紫花苜蓿是1年可刈割多次的多年生优质豆科牧草，具有产量高、品质好等特点，在奶牛产业中不可替代。其分布范围极广，美洲、欧洲、亚洲及大洋洲均有分布^[1]。多年来，国内外对苜蓿的研究众多，主要集中在播种密度、疏枝、施肥、灌溉、刈割、生长调节剂以及授粉媒介等方面^[2]，对于不同种植年限的苜蓿改良土壤理化性质的作用已得到许多研究的肯定^[3]，大多数对种植年限的研究集中在苜蓿对土壤的改良作用，很少检测种植年限对于苜蓿品质的影响。张丽妍等^[4]研究发现，除春播当年收获苜蓿的产草量最低以外，苜蓿全年产草量2年龄>3年龄>4年龄>6年龄，植株密度随生长年限的增加而降低，根颈粗、颈蘖数及根腐率则反之。赵娜等^[5]研究发现，豆科牧草随着生长年限的增加，其蛋白质含量呈下降趋势，而酸性洗涤纤维(ADF)含量则随着生长年限的增加而增大。田雨佳^[6]对不同刈割茬次苜蓿的营养价值进行比较发现，在年刈割3茬地区，第3茬苜蓿的粗蛋白质(CP)含量最高，粗纤维含量最低，营养价值最高；第2茬最低，第1茬居中，但不同刈割茬次对奶牛的营养价值研究较少。故本研究通过体外发酵技术评价奶牛瘤胃微生物对不同茬次和生长年限刈割的紫花苜蓿的利用营养价值及体外降解率，旨在为生产中苜蓿对奶牛的营养价值以及合理利用紫花苜蓿资源提供参考数据与理论支持。 1 材料与方法 1.1 试验设计

采用双因素试验设计，苜蓿生长年限为1、3、4年龄；茬次为第1、2、3茬，共9个组，每组3个重复，采取荷斯坦奶牛为瘤胃液供体，进行体外发酵。 1.2 试验材料 1.1.1 苜蓿种植采集

本试验的苜蓿品种为金皇后，种植于甘肃兰州，该地区地处甘肃省中部，位于我国版图的几何中心，东经102°35′~104°34′、北纬35°34′~37°07′，平均海拔1 500 m，年平均气温9.1 ℃，年平均降水量在250~350 mm，并集中分布在6—9月。市区南北群山环抱，东西黄河穿流而过，具有 盆地城市的特征，属温带大陆性气候。兰州地区 苜蓿年刈割3茬，均为初花期刈割。采集甘肃兰州2008、2009和2011年种植，2012年刈割，即生长年限分别为4、3、1年龄的第1、2、3茬9个苜蓿草(金皇后)样品。第1茬草取样时期为2012年6月中旬，第2茬草取样时期为2012年8月上旬，第3茬草取样时期为2012年10月上旬。选择清洁、无污染及无霉变的样品于65 ℃烘干，用植物粉碎机粉碎过1 mm筛，保存备用。苜蓿的营养成分含量见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 苜蓿的营养成分(风干基础) Table 1 Nutrition composition of alfalfa (air-dry basis) % 茬次Stubble 生长年限Growing year/year 干物质DM 有机物OM 粗蛋白质CP 粗脂肪EE 粗灰分Ash 中性洗涤纤维NDF 酸性洗涤纤维ADF 4 92.94 81.77 14.71 1.17 11.17 42.09 28.88 1 3 93.25 83.13 14.31 0.67 10.12 47.13 33.62 1 92.76 81.32 17.08 1.44 11.45 37.49 24.56 4 92.63 84.93 14.60 0.43 7.70 53.55 37.22 2 3 93.00 85.92 9.02 0.83 7.08 63.61 48.01 1 92.44 83.08 16.21 0.82 9.36 50.54 35.18 4 91.59 80.78 18.83 0.80 10.81 36.07 23.71 3 3 92.35 83.69 13.87 1.08 8.66 44.18 30.77 1 91.61 82.23 16.00 1.05 9.38 35.64 23.55 主效应因子 Main effectors 茬次 Stubbles 1 92.98c 82.07a 15.37b 1.09 10.91c 42.24b 29.02b 2 92.69b 84.64b 13.28a 0.70 8.05a 55.90c 40.14c 3 91.85a 82.23a 16.23c 0.98 9.62b 38.63a 26.01a 生长年限 Growing years 4 92.38b 82.49b 16.04b 0.80 9.89b 43.91b 29.94b 3 92.87c 84.24c 12.40a 0.86 8.62a 51.64c 37.46c 1 92.27a 82.21a 16.43c 1.10 10.06b 41.22a 27.76a P值 P-value 生长年限 Growing years <0.05 <0.05 <0.05 0.39 <0.05 <0.05 <0.05 茬次 Stubbles <0.05 <0.05 <0.05 0.23 <0.05 <0.05 <0.05 生长年限×茬次 Growing years×stubbles <0.05 <0.05 <0.05 0.44 <0.05 <0.05 <0.05 同列数据肩标相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)，肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。除表2外，下表同。 In the same column,values with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below except Table 2.

表1 苜蓿的营养成分(风干基础) Table 1 Nutrition composition of alfalfa (air-dry basis)

瘤胃液采自南京农业大学江浦农场3头装有永久性瘤胃瘘管的健康成年荷斯坦奶牛。每天07:00和17:00饲喂干物质(DM)9 kg(青贮玉米秸秆 ∶ 苜蓿 ∶ 羊草 ∶ 精料=20 ∶ 20 ∶ 30 ∶ 30；精料主要由玉米、麸皮、豆粕组成；先粗后精)，自由饮水。早饲前按1 ∶ 1 ∶ 1的比例采集瘤胃液，并保存于充满二氧化碳(CO₂)的39 ℃热水瓶内，迅速带回实验室，并用磁力搅拌器进行充分混合，整个过程严格厌氧。

培养液参照Theodorou等^[7]方法配制，发酵用培养液组成见表2，培养液由A、B、C、D和E 5部分组成，其中D是刃天青溶液，为厌氧指示剂，有氧时呈红色，厌氧时呈无色。在558.9 mL蒸馏水中加入0.1 mL溶液A、200 mL溶液B、200 mL溶液C及1 mL溶液D，通CO₂饱和后放置于39 ℃恒温水浴箱中5~6 h，加入40 mL溶液E，混匀后通CO₂至饱和并加热至39 ℃，继续通CO₂0.5~1.0 h。然后与经4层纱布过滤的瘤胃液在厌氧条件下充分混合(体积比为10 ∶ 90)，pH调至6.70，厌氧分装100 mL/瓶(含1 g发酵底物、设4个重复)，39 ℃静置培养96 h。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 培养液组成 Table 2 Medium composition 项目Items 溶液Solution 体积Volume/mL 组成Composition A 微量元素溶液 100 CaCl2·2H2O 13.2 g,MnCl2·4H2O 10.0 g,CoCl2·6H2O 1.0 g,FeCl3·6H2O 8.0 g B 缓冲液 1 000 NH4HCO3 4.0 g，NaHCO3 35.0 g C 常量元素溶液 1 000 Na2HPO4 5.7 g，KH2PO4 6.2 g，MgSO4·7H2O 0.6 g D 刃天青溶液 1 0.1%(质量体积比) E 还原剂溶液 100 L-盐酸半胱氨酸(L-Cys·HCl) 0.625 g，NaOH 160 mg，Na2S·9H2O 0.625 g

表2 培养液组成 Table 2 Medium composition

按张丽英^[8]的方法测定试验样品中DM、有机物(OM)、CP、粗脂肪(EE)和粗灰分(ash)含量，采用Van Soest等^[9]方法测定中性洗涤纤维(NDF)及ADF含量。根据马艳艳等^[10]方法计算底物干物质降解率(disappearance rate of DM,DMD)、有机物降解率(disappearance rate of OM,OMD)、中性洗涤纤维降解率(disappearance rate of NDF，NDFD)和酸性洗涤纤维降解率(disappearance rate of ADF，ADFD)。 1.2.2 发酵指标测定

发酵过程中测定动态产气量，于24、48、72及96 h时结束发酵并测定发酵液pH，挥发性脂肪酸(VFA)、氨态氮(NH₃-N)及菌体蛋白(MCP)浓度。参照Theodorou等^[7]和朱伟云等^[11]方法测定产气量；参照秦为琳^[12]气相色谱方法测定VFA浓度；Weathburn^[13]方法测定NH₃-N浓度；MCP浓度的测定参照Makkar等^[14]的方法。 1.3 数据分析

各试验数据经Excel 2007初步整理后，利用SPSS 17.0进行多因素方差分析，用Duncan氏法进行多重比较。试验结果以平均值表示，当P<0.05时认为差异显著。 2 结果与分析 2.1 苜蓿体外发酵产气量变化

苜蓿体外发酵产气量变化见表3，随发酵时间延长，苜蓿产气量呈逐渐上升趋势，前48 h发酵较为迅速，48 h以后基本趋于稳定。茬次对苜蓿体外发酵各时间点产气量影响显著(P<0.05)，其中第3茬苜蓿最高，其次为第1茬，第2茬最低。生长年限对苜蓿各时间点产气量影响显著(P<0.05)，各时间点均为1年龄苜蓿最高，3年龄最低，4年龄居中。茬次和生长年限对苜蓿体外发酵各时间点产气量有显著的交互作用(P<0.05)。96 h，产气量1年龄第3茬和4年龄第3茬较高，分别为213.5和210.5 mL，3年龄第2茬较低，为154.9 mL。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 苜蓿体外厌氧发酵产气量变化 Table 3 Cumulative gas production during alfalfa in vitro fermentation mL 茬次Stubbles 生长年限Growing years 产气量 Gas production 24 h 48 h 72 h 96 h 4 161.10 182.90 188.83 190.20 1 3 151.55 175.45 181.93 183.75 1 166.60 187.83 193.93 196.18 4 143.80 164.95 171.03 173.25 2 3 119.50 145.15 152.35 154.88 1 141.80 160.08 165.33 167.38 4 184.65 204.40 209.58 210.50 3 3 176.63 198.05 203.90 205.13 1 185.53 206.25 211.75 213.53 主效应因子 Main effectors 茬次 Stubbles 1 159.75b 182.06b 188.22b 190.04b 2 135.03a 156.72a 162.90a 165.17a 3 182.27c 202.90c 208.41c 209.72c 生长年限 Growing years 4 163.18b 184.08b 189.81b 191.31b 3 149.22a 172.88a 179.39a 181.25a 1 164.64b 184.71b 190.33b 192.36b P值 P-value 生长年限 Growing years <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 茬次 Stubbles <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 生长年限×茬次 Growing years×stubbles <0.05 <0.05 <0.05 <0.05

表3 苜蓿体外厌氧发酵产气量变化 Table 3 Cumulative gas production during alfalfa in vitro fermentation

苜蓿体外发酵DMD、OMD、NDFD和ADFD变化见表4。其中DMD、OMD、NDFD和ADFD均随着发酵时间延长逐渐升高，发酵前48 h底物降解最快，这与苜蓿产气量变化趋势基本一致。茬次对苜蓿体外发酵各时间点DMD、OMD、NDFD和ADFD影响显著(P<0.05)，第3茬苜蓿各时间点的DMD、OMD、NDFD和ADFD均最高。生长年限对苜蓿体外发酵各时间点DMD、OMD以及24、48和96 h的NDFD和ADFD影响显著(P<0.05)。96 h，1年龄苜蓿DMD、OMD、NDFD和ADFD显著高于3和4年龄苜蓿(P<0.05)，4年龄苜蓿高于3年龄苜蓿。茬次和生长年限对苜蓿体外发酵各时间点营养物质降解率有显著的交互作 用(P<0.05)。96 h，1年龄第3茬和4年龄第3茬各营养物质降解率均为较高，3年龄第2茬较低。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 苜蓿体外发酵DMD、OMD、NDFD、ADFD变化 Table 4 The changes of DMD,OMD,NDFD,ADFD during alfalfa in vitro fermentation % 茬次Stubbles 生长年限Growing years 干物质降解率 DMD 有机物降解率 OMD 中性洗涤纤维降解率 NDFD 酸性洗涤纤维降解率 ADFD 24 h 48 h 72 h 96 h 24 h 48 h 72 h 96 h 24 h 48 h 72 h 96 h 24 h 48 h 72 h 96 h 4 50.5 56.1 58.0 60.0 50.4 57.9 62.2 62.2 21.1 30.1 31.9 32.3 20.9 28.6 27.5 27.2 1 3 47.7 53.7 56.5 57.8 47.3 53.7 57.4 57.9 20.3 32.1 32.3 36.0 17.1 31.1 30.0 32.9 1 52.6 59.3 61.6 62.2 53.5 60.6 64.1 64.9 20.0 33.1 37.6 39.5 22.1 30.9 34.1 34.9 4 39.2 45.7 50.5 53.4 39.0 45.2 51.3 52.7 17.9 30.7 33.1 34.9 15.2 27.7 28.9 32.6 2 3 30.2 38.3 40.2 43.1 30.6 38.1 40.9 42.0 16.4 26.3 31.8 32.4 15.2 25.7 29.5 29.7 1 43.6 50.2 55.3 60.7 44.0 49.2 56.1 59.2 23.9 31.5 37.5 46.7 21.4 28.4 31.9 41.4 4 61.4 66.1 66.7 69.8 61.7 66.0 68.4 69.2 37.1 43.5 49.8 50.2 37.8 44.0 46.0 46.5 3 3 51.9 59.0 62.2 65.0 52.0 59.1 63.2 64.6 21.8 34.9 42.1 42.0 18.7 33.4 38.5 39.7 1 58.1 62.4 66.2 69.4 59.9 64.9 69.7 72.2 21.9 33.6 35.4 42.0 18.1 31.2 30.8 37.8 主效应因子 Main effectors 茬次Stubbles 1 50.3b 56.4b 58.7b 60.0b 50.4b 57.4b 61.2b 61.7b 20.5a 31.8a 33.9a 35.9a 20.0b 30.2b 30.6a 31.7a 2 37.6a 44.8a 48.7a 52.4a 37.8a 44.2a 49.5a 51.3a 19.4a 29.5a 34.1a 38.0a 17.3a 27.3a 30.1a 34.6b 3 57.1c 62.5c 65.1c 68.1c 57.9c 63.4c 67.1c 68.7c 26.9b 37.3b 42.4b 44.7b 24.9c 36.2c 38.5b 41.3c 生长年限Growing years 4 50.4b 56.0b 58.4b 61.1b 50.4b 56.4b 60.7b 61.4b 25.3c 34.7b 38.2b 39.1b 24.6c 33.4b 34.2 35.4a 3 43.3a 50.3a 53.0a 55.3a 43.3a 50.3a 53.8a 54.8a 19.5a 31.1a 35.4a 36.8a 17.0a 30.0a 32.7 34.1a 1 51.5b 57.3b 61.1c 64.1c 52.6c 58.2c 63.3c 65.4c 21.9b 32.7a 36.8ab 42.7c 20.5b 30.2a 32.3 38.0b P值 P-value 生长年限 Growing years <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 0.108 <0.05 <0.05 <0.05 0.372 <0.05 茬次 Stubbles <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 生长年限×茬次 Growing years×stubbles <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05

表4 苜蓿体外发酵DMD、OMD、NDFD、ADFD变化 Table 4 The changes of DMD,OMD,NDFD,ADFD during alfalfa in vitro fermentation

苜蓿体外发酵pH变化见表5，随着发酵时间延长发酵液pH不断降低，介于6.35～6.65。茬次对苜蓿体外发酵各时间点发酵液pH影响显著(P<0.05)，第2茬最高，其次是第1茬，第3茬最低。24～72 h，生长年限对苜蓿体外发酵培养液pH影响显著(P<0.05)，1年龄苜蓿显著低于3和4年龄苜蓿(P<0.05)。茬次和生长年限对苜蓿体外发酵培养液pH没有显著的交互作用(P>0.05)。 2.4 苜蓿体外发酵VFA变化

苜蓿体外发酵VFA变化见表6。随发酵时间延长，苜蓿体外发酵液各VFA浓度逐渐升高，累积主要在前48 h，48～96 h培养液VFA浓度上升缓慢。除96 h丁酸浓度以外，茬次对各时间点苜蓿体外发酵液中乙酸、丙酸、丁酸和总挥发性脂肪酸(TVFA)影响显著(P<0.05)，其中乙酸(24～96 h)、丁酸(72 h)和TVFA(24 h)浓度均为第3茬和第1茬显著高于第2茬(P<0.05)，丙酸(24～96 h)、丁酸(24～48 h)和TVFA(48～96 h)浓度均为第3茬显著高于第1和2茬(P<0.05)。生长年限对苜蓿体外发酵液丙酸(24～96 h)、丁酸(24～48 h)影响显著(P<0.05)。96 h，3年龄苜蓿丙酸和丁酸显著低于4年龄苜蓿(P<0.05)，3年龄苜蓿TVFA显著低于1年龄苜蓿(P<0.05)。茬次和生长年限对苜蓿体外发酵培养液丙酸(48 h)、丁酸(48～72 h)浓度有显著的交互作用(P<0.05)。96 h时，4年龄第3茬乙酸、丙酸、TVFA浓度均为最高，4年龄第2茬最低。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 苜蓿体外发酵pH变化 Table 5 Changes in the pH value during alfalfa in vitro fermentation 茬次Stubbles 生长年限Growing years pH 24 h 48 h 72 h 96 h 4 6.62 6.54 6.49 6.40 1 3 6.63 6.54 6.51 6.40 1 6.60 6.51 6.48 6.40 4 6.64 6.56 6.51 6.43 2 3 6.65 6.56 6.52 6.44 1 6.63 6.54 6.51 6.43 4 6.61 6.50 6.47 6.37 3 3 6.60 6.52 6.47 6.40 1 6.57 6.50 6.45 6.35 主效应因子 Main effectors 茬次 Stubbles 1 6.62b 6.53b 6.49b 6.40b 2 6.64c 6.56c 6.51c 6.43c 3 6.59a 6.50a 6.46a 6.37a 生长年限 Growing years 4 6.62b 6.53b 6.49b 6.40 3 6.63b 6.54b 6.50b 6.41 1 6.60a 6.52a 6.48a 6.39 P值 P-value 生长年限 Growing years <0.05 <0.05 <0.05 0.113 茬次 Stubbles <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 生长年限×茬次 Growing years×stubbles 0.543 0.682 0.637 0.345

表5 苜蓿体外发酵pH变化 Table 5 Changes in the pH value during alfalfa in vitro fermentation

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 苜蓿体外发酵VFA变化 Table 6 Concentration of VFA during alfalfa in vitro fermentation mmol/L 茬次Stubbles 生长年限Growing years 乙酸 Acetate 丙酸 Propionate 丁酸 Butyrate 总挥发酸 TVFA 24 h 48 h 72 h 96 h 24 h 48 h 72 h 96 h 24 h 48 h 72 h 96 h 24 h 48 h 72 h 96 h 4 21.05 22.23 27.53 27.37 6.55 7.04 9.28 9.96 2.03 2.99 3.53 3.50a 30.40 34.32 42.98 43.04 1 3 19.25 23.52 23.59 25.40 6.21 7.53 8.65 7.93 1.93 2.84 3.02 3.14b 28.40 36.27 38.00 38.79 1 17.46 21.85 22.18 30.53 6.80 7.65 8.76 9.53 2.07 2.88 2.70 3.33ab 27.20 34.94 36.46 46.28 4 16.58 20.17 20.66 20.86 5.41 6.39 7.30 6.80 1.86 3.04 2.98 3.62 24.51 31.65 33.28 34.02 2 3 13.98 17.77 18.84 25.28 4.13 5.33 6.43 7.11 1.31 2.37 2.52 2.93 19.67 26.50 29.03 36.58 1 13.70 19.08 19.84 26.02 4.62 6.46 7.37 7.71 1.55 2.62 2.67 2.95 20.68 29.88 31.80 38.49 4 21.29 25.96 26.48 31.30 8.66 9.41 11.04 10.58 2.58 3.17 3.10 3.50 34.10 41.70 44.03 48.93 3 3 16.02 22.10 25.42 28.07 6.95 8.24 10.39 9.70 2.17 3.32 3.02 3.35 25.97 36.97 42.07 44.06 1 21.04 24.10 27.96 28.40 9.34 9.33 11.99 12.15 2.87 3.67 3.94 3.76 34.86 40.48 47.55 47.60 主效应因子Main effectors 茬次 Stubbles 1 19.25b 22.53b 24.43b 27.77b 6.52b 7.40b 8.89b 9.14b 1.57a 2.91b 3.08b 3.33ab 28.66b 35.18b 39.15b 42.71b 2 14.75a 19.01a 19.78a 24.06a 4.72a 6.06a 7.03a 7.21a 2.01b 2.68a 2.27a 3.17a 21.62a 29.34a 31.37a 36.36a 3 19.45b 24.05b 26.62b 29.25b 8.32c 8.99c 11.14c 10.81c 2.54c 3.39c 3.35b 3.54b 31.65b 39.72c 44.55c 46.86c 生长年限 Growing years 4 19.64 22.79 24.89 26.51 6.87b 7.61b 9.21b 9.11b 2.16b 3.07b 3.20b 3.54b 29.67b 35.89 40.09b 42.00ab 3 16.41 21.13 22.62 26.25 5.76a 7.03a 8.49a 8.25a 1.80a 2.84a 2.85a 3.14a 24.68a 33.24 36.37a 39.81a 1 17.40 21.67 23.33 28.32 6.92b 7.81b 9.37b 9.79b 2.16b 3.06b 3.10ab 3.35ab 27.58ab 35.10 38.60ab 44.12b P值 P-value 生长年限 Growing years 0.092 0.223 0.114 0.252 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 0.069 0.064 0.070 0.130 0.052 0.051 茬次 Stubbles <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 0.089 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 生长年限×茬次 Growing years×stubbles 0.415 0.261 0.165 0.056 0.283 <0.05 0.189 0.103 0.242 <0.05 <0.05 0.263 0.359 0.189 0.109 0.268

表6 苜蓿体外发酵VFA变化 Table 6 Concentration of VFA during alfalfa in vitro fermentation

苜蓿体外发酵NH₃-N及MCP浓度变化见表7。随发酵时间的延长，培养液NH₃-N浓度呈现逐渐升高的趋势；MCP浓度呈现先升高后降低的趋势，48 h浓度最高。茬次对苜蓿发酵液NH₃-N(48～96 h)浓度影响显著(P<0.05)，第3茬苜蓿NH₃-N浓度最高，第2茬最低，第1茬居中。生长年限对苜蓿发酵液各时间点的NH₃-N浓度影响显著(P<0.05)，3年龄苜蓿浓度最低，1年龄苜蓿NH₃-N浓度显著高于3年龄(P<0.05)。茬次和生长年限对苜蓿发酵液各时间点的NH₃-N浓度有显著的交互作用(P<0.05)，4年龄第3茬和1年龄第3茬较高，3年龄第2茬最低。

茬次对苜蓿发酵液各时间点MCP浓度影响显著(P<0.05)，发酵24 h时，第3茬苜蓿MCP浓度显著高于第1和2茬(P<0.05)，第1茬显著高于第2茬(P<0.05)；发酵48和72 h时，第3茬苜蓿MCP浓度显著高于第1茬和第2茬(P<0.05)；发酵96 h时，第3和1茬苜蓿MCP浓度显著高于第2茬(P<0.05)。生长年限对苜蓿发酵液各时间点MCP浓度影响显著(P<0.05)，发酵24和96 h时，1年龄苜蓿MCP浓度显著高于3和4年龄苜蓿(P<0.05)；发酵48 h时，1和4年龄苜蓿MCP浓度显著高于3年龄苜蓿(P<0.05)；发酵72 h时，1和3年龄苜蓿MCP浓度显著高于4年龄(P<0.05)。茬次和生长年限对苜蓿各时间点MCP浓度交互作用不显著(P>0.05)。

表7

Table 7

表7(Table 7)

表7 苜蓿体外发酵NH3-N和MCP浓度变化 Table 7 Concentrations of NH3-N and MCP during alfalfa in vitro fermentation 茬次Stubbles 生长年限Growing years 氨态氮 NH3-N/(mg/dL) 菌体蛋白 MCP/(mg/mL) 24 h 48 h 72 h 96 h 24 h 48 h 72 h 96 h 4 9.09 10.03 14.09 14.77 0.15 0.24 0.16 0.19 1 3 9.36 11.40 14.95 15.64 0.19 0.24 0.19 0.20 1 10.35 14.53 15.51 16.42 0.22 0.26 0.22 0.22 4 10.11 10.70 13.80 14.56 0.13 0.28 0.14 0.15 2 3 7.84 9.31 11.45 12.26 0.13 0.22 0.20 0.16 1 10.80 12.29 13.39 15.62 0.20 0.27 0.21 0.20 4 11.05 14.04 17.15 17.56 0.21 0.31 0.19 0.23 3 3 8.68 12.13 14.51 14.64 0.20 0.25 0.24 0.21 1 10.46 12.60 15.13 15.52 0.26 0.31 0.25 0.22 主效应因子Main effectors 茬次 Stubbles 1 9.60 11.99ab 14.85b 15.61b 0.19b 0.24a 0.19a 0.20b 2 9.58 10.77a 12.88a 14.15a 0.15a 0.25a 0.18a 0.17a 3 10.06 12.92b 15.60c 15.91b 0.22c 0.29b 0.22b 0.22b 生长年限Growing years 4 10.08b 11.59a 15.01b 15.63b 0.16a 0.28b 0.16a 0.19a 3 8.63a 10.95a 13.64a 14.18a 0.17a 0.24a 0.21b 0.19a 1 10.53b 13.14b 14.68b 15.85b 0.22b 0.28b 0.22b 0.21b P值 P-value 生长年限 Growing years <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 茬次 Stubbles 0.236 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 生长年限×茬次 Growing years×stubbles <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 0.130 0.188 0.602 0.078

表7 苜蓿体外发酵NH3-N和MCP浓度变化 Table 7 Concentrations of NH3-N and MCP during alfalfa in vitro fermentation

苜蓿为温带长日照植物，适宜生长在温暖半干旱气候地区，不同茬次苜蓿体外发酵特性的差异主要由四季气候的变化引起。第1茬苜蓿的生育阶段处于春季至夏初，由于雨量充沛，光照充足且积温较多，生长时间较长等，光合产物积累较多，苜蓿品质较佳，产气量及营养物质降解率等较高^[15]；第1茬刈割后，叶面积指数急剧下降，需水量下降^[16]；而第2茬苜蓿的生长季节处在夏季多雨时节，且温度较高，苜蓿生长不耐高温，超过35 ℃，苜蓿生长受阻，出现萎蔫甚至死亡，由于热应激效应，苜蓿的蒸腾作用(异化作用)大于光合作用(同化作用)，导致营养物质积累较少，因此第2茬苜蓿营养价值最低^[6]；第3茬苜蓿生长阶段处于夏末秋初时期，生长周期较短，且水分充足，光照时间较长，且昼夜温差大，因此NDF含量较低，CP含量较高，营养物质降解率最高；这也与我们的研究结果相一致：第3茬的营养价值和消化率最高，第1、2茬较低。第3茬苜蓿的营养价值和消化率比第1茬高则可能是由于第1茬苜蓿的生长周期较长，植株纤维化程度比生长周期短的第3茬苜蓿严重，导致其粗纤维含量较高，从而影响其消化率。田雨佳^[6]的研究也发现，年刈割3茬地区，第3茬苜蓿草的营养价值较高，瘤胃降解率最高。但是我们的研究结果与杜书增等^[15]和胡守林等^[17]的结果相反，他们在比较不同刈割茬次苜蓿的营养物质时发现，第1和2茬苜蓿的CP含量高于第3茬，而NDF含量则相反，这可能是由于不同品种、气候、施肥、刈割时间、收获期、管理等客观因素造成的，有待于进一步研究。

贾海军等^[18]研究发现，DMD、NDF、ADF降解率与茬次呈正相关，即随着刈割茬次的增加，底物降解率依次升高。本研究中，第3茬苜蓿的底物降解率最高，第1、2茬较低，由于第2茬苜蓿的营养价值偏低，NDF和ADF含量较高，这可能是其降解率较低的原因。各VFA浓度受饲粮碳水化合物结构比例的影响，当饲粮中可溶性碳水化合物含量较高时，TVFA浓度也会相继提高，表明底物降解率的上升。第3茬苜蓿与前2茬相比，粗纤维含量较低，且CP适中，也易于发酵产气，从而生成的VFA产量较高，同时VFA的大量积累也导致了pH的下降。

瘤胃微生物生长所需的最佳NH₃-N浓度为5~28 mg/dL^[19]，本试验中各苜蓿组NH₃-N浓度变化差异显著，但都在正常范围内。NH₃-N浓度与NDF和ADF含量呈显著负相关，与CP含量呈显著正相关，第3茬苜蓿的CP含量也较于其他2茬偏高，因此第3茬苜蓿的NH₃-N浓度最高，第1茬居中，第2茬最低。Clark等^[20]研究发现，OM在MCP合成中起主导作用。苜蓿与稻草以及玉米秸相比，可促进瘤胃发酵和OM的消化，且可以合成更多的MCP^[21]。苜蓿中的可溶性非结构碳水化合物为反刍动物提供能量来源，而饲料中的CP发酵产生较多的NH₃-N以及DMD和OMD进一步促进了MCP的合成，从而提高氮的利用率。第3茬苜蓿的发酵性能以及CP含量较高，这可能是其MCP浓度较高的根本原因。 3.2 生长年限对苜蓿体外发酵的影响

随着生长年限的增加，苜蓿刈割后各种养分被移出田间，土壤中养分遗失较多，株丛密度大幅度下降，也间接影响了后续种植年份紫花苜蓿的营养价值^[22]。本研究发现，不同生长年限苜蓿的营养价值，1、4年龄较高，3年龄较低。由于刈割后储存不当，3年龄苜蓿叶片脱落严重，茎叶比增加，导致粗纤维比例增加、CP比例降低，营养价值下降，这可能是3年龄价值最低的原因。目前关于3年龄紫花苜蓿的营养价值和消化率较低还鲜有报道，可能是由于根腐率的上升导致其根部吸收土壤养分下降，从而造成苜蓿植株的营养价值和消化率降低；另一方面，多年生紫花苜蓿的茎蘖数会逐年升高^[4]，可能是4年龄苜蓿营养价值和消化率升高的诱导因素。

Menke等^[23]的研究表明，体外发酵的产气量与体内的消化率成正相关关系。Cone等^[24]证明体外产气可分为3个阶段，即发酵基质中的水溶性组分如糖类与大多数蛋白质、不溶性组分如NDF以及微生物的周转。其中微生物周转部分的底物主要存在于培养基中，其对于产气量的影响只在发酵初期，且已经通过不加底物的空白对照除去，因此试验中影响产气量的因素只有快速发酵部分的糖类、CP以及慢速发酵部分的NDF。饲料中的NDF为不易发酵成分，NDF/CP越低，产气速率越快，同时产气量越高。本试验中，1、3、4年龄苜蓿NDF/CP分别为2.51、4.16、2.74，这就说明1和4年龄苜蓿的可发酵碳水化合物含量较高，而3年龄苜蓿NDF含量较高，最终导致1和4年龄苜蓿产气量高于3年龄苜蓿。

Owens等^[25]认为，瘤胃微生物合成MCP所需的NH₃-N浓度为0.35～29 mg/dL。本研究中，各组发酵液的NH₃-N浓度介于7.84～17.56 mg/dL，NDF的降解以及MCP的合成不受抑制。由于1和4年龄苜蓿的CP含量显著高于3年龄苜蓿，且NDF和ADF含量显著低于3年龄苜蓿，故发酵液中1和4年龄苜蓿的NH₃-N浓度显著高于3年龄苜蓿。微生物对碳水化合物和CP的利用具有交互作用，MCP的合成需要VFA为其提供能量，一定pH条件下，当瘤胃内的能氮比处在合适的比例范围内时，MCP合成效率最大。本试验中，1年龄苜蓿VFA以及NH₃-N浓度均为最高，微生物具有足够的能量利用氨合成微生物蛋白，故MCP浓度最高。 4 结 论

不同刈割茬次和生长年限均能显著影响苜蓿OM、CP、NDF和ADF含量，从而影响其体外降解率及发酵代谢产物浓度。其中以1年龄第3茬和4年龄第3茬苜蓿营养价值较高，3年龄第2茬较低。