灌木是我国宝贵的植物资源，具有极强的抗逆性能和饲料生产能力，在荒漠地带及高寒阴湿山地不仅具有特殊的生态学意义，而且具有很高的饲料开发利用价值^[1]。沙柳是杨柳科柳属的一种落叶灌木或小乔木，是广泛分布于我国北方沙漠地区的一种多功能综合性树种，其嫩枝鲜叶的营养价值很高，是极具开发潜力的非常规粗饲料资源。如果能将沙柳通过发酵转变为能够被反刍动物利用的新型发酵饲料，将对促进我国的草地生态治理和解决粗饲料资源不足等问题具有重要意义。目前，对沙柳的研究只停留在营养成分的测定^[2,3,4,5]，而对沙柳进行发酵处理的研究鲜有报道。多年来，人们从生物学、生态学等方面^[6,7,8]对沙柳进行了深入研究，但其加工利用方面研究很少，尤其是调制发酵饲料，国内外尚未见到有关的研究报道，其潜在的饲用价值尚未被充分认识和开发利用。鉴于此，本试验结合实际，采用混合发酵技术，探讨贮藏时间对沙柳混合发酵饲料营养成分及体外消化率的影响，为沙柳的利用开辟新途径。 1 材料与方法 1.1 试验材料

发酵原料：沙柳(取自内蒙古锡林郭勒盟正镶白旗，2013年9月中旬刈割)、玉米粉、糖蜜、土豆渣、混合草、预混料、石粉、食盐。

复合菌剂：由枯草芽孢杆菌、乳酸菌、细菌生长促进剂及载体等多种成分组成，活菌数≥5×10⁷ CFU/g，由内蒙古奥德威生物技术有限责任公司生产。 1.2 发酵饲料的调制

将新鲜收割的沙柳用揉丝机揉成3～4 cm的丝段，按不同沙柳比例分为2组混合发酵饲料，分别用FF1和FF2表示(表 1)。将活化的复合菌剂均匀喷洒到混合好的原料中，添加量为每100 g混合发酵饲料中添加0.2 g，使各组初始活菌数量达到1×10⁵ CFU/g。然后以每袋500 g装入聚乙烯真空袋中，用真空封口机抽真空并封口，室温(白天15～24 ℃，夜间-2～13 ℃)下避光存放。

表 1

Table 1

表 1(Table 1)

表 1 发酵饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of fermented feeds (DM basis) % 项目Items 含量 Content FF1 FF2 原料 Ingredients 沙柳 Salix 36.44 67.08 玉米粉 Corn flour 10.29 18.72 甜菜糖蜜 Beet molasses 4.72 7.48 土豆渣(湿样) Potato residue (wet)1) 41.64 混合草 Mixed grass 5.14 6.18 预混料 Premix2) 0.78 石粉 Limestone 0.45 食盐 NaCl 0.34 0.34 菌种 Strains 0.20 0.20 合计 Total 100.00 100.00 营养水平 Nutrient levels3) 代谢能 ME/(MJ/kg) 8.95 8.86 粗蛋白质 CP 7.16 7.27 钙 Ca 1.15 1.22 磷 P 0.16 0.14 1)土豆渣若为干粉末，按照9.84%计算。If potato residue for dry powder,calculated in accordance with 9.84%. 2)预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of diets：VA 1 000 000 IU，VD3 500 000 IU，VE 2 000 IU，烟酸 nicotinic acid 1 000 mg，Cu 4.5 g，Fe 6 g，Mn 4 g，Zn 8 g，I 80 mg，Co 40 mg。 3)营养水平参考文献[9]的方法计算。Nutrient levels were calculated according to the method in reference [9]

表 1 发酵饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of fermented feeds (DM basis)

分别在贮藏1、3、5、7、10、12、15、22、30、45和60 d时开封，每个取样时间设置3个重复，在65 ℃下进行烘干，粉碎后进行各营养成分的测定。干物质(DM)含量参照张丽英^[10]的方法测定；粗蛋白质(CP)含量采用FOSS公司全自动凯氏定氮仪测定；粗脂肪(EE)含量参照GB/T 6433—2006测定；中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)和酸性洗涤木质素(ADL)含量采用ANKOM A200纤维分析仪测定；有机物(OM)含量参照GB/T 6438—2007测定；可溶性碳水化合物(WSC)含量采用蒽酮-硫酸法测定^[11]。 1.4 营养物质体外消化率的测定

采用一级离体消化试验法，人工瘤胃培养液的配制参照Tilley等^[12]的方法。

选取4只体重(40±1) kg且安装永久性瘤胃瘘管的内蒙古半细毛成年羯羊，用于瘤胃内容物的采集。基础饲粮由精料和青干草组成，精粗比30 ∶ 70，自由饮水，单笼饲养。

采用生理盐水瓶(250 mL)作为发酵瓶，准确称取风干样品2.0 g放入尼龙袋(尺寸为110 mm×80 mm，孔径为400目)中，然后把尼龙袋放入生理盐水瓶里，每个样品3个重复，每次设3个空白，在39 ℃恒温水浴锅中预热。然后向每个培养瓶中加240 mL培养液(瘤胃液和人工瘤胃培养液的混合物，体积比为1 ∶ 2)；向溶液中持续通入CO₂，使溶液和瓶内空间充满CO₂。然后盖上带有放气阀门的橡皮塞，密闭。放入39 ℃恒温水浴摇床中培养24 h。然后测定样品培养后的DM、OM、CP、NDF和ADF含量，测定方法同1.3，并计算各自的消化率。 某营养物质体外消化率(%)=[样品重(g)×样品中某营养成分含量(%)]-[残渣重(g)×残渣中某营养成分含量(%)]/样品重(g)×样品中某营养成分含量(%) 。 1.5 浓缩效应

发酵饲料在发酵过程中存在着物质和能量的转换和消耗^[13]。现实中，发酵原料经发酵后的回收率并不是100%，在发酵过程中原料有一定的损失。在发酵初期，微生物的呼吸作用要消耗一部分原料。由于物料的损失，即使发酵物中的各营养物质总量未有增加，但各营养物质在物料中的百分含量也将被提高，这就出现了“浓缩效应”^[14]。因此，在结果计算中应扣除“浓缩效应”带来的影响。 1.6 数据处理与分析

数据统计方式利用Excel软件处理基础数据并制作图表，用SAS 9.1.3软件中的GLM过程进行方差分析，多重比较采用Duncan氏法。 2 结果与分析 2.1 贮藏时间对沙柳混合发酵饲料营养成分的影响

由表 2可知，随着贮藏时间的延长，DM含量显著下降(P<0.000 1)；FF1组和FF2组DM含量分别在贮藏的第12天和第30天后保持相对稳定(P>0.05)。在经过60 d的贮藏，FF1组和FF2组DM含量分别为42.50%和42.25%，与第1天相比，FF1组和FF2组DM含量分别降低了5.56%和9.72%。在贮藏过程中2种饲料之间差异显著(P=0.001 1)。

表 2

Table 2

表 2(Table 2)

表 2 贮藏时间对沙柳混合发酵饲料营养成分的影响(干物质基础) Table 2 Effects of storage time on the nutrient content in salix mixed fermentation feed (DM basis) % % 组别Groups 贮藏时间 Storage time/d 干物质 DM 有机物 OM 粗蛋白质 CP 粗脂肪 EE 中性洗涤纤维 NDF 酸性洗涤纤维 ADF 酸性洗涤木质素 ADL 可溶性碳水化合物 WSC 1 45.00ab 92.82b 6.19b 2.84f 59.23a 44.25a 13.51a 2.82a 3 45.03ab 93.20a 6.22ab 3.30bcd 59.19a 44.26a 13.52a 2.77a 5 45.21a 92.05c 6.24ab 3.07e 59.25a 43.99ab 13.44ab 1.80b 7 43.58cd 90.08d 6.22ab 3.12de 58.60ab 43.26b 13.48ab 1.65b 10 43.86bc 89.96d 6.29ab 2.81f 58.85ab 43.63ab 13.42ab 1.34c FF1 12 43.42cd 89.44e 6.30ab 3.07e 58.88ab 43.06b 13.44ab 1.23c 15 43.06cd 88.59f 6.35ab 3.22cde 58.36ab 42.35bc 13.36bc 0.72d 22 42.51de 87.56g 6.27ab 3.36bcd 57.70bc 42.42bc 13.33bc 0.58d 30 43.68cd 87.53g 6.39a 3.70a 57.20bc 41.87cd 13.29cd 0.03e 45 42.60de 87.18h 6.37a 3.60a 57.17c 41.42d 13.27cd 0.02e 60 42.50de 86.88h 6.36ab 3.52ab 57.00c 41.46d 13.22d 0.02e SEM 0.35 0.66 0.08 0.09 0.33 0.27 0.17 0.29 1 46.80a 94.91a 5.73a 3.22d 59.01a 44.54a 13.66a 3.06a 3 45.15bc 91.27c 5.76a 2.90e 58.98b 44.60a 13.67a 2.43b 5 45.18bc 91.53b 5.81a 3.46bc 57.85bc 44.44ab 13.69a 1.97c 7 44.30bd 89.86d 5.97a 3.57bc 57.61c 43.91bc 13.64a 1.78c 10 45.66ab 89.57e 6.00a 3.42bcd 57.79bc 43.89bc 13.51ab 1.05d FF2 12 43.28de 89.11h 5.99a 3.61b 57.84bc 43.43c 13.53ab 1.00d 15 44.06cd 89.45f 6.03a 3.30cd 57.34cd 43.30c 13.48bc 0.66e 22 44.69bd 89.36g 6.05a 3.90a 56.50d 42.98cd 13.50ab 0.63e 30 42.61ef 88.23i 6.07a 3.51bc 55.91de 42.79cd 13.44bc 0.05f 45 43.67ce 88.15i 5.98a 3.83a 55.63e 42.16d 13.42bc 0.05f 60 42.25ef 87.06i 6.12a 3.55b 55.64e 41.72d 13.37c 0.06f SEM 0.45 0.86 0.04 0.08 0.69 0.45 0.14 0.31 P值P-value T <0.000 1 <0.000 1 0.007 8 <0.000 1 <0.000 1 <0.000 1 <0.000 1 <0.000 1 G 0.001 1 0.231 8 0.016 4 <0.000 1 0.080 1 0.947 9 0.033 5 0.958 0 T×G 0.001 4 <0.000 1 0.114 7 <0.000 1 0.001 5 0.008 7 0.277 6 0.178 0 1)T:贮存时间；G:组别。同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。 T: storage time; G: group. In the same column,values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below. 2)以上数值为扣除浓缩效应后的实际值。The above value is the actual value after deducting the concentration effect.

表 2 贮藏时间对沙柳混合发酵饲料营养成分的影响(干物质基础) Table 2 Effects of storage time on the nutrient content in salix mixed fermentation feed (DM basis)

随着贮藏时间的延长，OM含量显著下降(P<0.000 1)；发酵前后，FF1组OM含量由92.82%下降到86.88%，FF2组由94.91%下降到87.06%，差异显著(P<0.05)。FF1组和FF2组OM含量分别在贮藏的第45天和第30天后保持相对稳定(P>0.05)。在贮藏过程中2种饲料之间差异不显著(P>0.05)。

在整个发酵过程中，FF1组的CP含量的变化是6.19%～6.39%，FF2组的CP含量的变化是5.73%～6.12%，略有上升，但各贮藏时间之间差异不显著(P>0.05)；在贮藏过程中2种饲料之间差异显著(P=0.016 4)。

FF1组和FF2组的EE含量随着贮藏时间的延长显著提高(P<0.000 1)；FF1组和FF2组EE含量均在贮藏的第30天后保持相对稳定(P>0.05)。经过60 d的贮藏，FF1组和FF2组的EE含量分别提高了23.94%和10.25%。在发酵过程中2种饲料之间差异显著(P<0.000 1)。

FF1组和FF2组的NDF、ADF和ADL含量在贮藏过程中显著下降(P<0.000 1)。经过60 d的贮藏，FF1组和FF2组的NDF、ADF和ADL含量分别下降了3.76%、5.71%、6.31%和6.33%、2.15%、2.12%。FF1组和FF2组NDF含量分别在贮藏的第22天和第30天后保持相对稳定(P>0.05)；ADF含量分别在贮藏的第30天和第22天后保持相对稳定(P>0.05)；ADL含量均在贮藏的第30天后保持相对稳定(P>0.05)。在贮藏过程中2种饲料之间的NDF和ADF含量差异不显著(P>0.05)，ADL含量差异显著(P=0.033 5)。

FF1组和FF2组的WSC含量随着贮藏时间的延长显著下降(P<0.000 1)。FF1组和FF2组WSC含量均在贮藏的第30天后保持相对稳定(P>0.05)。经过60 d的贮藏，FF1组和FF2组的WSC含量仅为0.02%和0.06%。在贮藏过程中2种饲料之间差异不显著(P>0.05)。 2.2 贮藏时间对沙柳混合发酵饲料体外消化率的影响

由表 3可知，FF1组和FF2组的体外干物质消化率(IVDMD)随贮藏时间的延长呈上升趋势，发酵前后IVDMD差异显著(P<0.000 1)；发酵前期各贮藏时间之间差异不显著(P>0.05)，FF1组和FF2组分别在贮藏的第15天和第12天后IVDMD显著增加(P<0.05)，与第1天相比，FF1组和FF2组的IVDMD分别提高了20.08%和24.65%。FF1组和FF2组的IVDMD分别在贮藏的第30天和第45天后保持相对稳定(P>0.05)。

表 3

Table 3

表 3(Table 3)

表 3 贮藏时间对沙柳混合发酵饲料体外消化率的影响(干物质基础) Table 3 Effects of storage time on the in vitro digestibility in salix mixed fermentation feed (DM basis) % % 组别 Groups 贮藏时间 Storage time/d 干物质 体外消化率 In vitro digestibility of DM 有机物 体外消化率 In vitro digestibility of OM 粗蛋白质 体外消化率 In vitro digestibility of CP 中性洗涤纤维 体外消化率 In vitro digestibility of NDF 酸性洗涤纤维 体外消化率 In vitro digestibility of ADF 1 36.10c 37.20c 39.91cd 19.08c 12.50e 3 35.18c 37.70c 41.05c 19.77c 16.86cde 5 36.21c 38.44c 45.49b 20.69c 16.07de 7 34.71c 37.32c 37.26d 25.60b 21.18bc 10 34.65c 37.27c 45.27b 25.40b 19.69cd FF1 12 35.84c 37.81c 47.51b 25.65b 19.11cd 15 36.16c 38.70c 51.68a 30.88a 24.43b 22 38.30bc 40.16bc 51.83a 31.82a 24.55b 30 40.24ab 42.76ab 52.58a 31.74a 24.35b 45 41.71ab 43.53ab 52.01a 32.04a 24.59b 60 43.53a 45.58a 53.70a 34.49a 30.15a SEM 0.75 0.82 1.55 1.25 1.09 1 33.31e 36.26cde 42.32g 20.81g 16.08cd 3 34.21de 37.04cde 41.70g 22.93ef 16.29bcd 5 32.20e 34.66e 43.04g 22.86ef 18.71bc 7 34.36de 36.34cde 48.50f 23.65cd 19.64b 10 33.25e 34.99de 53.98f 24.39cd 19.36bc FF2 12 33.88de 37.32cd 56.52d 25.95bcd 19.10bc 15 36.08cd 37.86c 58.65c 24.26cd 19.49bc 22 36.33cd 37.21cde 56.76d 24.86cd 19.46bc 30 37.61bc 41.42b 60.92b 26.74ab 25.07a 45 39.08ab 41.24b 62.68a 28.13ab 23.74a 60 41.52a 44.27a 63.53a 30.77a 25.35a SEM 0.56 0.60 2.28 0.53 0.58 P值P-value T <0.000 1 <0.000 1 <0.000 1 <0.000 1 <0.000 1 G <0.000 1 0.002 2 <0.000 1 <0.000 1 0.014 7 T×G 0.771 4 0.684 8 <0.000 1 <0.000 1 0.006 9

表 3 贮藏时间对沙柳混合发酵饲料体外消化率的影响(干物质基础) Table 3 Effects of storage time on the in vitro digestibility in salix mixed fermentation feed (DM basis)

随着贮藏时间的延长，FF1组和FF2组的体外有机物消化率(IVOMD)呈上升趋势，发酵前后IVOMD差异显著(P<0.000 1)；FF1组和FF2组均在贮藏的第15天后显著增加(P<0.05)，在整个发酵过程中，FF1组和FF2组的IVOMD分别提高了22.53%和22.09%。FF1组和FF2组的IVOMD均在贮藏的第30天后保持相对稳定(P>0.05)。

FF1组和FF2组的体外粗蛋白质消化率(IVCPD)随贮藏时间的延长呈上升趋势，发酵前后IVCPD差异显著(P<0.000 1)；与第1天相比，FF1组和FF2组的IVCPD分别提高了34.55%和50.12%。FF1组和FF2组的IVCPD分别在贮藏的第15天和第45天后保持相对稳定(P>0.05)。

FF1组和FF2组的体外中性洗涤纤维消化率(IVNDFD)和体外酸性洗涤纤维消化率(IVADFD)随贮藏时间的延长呈上升趋势，发酵前后差异显著(P<0.000 1)；与第1天相比，FF1组和FF2组的IVNDFD和IVADFD分别提高了106.97%和47.86%、141.20%和57.65%。FF1组和FF2组的IVNDFD分别在贮藏的第15天和第30天后保持相对稳定(P>0.05)；IVADFD分别在贮藏的第15天和第30天后保持相对稳定(P>0.05)。

在整个贮藏过程中，2组发酵饲料之间的营养物质体外消化率均差异显著(P<0.05)。 3 讨 论 3.1 贮藏时间对沙柳混合发酵饲料营养成分的影响

DM含量是评价发酵质量的一个重要指标，发酵饲料DM含量变化较大，则在发酵过程中营养物质降解就越大，保存越不佳^[15]。本试验中，DM含量随着贮藏时间的延长逐渐下降，这与王加启等^[16]报道一致。这可能与发酵过程中水溶性碳水化合物含量降低有关，在发酵过程中，作为微生物重要发酵来源的水溶性碳水化合物不断地被微生物利用，导致DM含量损失相对较高。

在发酵前期，由于多种微生物的存在，对发酵饲料中营养物质的利用要多于自身产生的OM，所以表现为OM含量不断地下降。随着发酵的进行，大部分微生物逐渐减少甚至消失，只有乳酸菌 处于活动状态，由于其本身活动产生的乳酸量要 大于消耗的营养物质^[17]，所以发酵后期OM含量趋于稳定。

CP是饲料中含氮物质的总称，含有各种必需氨基酸，是决定发酵饲料饲用价值的重要基础^[17]。本试验中，2组发酵饲料CP含量有少量的提高，但差异不显著，这与王旭明等^[14]的研究结果相似。这是因为在饲料CP的测定中，是以样品含氮量的6.25倍计算，根据质量守恒定律，在无外来氮源加入的情况下，CP的绝对量不可能在发酵后有所增加。

EE是富含热能的养分，是提供能量的主要物质。发酵过程中，前期由于微生物活动活跃，需要消耗利用EE，EE含量会出现下降趋势。但本试验中，EE含量逐渐增加，出现上述结果的原因还不明确，有待于进一步的研究。

NDF是目前反映纤维质量好坏的最有效指标，其含量是估测奶牛饲粮精粗比是否合适的重要指标^[18]。ADF是指示饲料能量的关键，其含量越低，青贮饲料饲用价值越高^[19]。木质素不能被反刍动物吸收利用，同时会降低其他养分的消化率^[20]。本试验中，2种发酵饲料的NDF、ADF和ADL含量在贮藏期间均显著下降，这与许宇薇^[21]的研究结果相似，这说明添加的复合菌剂可以降解发酵原料中的纤维部分，转化为微生物可利用的营养成分。

WSC含量是饲料成功发酵的先决条件之一，因为WSC为青贮早期乳酸菌发酵提供发酵底物，被转化为挥发性脂肪酸和乳酸^[22]。WSC是发酵饲料的营养物质中损失最多的物质^[17]。许庆方等^[23]的研究表明，苜蓿青贮经过58 d的发酵，WSC含量由9%下降到5%。沙柳混合发酵饲料在贮藏过程中WSC含量逐渐下降，经过60 d的贮藏后，FF1组和FF2组的WSC含量分别为0.02%和0.06%，表明发酵过程微生物发酵需要消耗一定量的WSC。 3.2 贮藏时间对沙柳混合发酵饲料体外消化率的影响

饲料中各营养物质的含量只代表饲料本身，而不能反映饲料在动物体内的消化和吸收利用情况^[24]。IVDMD和IVOMD的大小反映了饲料消化的难易程度^[25]，本试验中，经过60 d的贮藏，沙柳混合发酵饲料的IVDMD和IVOMD显著提高，这与Han等^[26]的研究结果相似，这说明沙柳混合发酵饲料经发酵处理后可以使细胞壁结构发生改变，使其变得松散，质地变软，有利于瘤胃微生物更快、更好地与消化底物结合。此外，原料经过揉碎处理，加大了营养成分的暴露面积，有益于有效菌的附着和消化，加快其释放营养物质的速度；而且在发酵过程中可溶性部分含量增加，大分子物质被分解为小分子物质，提高了瘤胃微生物对沙柳混合发酵饲料的分解速度。

沙柳是以粗纤维为主的饲料，而木质素是不能被瘤胃微生物消化利用的。由于木质素与植物纤维总是镶嵌在一起，微生物很难与其接触，无法起到相应的消化作用，因此破坏木质素的这种结构，创造微生物生长所需的环境，成为提高沙柳混合发酵饲料消化率的关键。本试验中，沙柳混合发酵饲料的IVNDFD和IVADFD随着贮藏时间的延长而显著升高，这与许庆方等^[23]和Yahaya等^[27]的研究结果相似，其原因可能是添加的复合菌剂破坏了沙柳的木质素结构，将纤维类物质转化为可消化利用的营养物质，提高了纤维物质的消化率。

本试验中沙柳混合发酵饲料的IVCPD显著提高，其原因可能是由于添加了复合菌剂，将原料中的非蛋白氮转化为菌体蛋白，使蛋白质分解为肽、胨和氨基酸等容易消化吸收的物质，提高蛋白质的消化吸收率。 4 结 论

① 综上所述，按沙柳不同添加比例调制的2种发酵饲料配方，经发酵处理可以有效提高沙柳混合发酵饲料的营养成分。

② 沙柳混合发酵饲料经过发酵处理可显著提高发酵饲料的IVDMD、IVOMD、IVCPD、IVNDFD和IVADFD，说明通过本试验的处理，可保存大量供动物体消化的营养成分。

③ 综合各项指标，确定在贮藏30 d后沙柳混合发酵饲料营养成分趋于稳定，且FF1组的营养品质优于FF2组。因此，通过沙柳可以获得营养价值较好的新型混合发酵饲料。