维生素D₃是动物所必需的一种重要营养素，其在体内的活化形式1,25-二羟维生素D₃[1，25(OH)-D₃]是动物机体内调节钙磷平衡的主要激素之一。活性维生素D₃是通过与存在于细胞内的特异性维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)结合后发挥生物效应的。近年来研究发现，VDR除分布于经典的靶器官(骨骼、肾脏、小肠等)外，还广泛存在于其他组织器官(大脑、垂体、胸腺、胰腺等)中，单核细胞、巨噬细胞及活化了的T、B淋巴细胞等绝大多数与免疫系统有关的细胞中也有分布^[1]。这一系列研究结果提示，维生素D₃除具有经典的钙磷调节作用以外，可能还有其他更广泛的生物学功能，包括免疫调节功能。

黄鳝(Monopterus albus)以营养丰富、味道鲜美、药用价值较高而备受人们青睐，是传统的出口创汇水产品和我国重要的淡水名优鱼类之一。黄鳝在野生条件下较少发病，但在规模化人工养殖条件下，因受到细菌、饵料、环境等多种应激因素胁迫，导致免疫机能下降，给黄鳝养殖业带来巨大损失。应用营养调控方式增强对病原微生物的抵抗力是目前防治黄鳝疾病的有效措施之一。

当前，维生素D₃非经典作用特别是其免疫调节作用越来越引起人们重视。在畜牧业和水产养殖中，维生素D₃对动物免疫功能的影响虽有零星报道，但极少涉及其影响机制，对黄鳝免疫功能影响的研究目前尚属空白。本试验通过研究饲料维生素D₃添加水平对黄鳝生长性能、外周血相关免疫指标和活菌攻毒后成活率的影响，探讨其对黄鳝免疫功能的影响及其机理，为维生素D₃在黄鳝生产中的应用提供理论依据。

根据本实验室前期试验方法^[2]，以鱼粉、豆粕为蛋白质源，α-淀粉、玉米淀粉作为糖源，鱼油为脂肪源，并补充无机盐和维生素(不含维生素D₃)等配制基础饲料，其组成及营养水平见表1。在基础饲料中分别添加0(对照组)、250、500、1 000、2 000、4 000 IU/kg的维生素D₃[由拜耳(四川)动物保健有限公司提供]，配制成6种试验饲料。主要饲料原料均粉碎过80目筛，混合均匀后，以挤压机制成直径2 mm的长条饲料，自然晾干备用。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % 项目 Items 含量 Content 原料 Ingredients 玉米 Corn 5.27 α-淀粉 α-starch 15.50 次粉 Wheat middling 4.00 豆粕 Soybean meal 26.00 鱼粉 Fish meal 46.00 鱼油 Fish oil 2.00 磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)2 0.20 维生素预混料 Vitamin premix1) 0.03 胆碱 Choline 0.50 矿物质预混料 Mineral premix2) 0.50 合计 Total 100.00 营养水平 Nutrient levels3) 粗蛋白质 CP 42.00 钙 Ca 2.00 磷 P 1.53 赖氨酸 Lys 3.07 蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys 1.42 1)每千克饲料中含Contained the following per kilogram of the diet：VA 6 000 IU，VE 50 mg，VK 5 mg，VB1 15 mg，VB2 15 mg，VB3 25 mg，VB5 30 mg，VB6 10 mg，VB7 0.2 mg，VB11 3 mg，VB12 0.03 mg。 2)每千克饲料中含 Contained the following per kilogram of the diet：Fe (FeSO4·7H2O) 150 mg，Cu (CuSO4·5H2O) 30 mg，Mn (MnSO4·H2O) 120 mg，Zn (ZnSO4·7H2O) 150 mg，Se (NaSeO3) 0.15 mg，I (KI) 0.35 mg。 3)营养水平为计算值。Nutrient levels were calculated values.

表1 基础饲料组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

试验用黄鳝采自四川雅安市雨城区草坝镇野生群体，经过15 d驯养，黄鳝适应水族箱环境，能够正常摄食配合饲料后开始正式试验。挑选体质健康，规格基本一致，初始体重(21.7±2.1) g的个体540尾，随机分为6组，每组3个重复，每个重复各30尾。养殖试验在四川农业大学鱼类生理实验室进行，采用水族箱(100 cm×60 cm×60 cm)内静水养殖，水源为曝气后的自来水，水面高15~20 cm。试验期间水温(20±3) ℃，pH 6.8~7.5，溶氧浓度5 mg/L以上。每天18:00按鱼体重的2%投饵1次，并根据黄鳝摄食的状况调整饲料的投喂量(以30 min内吃完为准)。每天09:00换水1次，以保证水质清洁，并清除箱中的污物，正式试验共90 d。

正式试验结束后，从各组中取6尾黄鳝(每个重复随机取2尾)，称重，用于计算以下生长性能相关指标。

增重率(WGR，%)=100×(W_t-W₀)／W₀；

存活率(SR，%)=100×N_t／N₀；

饲料系数(FCR)=I_d/G；

蛋白质效率(PER，%)=100×G/I_p。

式中：W₀为初始体重，W_t为终末体重，N₀为初始各组鱼总尾数，N_t为终末各组鱼总尾数，G为鱼体增重(以湿重计)，I_d和I_p分别为饲料和蛋白质的摄入量(以干重计)。 1.4 活菌攻毒试验

正式试验结束后，每组随机选取20尾黄鳝，注射嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)菌液进行攻毒试验。嗜水气单胞菌为标准致病菌(AS1.927)，购于中国科学院北京微生物研究所。细菌经普通肉汤培养基后，用无菌生理盐水配成半数致死浓度3.18×10¹⁰ CFU/mL(攻毒前经预备试验确定的半数致死浓度)的菌液，每尾鱼经腹腔注射嗜水气单胞菌液0.3 mL^[3]。攻毒后6 h开始观察黄鳝临床症状，记录攻毒1、2、3、4 d后黄鳝的死亡数和死亡率，计算免疫保护率。

正式试验结束后，从各组中取6尾黄鳝(每个重复随机取2尾)，采用尾部血管取血法取血。所得每尾黄鳝血样分成2份，其中一份加入乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K₂)抗凝,供白细胞(WBC)以及中性粒细胞(GR)、中值细胞(MID，主要为单核细胞)和淋巴细胞(LY)等数量检测；另一份不加任何抗凝剂，在室温下倾斜30°让其自然凝固，再用高速冷冻离心机在4 ℃、4 000 r/min条件下离心10 min，最后分离上清液(血清)装入洁净试管中。

取抗凝血样用CA620-VET1型全自动血细胞分析仪(MEDONIC，瑞典)进行全血WBC、LY、GR和MID数量测定。

取血清，采用免疫比浊法测定血清免疫球蛋白M(IgM)、补体3(C3)和补体4(C4)水平，测定所用试剂盒均购自浙江伊利康生物技术有限公司；采用酶联免疫法测定血清T细胞CD3、CD4、CD8分子数量，测定所用鱼用CD3、CD4、CD8分子酶联免疫分析试剂盒购自上海研辉生物科技有限公司；采用比浊法测定血清溶菌酶(LSZ)活性，测定所用试剂盒购自南京建成生物工程研究所。上述指标严格按照试剂盒内说明书操作后，用紫外可见分光光度计(贝克曼DU800，美国)或光谱扫描多功能酶标仪(Thermo Scientific Varioskan Flash，美国)测定。

试验数据用平均值±标准差表示，采用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05为差异显著。

表2显示,经过90 d饲养后，除4 000 IU/kg组外，其余各组WGR均显著高于对照组(P<0.05)，尤以500 IU/kg组最高，WGR达149.08%，显著高于其他各组(P<0.05)；随着维生素D₃添加水平的升高，PER和FCR分别表现出先上升而后下降、先下降而后上升的趋势，且维生素D₃添加水平在500 IU/kg时PER和FCR分别表现出最高和最低水平，与其他组差异显著(P<0.05)；在整个饲喂周期结束后，计算各组黄鳝的SR，与对照组相比，维生素D₃添加水平为250~2 000 IU/kg时显著升高(P<0.05)，而维生素D₃添加水平为4 000 IU/kg时则无显著差异(P＞0.05)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 饲料中维生素D3添加水平对黄鳝生长性能的影响 Table 2 Effects of vitamin D3 supplemental level on growth performance of Monopterus albus 项目 Items 维生素D3添加水平 Vitamin D3 supplemental level/(IU/kg) 0 250 500 1 000 2 000 4 000 初始体重 IBW/g 22.50±1.26 22.31±1.17 22.42±1.28 22.30±1.25 22.38±1.11 22.36±1.17 终末体重FBW/g 42.77±4.39d 51.35±5.45b 56.18±4.54a 50.24±4.68b 46.88±3.38c 43.52±4.87d 增重率 WGR/% 90.41±4.14d 129.61±5.70b 149.08±7.25a 125.07±6.98b 109.53±4.19c 94.13±3.73d 蛋白质效率PER/% 89.69±6.05d 124.67±7.81b 136.68±9.64a 121.32±8.91b 107.73±6.18c 95.42±4.39d 饲料系数FCR/% 2.65±0.12a 1.91±0.11c 1.74±0.10d 1.96±0.08c 2.21±0.11b 2.52±0.13a 存活率SR/% 89.31±5.07b 95.34±4.03a 98.65±6.83a 97.16±7.43a 95.83±6.14a 91.34±7.65b 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。 Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表2 饲料中维生素D3添加水平对黄鳝生长性能的影响Table 2 Effects of vitamin D3 supplemental level on growth performance of Monopterus albus

表3显示，经腹腔注射嗜水气单胞菌活菌攻毒1 d后，对照组和4 000 IU/kg组呈爆发性死亡，死亡数达7尾。活菌攻毒4 d后，对照组、4 000 IU/kg组死亡率分别高达65%、60%；其余各维生素D₃添加组死亡率低于对照组，获得了一定的免疫保护率，尤其是500和1 000 IU/kg组，免疫保护率均达到62%。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 饲料中维生素D3添加水平对黄鳝疾病抗性的影响 Table 3 Effects of vitamin D3 supplemental level on disease resistance of Monopterus albus 项目 Items 时间 Time/d 维生素D3添加水平 Vitamin D3 supplemental level/(IU/kg) 0 250 500 1 000 2 000 4 000 攻毒后死亡数 Death number after challenge/尾 1 7 5 2 1 4 7 2 5 3 2 3 3 3 3 0 2 1 1 1 2 4 1 1 0 0 0 0 累积死亡总数 Cumulative death number/尾 13 11 5 5 8 12 累积死亡率 Cumulative mortality/% 65 55 25 25 40 60 免疫保护率 Immune protective rate/% 15 62 62 38 8

表3 饲料中维生素D3添加水平对黄鳝疾病抗性的影响Table 3 Effects of vitamin D3 supplemental level on disease resistance of Monopterus albus

表4显示，与对照组相比，各维生素D₃添加组血清IgM水平显著升高(P<0.05)，且随维生素D₃添加水平的升高呈先增高后减少的趋势，以1 000 IU/kg组最高，为对照组的7.53倍，并显著高于其余各维生素D₃添加组(P<0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 饲料维生素D3添加水平对血清IgM水平和T细胞亚群的影响 Table 4 Effects of vitamin D3 supplemental level on serum IgM level and T cell subsets of Monopterus albus 项目 Items 维生素D3添加水平 Vitamin D3 supplemental level/(IU/kg) 0 250 500 1 000 2 000 4 000 免疫球蛋白M IgM/(g/L) 0.51±0.11d 1.03±0.23c 1.64±0.33bc 3.84±0.35a 2.36±0.42b 1.11±0.14c CD3/(U/mL) 102.22±2.65c 114.50±3.81b 124.51±3.24a 124.65±4.83a 118.52±0.81b 104.32±6.55c CD4/(U/mL) 47.32±0.59d 49.65±0.95c 56.22±0.56a 55.92±0.71a 53.58±0.61b 47.53±1.09d CD8/(U/mL) 24.27±0.76c 24.51±0.58c 26.15±0.84b 27.23±0.32a 26.52±0.46b 24.08±1.16c CD4/CD8 1.96±0.21b 2.03±0.34b 2.15±0.18a 2.05±0.17a 2.02±0.13a 1.97±0.23b

表4 饲料维生素D3添加水平对血清IgM水平和T细胞亚群的影响Table 4 Effects of vitamin D3 supplemental level on serum IgM level and T cell subsets of Monopterus albus

表4显示，与对照组相比，500、1 000和2 000 IU/kg 3组血清CD3、CD4、CD8分子数量以及CD4/CD8均显著升高(P<0.05)，尤其以500和1 000 IU/kg 2组升高最为明显，而4 000 IU/kg组与对照组则无显著差异(P＞0.05)。
2.5 饲料中维生素D₃添加水平对黄鳝血清C3、C4水平和LSZ活性的影响

表5显示，随着维生素D₃添加水平的升高，血清C3水平呈现出先上升后下降的趋势，500和1 000 IU/kg组显著高于其他各组(P<0.05)，而4 000 IU/kg组则显著低于对照组(P<0.05)；血清C4水平变化趋势基本与C3一致，以500 IU/kg组最高，4 000 IU/kg组最低，与其他各组差异显著(P<0.05)。与对照组相比，500、1 000和2 000 IU/kg 3组血清LSZ活性显著升高(P<0.05)，尤以1 000和2 000 IU/kg 2组升高明显，而250和4 000 IU/kg组与对照组则无显著差异(P＞0.05)。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 饲料中维生素D3添加水平对血清C3、C4水平和LSZ活性的影响Table 5 Effects of vitamin D3 supplemental level on serum C3 and C4 levels and LSZ activity of Monopterus albus 项目 Items 维生素D3添加水平 Vitamin D3 supplemental level/(IU/kg) 0 250 500 1 000 2 000 4 000 补体3 C3/(mg/L) 27.13±3.21b 29.27±4.13b 49.54±1.49a 38.43±4.25a 29.56±3.34b 21.66±1.79c 补体4 C4/(mg/L) 11.75±2.24d 19.86±2.38d 48.92±2.36a 41.73±2.26b 29.33±3.27c 10.34±2.16d 溶菌酶 LSZ/(U/mL) 132.4±10.2c 121.6±11.4c 187.3±17.2b 253.6±16.8a 242.7±16.4a 140.4±18.5c

表5 饲料中维生素D3添加水平对血清C3、C4水平和LSZ活性的影响Table 5 Effects of vitamin D3 supplemental level on serum C3 and C4 levels and LSZ activity of Monopterus albus

表6显示，与对照组相比，500、1 000和2 000 IU/kg 3组全血WBC、GR、MID和LY数量均显著升高(P<0.05)，而250和4 000 IU/kg组则无显著差异(P＞0.05)，上述指标均表现出随着饲料维生素D₃添加水平的升高先上升后下降的趋势。

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 饲料维生素D3添加水平对黄鳝全血WBC、GR、MID、LY数量的影响 Table 6 Effects of vitamin D3 supplemental level on the number of WBC,GR,MID and LY of Monopterus albus ×109/L 项目 Items 维生素D3添加水平 Vitamin D3 supplemental level/(IU/kg) 0 250 500 1 000 2 000 4 000 白细胞 WBC 3.42±0.11c 3.77±0.19c 4.83±0.19a 4.92±0.22a 4.13±0.19b 3.61±0.17c 淋巴细胞 LY 0.22±0.05d 0.28±0.04cd 0.93±0.08a 0.65±0.11b 0.38±0.09c 0.36±0.04c 中性粒细胞 GR 2.83±0.19b 2.87±0.18b 3.06±0.21ab 3.34±0.19a 3.21±0.22a 2.85±0.17b 中值细胞 MID 0.38±0.26c 0.62±0.04b 0.85±0.12a 0.93±0.12a 0.55±0.12b 0.42±0.07c

表6 饲料维生素D3添加水平对黄鳝全血WBC、GR、MID、LY数量的影响Table 6 Effects of vitamin D3 supplemental level on the number of WBC,GR,MID and LY of Monopterus albus

本试验结果发现，饲料中维生素D₃添加水平能显著影响黄鳝生长性能。当维生素D₃添加量为500 IU/kg时，黄鳝WGR、SR、FCR等指标均优于其他各组；而维生素D₃添加水平为0和4 000 IU/kg时，上述指标无显著差异，并均低于其他各组。

人医临床病例发现，佝偻病患儿(维生素D缺乏)常易患呼吸系统感染，表明该类患者免疫力下降；大量流行病学及临床资料表明血液中维生素D₃水平降低时，易感各种急慢性传染性疾病，补充维生素D₃可显著减少上述疾病感染的发病率^[4]。上述文献资料报道结果提示，血液中维生素D₃水平与机体免疫功能密切相关。目前认为，维生素D₃对免疫功能的影响机制为：一方面，维生素D₃与单核细胞、巨噬细胞和B淋巴细胞等免疫细胞的VDR结合，影响其增殖分化和细胞因子的分泌；另一方面，通过活化多核细胞、单核细胞和巨噬细胞Toll样受体(toll-like receptors，TLRs)激活天然免疫反应，TLRs活化引起上述细胞表达的抗微生物多肽和活性氧，进而杀灭微生物^[5]，还可直接诱导骨髓和上皮细胞产生抗微生物多肽^[6]。

免疫球蛋白为有颌类脊椎动物所特有，其在血清中的水平高低是评估免疫状况的重要指标。鱼类主要的免疫球蛋白类型为IgM，在部分鱼类中也有免疫球蛋白Z(IgZ)(斑马鱼)、免疫球蛋白T(IgT)(虹鳟)、免疫球蛋白D(IgD)(斑点叉尾 )等免疫球蛋白类型^[7]，在黄鳝中至今只检测出IgM。本试验表明，饲料中添加维生素D₃提高了黄鳝血清IgM水平，提示维生素D₃可增强其体液免疫功能；尤以添加水平为1 000 IU/kg时提高作用最为明显，超过1 000 IU/kg后随维生素D₃添加水平的升高其促进作用逐渐减弱。有研究用1,25(OH)₂D₃作为佐剂，配合疫苗接种奶牛，结果显示能增加特异性抗体的产量^[8]，维生素D₃通过影响B淋巴细胞产生免疫球蛋白而提高奶牛机体的免疫能力^[9]，本试验结果与上述报道基本一致。

但也有维生素D₃抑制免疫球蛋白分泌的报道。研究发现，将1,25(OH)₂D₃与辅助性T细胞(helper T cell)共同培养2 d后，辅助性T细胞失去辅助B淋巴细胞产生抗体的能力，因而推测1,25(OH)₂D₃系通过抑制辅助性T细胞DNA合成来抑制抗体分泌^[10]；研究表明，1,25(OH)₂D₃通过抑制B淋巴细胞前体分化为浆细胞，从而减少浆细胞增殖和免疫球蛋白G(IgG)、IgM产生^[11]。由于研究背景不同，不同学者对同一问题得出不同甚至相反的结果，除因两者条件不同缺乏可比性外，很大程度上说明其影响因素十分复杂，有关调节机制还远未阐明。

血清CD3分子数量的变化可以反映T细胞总数的变化；CD4/CD8增大表示机体细胞免疫处于活跃状态，减小时则意味免疫抑制。本试验结果表明，与对照组相比，饲料中添加500、1 000和2 000 IU/kg维生素D₃均能提高CD3、CD8分子数量及CD4/CD8，提示维生素D₃能增强黄鳝的细胞免疫功能；但添加水平过高(4 000 IU/kg)时，上述指标与对照组无显著差异，提示添加水平过高或维生素D₃缺乏同样会抑制黄鳝的细胞免疫功能。在维生素D缺乏小鼠模型上取得的研究结果表明，维生素D缺乏和过量都会抑制T细胞调节免疫^[12]；对仔猪的研究发现，维生素D₃缺乏或过高(15 000 IU/kg)可抑制细胞免疫功能，降低由植物凝集素(PHA)刺激后的皮褶厚度^[13]。本试验结果与上述报道基本一致，该结果对黄鳝等水生动物健康养殖具有重要的应用价值。

C3、C4是补体系统中重要的固有成分。不论是经典激活途径还是替代激活途径，C3均是关键性的物质，其水平的高低与总补体的水平相平行，故通过C3水平的测定可反映血清总补体水平。C4则在经典途径的活化阶段起着重要作用。研究表明，给大鼠一次性注射或连续注射大剂量(10 000和200 000 IU)维生素D₃后，血清C3水平均升高，且剂量越大刺激作用越明显^[14]。研究发现，四川山地乌骨鸡血清中补体含量与饲料中维生素D₃水平呈剂量依赖性正相关^[15]。本研究结果说明，在饲料中添加中低水平 (500~1 000 IU/kg)维生素D₃能提高黄鳝血清补体水平，而添加高水平(4 000 IU/kg)维生素D₃则抑制补体产生。本研究结果与上述报道有差异，可能与动物种类、维生素D₃的用法和剂量以及试验周期不同等因素有关。

LSZ是评价机体非特异性免疫功能的重要指标。在断奶仔猪^[13]、大鼠^[14]、鸡^[15]进行的研究表明，维生素D₃能提高动物血清LSZ活性。本研究结果表明，用含适宜水平(500、1 000和2 000 IU/kg)维生素D₃的饲料饲喂黄鳝后，能显著增加其血清LSZ活性，增强非特异性免疫功能，而高水平维生素D₃与维生素D₃缺乏则均会导致非特异性免疫功能低下。

此外，本试验结果还表明，饲料添加适宜水平(500、1 000和2 000 IU/kg)的维生素D₃能显著提高黄鳝全血WBC、GR、MID和LY数量，改善机体免疫机能。

① 饲料添加适宜水平(500和1 000 IU/kg)的维生素D₃不仅能改善黄鳝的生长性能，而且能提高黄鳝血清IgM水平，CD4/CD8、LSZ活性及全血GR、MID和LY数量，从而增强黄鳝体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能，提高对病菌的防御能力。

② 饲料维生素D₃水平过高或缺乏均可导致黄鳝免疫功能低下。