜下观察组织器官的病理学变化。 1.7 统计分析

试验结果以平均值±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，差异显著水平为P<0.05。 2 结果与分析 2.1 肌醇对哲罗鲑肝脏抗氧化指标的影响

由表 2可知，肝脏SOD活性基本表现为随肌醇含量的增加而先升高后降低，在899.8 mg/kg组达到峰值(97.95±10.45) nU/mg prot，过量添加肌醇组即5 099.8 mg/kg组SOD活性最低，且显著低于699.8和899.8 mg/kg组(P<0.05)；肝脏MDA含量随饲料中肌醇含量的增加呈先降低后升高趋势，最低值出现在499.8 mg/kg组，含量超过499.8 mg/kg时又有所增加，不额外添加肌醇组即99.8 mg/kg组MDA含量最高，且最高组与最低组之间差异显著(P<0.05)。

表 2

Table 2

表 2(Table 2)

表 2 肌醇对哲罗鲑肝脏抗氧化指标的影响 Table 2 Effects of myo-inositol on liver antioxidant indices of Hucho taimen 肌醇含量 Myo-inositol content/(mg/kg) 超氧化物歧化酶 SOD/(nU/mg prot) 丙二醛 MDA/(nmol/mg prot) 99.8 79.83±9.87ab 9.21±2.19c 199.8 72.10±7.44a 8.34±1.90c 299.8 81.21±10.76abc 6.55±0.39abc 499.8 83.41±6.88abc 4.25±1.16a 699.8 95.26±7.54bc 7.59±2.20bc 899.8 97.95±10.45c 5.25±1.01ab 5 099.8 70.84±11.08a 5.25±1.01ab 同列数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。 In the same column,values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P＞0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P＜0.05).

表 2 肌醇对哲罗鲑肝脏抗氧化指标的影响 Table 2 Effects of myo-inositol on liver antioxidant indices of Hucho taimen

由图 1可知，饲料中肌醇含量为499.8 mg/kg时哲罗鲑处于较好的生长状态，肠道褶皱高且细，排列紧密；当饲料中肌醇含量过低(99.8 mg/kg)或过高(5 099.8 mg/kg)时，均表现出肠褶皱宽而短，排列较为稀疏，且肠道褶皱出现断裂。 2.2.2 哲罗鲑肝脏的组织病理学观察

由图 2可知，饲料中肌醇含量为499.8 mg/kg时肝细胞结构清晰，排列紧密规则，细胞轮廓清晰有秩；当饲料中肌醇含量过低(99.8 mg/kg组)或过高(5 099.8 mg/kg组)时，均表现出细胞萎缩，排列疏松，空隙较明显，有空泡形成，肝细胞组织颗粒变性，细胞核靠近边缘，细胞堆积，细胞轮廓变模糊。

图 1(Figure 1)

Fig. 1

A、B、D处肠道褶皱宽而短，且排列疏松；C处肠道褶皱断裂；E处肠道黏膜肌层断裂。 A,B and D indicate that intestinal mucosa becomes shorter and wider,and the arrangement turns degeneration; C indicates that intestinal mucosa becomes rupture; E indicates that muscularis mucosae becomes rupture. 图 1 肠道组织病理学观察 Fig. 1 The histopathological observation of intestine (100×)

图 2(Figure 2)

Fig. 2

K处肝细胞界限模糊；F处细胞核位于细胞边缘；G、H、I、J处肝细胞萎缩，空泡变性，排列疏松，空隙较明显。 K indicates that the gap of cells is obvious; F indicates that nucleus are squeezed out to the cell edge; G,H,I and J indicate that liver cells atrophy,vacuolation degeneration,loosely arrangement,intercellular space increase. 图 2 肝脏组织病理学观察 Fig. 2 The histopathological observation of liver (400×)

动物细胞的正常代谢需要氧化与抗氧化水平处于动态平衡^[14]，在正常代谢情况下会有少量活性氧物质产生，为避免活性氧物质造成的氧化胁迫，体内的抗氧化酶系统能够有效地将活性氧物质清除^[15]。SOD是清除氧自由基过程中重要的抗氧化酶^[16]，能够将超氧阴离子还原成H₂O₂，以达到解毒的目的^[17]。当动物体内自由基过多时，自我清除能力已不能满足需要，机体就会产生氧化压力，甚至造成氧化损伤^[18]，过多的自由基会与多不饱和脂肪酸相互作用，发生脂质过氧化反应^[14]。MDA是脂质过氧化过程中最重要的产物之一，其会影响机体正常的物质代谢、信息传递和能量代谢^[19]。细胞内的SOD活性和MDA含量在一定程度上能反映出机体的抗氧化水平和脂质过氧化进程^[20]，同时MDA也可反映出细胞氧化损伤程度^[21]。本研究结果与姜维丹等^[9]的研究结果相一致，即饲料中肌醇含量适当能促进氧化与抗氧化水平的平衡，使肝脏SOD活性保持在较高的水平，一方面能使氧自由基的产生量相应降低，另一方面又有助于氧自由基的清除，避免了过多的过氧化反应。饲料中肌醇含量过低时肝脏MDA含量较高的可能原因是少量的肌醇不足以满足体内脂肪代谢所需，致使脂肪代谢紊乱而造成氧化损伤^[22]。肝脏中肌醇含量的过低使肝脏的正常发育受到一定程度的影响，脂肪代谢处于失调状态，导致肝脏中的脂肪不能通过转脂蛋白及时转移至各组织，造成脂肪在肝脏中的不正常堆积，过多的脂肪在肝脏内发生过氧化作用，产生较多的MDA。但当肌醇含量过高时，因为肌醇能促进脂肪的代谢，而使哲罗鲑体内脂肪代谢过度，造成一定的代谢负担，体内代谢紊乱，致使抗氧化水平与氧化水平失调，机体抗氧化水平降低。 3.2 哲罗鲑肠道的组织病理学观察

鱼类是较低等的脊椎动物，肠道组织虽与陆生动物相似，但却不及陆生动物发达，肠褶皱的密度、高度及排列状态可反映出鱼类肠道的消化吸收能力。哲罗鲑为肉食性鱼类，有胃，其肠道为无盘曲直行肠，较短，肠黏膜表面有许多褶皱，从而有效扩大了肠道表面积，有利用对营养物质的吸收利用。本试验观察到，饲料中肌醇含量过低或过高均会导致肠道褶皱宽而短，排列疏松，甚至出现断裂，肠道上皮细胞脱落、坏死。肌醇缺乏时姜维丹等^[21]观察到幼建鲤的肠道上皮细胞脱落坏死，肠道受损，在沙鼠^[23]也出现了这种情况；此外，还观察到肠道黏膜出现病变而脱落，严重者甚至会出现肠褶皱断裂，失去其原有的吸收功能，肠腔内出现较多的炎性渗出物、由病变而脱落坏死的上皮细胞，黏膜下层出现疏松现象，有的表现出水肿^[9]。在对草虾的研究中得出，随饲料中肌醇含量的增加，肠腺指数有了较为明显的提高，缺乏肌醇组过多的脂质会在中肠腺堆积^[24]。其可能原因是由于肌醇的缺乏影响到了乳糜颗粒的组装，致使脂肪的转运受到阻碍，从而导致脂肪的非正常积累，进而使肠道受到损伤，出现以上症状。肠道的不正常发育会影响鱼类对营养物质的吸收和利用，进而影响鱼体的生长性能。 3.3 哲罗鲑肝脏的组织病理学观察

肝脏是脂肪代谢的最重要器官，肌醇含量缺乏会导致低密度脂蛋白的合成和分泌不足，致使肝细胞中甘油三酯不能正常排出而出现过度积累，脂肪的正常代谢受到阻碍，导致脂肪在肝脏内含量过高，肝脏出现不同程度的病理学特征，进而引发脂肪肝^[25]。另外，由于肝脏代谢异常，使肝脏组织结构的网状支架破坏，一些细胞核堆到一起，肝细胞不能进行正常的脂肪代谢，发生组织病变，导致生长性能下降。本试验观察到，饲料中肌醇含量过低或过高时，肝脏均表现出空泡变性，肝脏细胞轮廓模糊。 4 结 论

① 饲料中肌醇含量为299.8～899.8 mg/kg时哲罗鲑的抗氧化能力较高。

② 饲料中肌醇含量过低或过高时，肝脏、肠道均不能正常健康发育，甚至出现不同程度病变，阻碍了组织器官正常功能的发挥。