亚油酸是动物体内最重要的必需脂肪酸之一，研究发现亚油酸不仅可以为蜜蜂提供能量，而且会直接影响其生长和繁殖^[1]。微生物是使昆虫致病的主要因素，脂肪酸具有抑制细菌和真菌活性的作用，癸酸、月桂酸(十二烷酸)、肉豆蔻酸、亚油酸、亚麻酸等一系列脂肪酸都具有抗微生物作用^[2]。另外，有研究认为蜜蜂肠道中高浓度的亚油酸和亚麻酸对蜜蜂抵抗细菌、真菌感染具有重要作用^{[3, 4]}。Manning等^[5]研究发现，饲粮中脂肪酸的含量和昆虫的寿命有紧密的联系，饲粮中脂肪酸含量过高或过低都会降低蜜蜂的寿命，当饲粮中亚油酸含量高于6%或者油酸含量高于2%时，蜜蜂的寿命会显著缩短，而当饲粮中缺乏脂肪酸时，蜜蜂的寿命也会降低。饲粮中的多不饱和脂肪酸(PUFA)对脂肪酸的生化合成和氧化有独特的调控作用，PUFA对基因表达的调控至少存在2种机制:1)过氧化物酶增殖物激活受体(PPARs)依赖机制，如诱导编码乙酰基辅酶A氧化酶(AOX)的基因表达；2)PPARs非依赖机制^[6]。PPARs是调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员^[7]，其存在几种不同的亚型，分别为PPARα、PPARβ及PPARγ1和PPARγ2，由3种独立的基因编码3种不同的PPARs(PPARα、PPARβ、PPARγ)。PPARs是类固醇受体族中的一员，与族中其他受体一样，具有1个DNA结合域和1个配体结合域。配体结合域是与脂肪酸等配体结合的部分，配体与受体的这种结合可活化受体(即PPARs)；DNA结合域是与基因上的DNA与特异反应元件相结合的部分，通过这种特异性结合调节基因转录^[8]。近年来研究发现脂肪酸可以调控一些编码代谢关键酶的基因表达，对脂肪酸的生化合成和氧化起独特的调控作用。李琪玲等^[9]研究发现，连续给予小鼠灌胃共轭亚油酸(CLA)4周，发现饲喂CLA的小鼠肝脏中脂肪酸合成酶(FAS)含量显著降低；Zhou等^[10]、Pariza等^[11]也发现，CLA能抑制猪皮下脂肪FAS的表达，进而降低皮下脂肪沉积，但CLA对肌内脂肪FAS的表达却起到了促进作用，增加了肌内脂肪的沉积。另外，脂肪酸不仅对FAS的表达有影响，同时也可以调节乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的转录，Iritani等^[12]在培养的肝细胞中添加紫苏籽油(富含PUFA)，ACC mRNA的丰度显著降低。这充分说明了脂肪酸不仅是供能物质和生物膜的重要组成部分，而且可通过调节脂肪代谢相关基因表达而发挥重要的生理功能。但关于亚油酸对蜜蜂幼虫生长发育与脂肪代谢影响的研究鲜有报道，而且在人工饲养条件下，目前国内外对于亚油酸在蜜蜂饲粮中的适宜添加水平还没有明确的参考标准。本文拟通过体外幼虫培养试验，研究饲粮中亚油酸添加水平对意大利蜜蜂工蜂幼虫化蛹时体重、化蛹率、虫体蛋白质浓度、幼虫FAS活性、ACC浓度及其基因表达的影响，以期确定适合工蜂幼虫生长发育的最适亚油酸添加水平，同时为亚油酸对蜜蜂乃至昆虫脂类代谢作用机制的深入研究提供参考。

在基础饲粮中分别添加0(对照组)、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%和0.10%的亚油酸，制成6种试验饲粮。试验饲粮的组成见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 试验饲粮组成 Table 1 Composition of experimental diets % 原料 Ingredients 亚油酸添加水平 Linoleic acid supplemental level/% 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 蜂王浆 Royal jelly 50.00 50.00 50.00 50.00 50.00 50.00 葡萄糖 Glucose 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 果糖 Fructose 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 酵母提取物 Yeast extract 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 无菌水 Sterile water 37.00 36.98 36.96 36.94 36.92 36.90 亚油酸 Linoleic acid 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 合计 Total 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00

表1 试验饲粮组成 Table 1 Composition of experimental diets

试验分2批饲养，每一批都选取576只1日龄意大利蜜蜂工蜂幼虫，随机分为6组，每组96只。第1批用于蛋白质浓度、酶活性和基因表达量的测定，第2批用来测定幼虫化蛹时体重和化蛹率。将幼虫置于48孔细胞培养板中饲养，培养板放入培养箱中(35 ℃、相对湿度90%)，试验期间每天饲喂1次，每孔每次饲喂150 μL。幼虫生长发育过程见图1。

图1(Figure 1)

Fig. 1

图1 幼虫生长发育过程 Fig. 1 Larval growth and development process

饲养至5～7日龄时采集样品，每天从每组中随机抽取6只蜜蜂幼虫。称重后，-80 ℃保存用于后续指标检测。

把幼虫转移至化蛹板时，用电子天平称重并记录数据。

从饲养第1天开始，每天观察记录幼虫的死亡情况，将死亡个体移除，直至未死亡幼虫全部化蛹，记录化蛹个数。

取幼虫加入适量生理盐水，制成1%组织匀浆，采用A045-2总蛋白定量测试盒(南京建成生物工程研究所生产)测定蛋白质浓度。

每测定1种酶活性，取10%组织匀浆10 μL，采用蜜蜂酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(北京雅安达生物技术有限公司生产)测定。

采用Trizol法提取总RNA，并用微量分光光 度计检测所提RNA的浓度和纯度。用PrimeScript^TM RT Reagent Kit(TaKaRa:DRR037A)将RNA反转录成cDNA。委托上海生工生物工程公司设计并合成RT-PCR引物。采用SYBR Premix Ex Taq^TM 试剂盒(TaKaPa:DRR420A)进行目的基因的相对定量检测，反应体系为20 μL。反应条件为：95 ℃预变性10 s，循环数为1；95 ℃变性5 s，60 ℃退火40 s，循环数为40，添加熔解曲线，循环数为1。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 RT-PCR引物序列 Table 2 Primer sequences for RT-PCR 目的基因 Locus genes 引物序列 Primer sequences (5’—3’) 产物长度 Product length/bp GenBank登录号 GenBank accession No. 脂肪酸合成酶FAS F:TGATTCTCCTCTTGGGATGTCTR:CAGCACCACTCTCTATCCTTCA 140 XM_396268 乙酰辅酶A羧化酶ACC F:TCAACCACGACATAAACCTCAAR:TACCGAGAAATAACCCCAAACA 151 XM_003250552.1 β-肌动蛋白β-actin F:CCGTGATTTGACTGACTACCTR:AGTTGCCATTTCCTGTTC 142 NM_001185145

表2 RT-PCR引物序列 Table 2 Primer sequences for RT-PCR

数据统计均采用SAS 9.1统计软件的ANOVA程序进行单因素方差分析，以Duncan氏法进行多重比较，试验数据以平均值±标准差的形式表示，通过回归分析对剂量-效应关系作二次曲线拟合，根据二次方程计算最适添加水平。P<0.05代表差异显著。

结果(表3)显示，饲粮亚油酸添加水平对工蜂幼虫化蛹时的体重无显著影响(P>0.05)，但对化蛹率有显著影响(P<0.05)，其中饲粮亚油酸添加水平为0.10%时，较其他添加水平显著降低了化蛹率(P<0.05)。将化蛹率(Y)与饲粮亚油酸添加水平(X)进行曲线拟合，得到曲线方程：Y=-9 936.7X²+479.67X+91.969(R²=0.895 2)，由方程得出，当亚油酸添加水平为0.024%时化蛹率最高。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 饲粮亚油酸添加水平对幼虫化蛹时体重和化蛹率的影响 Table 3 Effects of linoleic acid supplemental level on body weight when pupation and the percentage of pupation of larvae 亚油酸添加水平 Linoleic acid supplemental level/% 化蛹重 Body weight of larvae when pupation/g 化蛹率 Percentage of pupation/% 0 0.274 035±0.005 215 94.643±5.357a 0.02 0.262 852±0.004 638 96.131±0.298a 0.04 0.282 733±0.005 845 90.417±2.917a 0.06 0.268 314±0.004 929 81.500±6.500a 0.08 0.268 964±0.007 312 80.682±5.682a 0.10 0.280 455±0.011 779 33.737±7.930b P值 P-value 0.170 8 0.001 3 同列数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。下表同。 In the same column,values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P＞0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P＜0.05). The same as below.

表3 饲粮亚油酸添加水平对幼虫化蛹时体重和化蛹率的影响 Table 3 Effects of linoleic acid supplemental level on body weight when pupation and the percentage of pupation of larvae

饲粮亚油酸添加水平对幼虫虫体蛋白质浓度的影响如表4所示。对于5日龄幼虫，亚油酸添加水平为0.04%时，虫体蛋白质浓度显著高于对照组(P<0.05)，其他组与对照组无显著差异(P>0.05)；饲粮亚油酸添加水平对7日龄蛹体蛋白质浓度有显著影响(P<0.05)，随饲粮亚油酸添加水平的增加，7日龄蛹体蛋白质浓度呈现先上升后下降的趋势，但是亚油酸添加水平为0.02%～0.08% 时，与对照组相比差异不显著(P>0.05)，仅亚油酸 添加水平为0.10%时显著抑制了虫体蛋白质的沉积(P<0.05)。将虫体蛋白质浓度(Y)与饲粮亚油酸添加水平(X)进行曲线拟合，得到如下曲线方程：Y=-29.381X²+2.148X+0.416 1(R²=0.884 3)，由方程可知，当亚油酸添加水平为0.037%时虫体蛋白质浓度最高。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 饲粮亚油酸添加水平对幼虫虫体蛋白质浓度的影响 Table 4 Effects of linoleic acid supplemental level on body protein concentration of larvae 亚油酸添加水平 Linoleic acid supplemental level/% 5日龄 5 days old 6日龄 6 days old 7日龄 7 days old 0 0.33±0.02b 0.36±0.02 0.43±0.02ab 0.02 0.33±0.01b 0.33±0.02 0.42±0.02ab 0.04 0.39±0.02a 0.36±0.01 0.47±0.02a 0.06 0.34±0.02b 0.33±0.01 0.45±0.01a 0.08 0.35±0.01ab 0.36±0.01 0.39±0.00bc 0.10 0.34±0.01b 0.33±0.02 0.34±0.01c P值 P-value 0.128 7 0.443 9 0.006 7

表4 饲粮亚油酸添加水平对幼虫虫体蛋白质浓度的影响 Table 4 Effects of linoleic acid supplemental level on body protein concentration of larvae

由表5可以看出，饲粮亚油酸添加水平对6日龄幼虫PPARα活性有显著影响(P<0.05)。0.02%组PPARα活性较对照组显著降低(P<0.05)，0.04%和0.08%组PPARα活性较对照组显著升高(P<0.05)，0.06%和0.10%组与对照组差异不显著(P>0.05)，但有升高的趋势。与对照组相比，仅0.08%组PPARγ的活性显著提高(P<0.05)。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 饲粮亚油酸水平对幼虫PPARs活性的影响 Table 5 Effects of linoleic acid supplemental level on PPARs activities of larvae U/L 亚油酸添加水平 Linoleic acid supplemental level/% 过氧化物酶增殖物激活受体α PPARα 过氧化物酶增殖物激活受体γ PPARγ 0 32.49±5.01c 166.53±28.06b 0.02 22.62±1.84d 231.60±54.35b 0.04 43.37±0.79b 184.73±2.67b 0.06 38.97±1.52bc 176.86±3.41b 0.08 99.66±2.79a 409.78±20.12a 0.10 33.57±2.59bc 169.92±8.33b P值 P-value <0.000 1 0.002 8

表5 饲粮亚油酸水平对幼虫PPARs活性的影响 Table 5 Effects of linoleic acid supplemental level on PPARs activities of larvae

如表6所示，饲粮亚油酸添加水平对5日龄幼虫和7日龄蛹的FAS活性无显著影响(P>0.05)，仅显著影响了6日龄幼虫的FAS活性(P<0.05)。随饲粮亚油酸添加水平的增加，6日龄幼虫FAS活性呈现先上升后下降的趋势，其中0.04%、0.06%、0.08%组的FAS活性显著高于对照组(P<0.05)，FAS活性的峰值出现在亚油酸添加水平为 0.08%时，当添加水平继续增加至0.10%时，FAS 活性又降低到与对照组相近的基础水平。

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 饲粮亚油酸添加水平对幼虫FAS活性的影响 Table 6 Effects of linoleic acid supplemental level on FAS activity of larvae U/mL 亚油酸添加水平 Linoleic acid supplemental level/% 5日龄 5 days old 6日龄 6 days old 7日龄 7 days old 0 33.87±6.73 18.98±2.19c 60.88±5.24 0.02 32.44±3.89 26.49±2.66bc 63.87±1.94 0.04 31.47±6.67 40.51±8.60ab 64.40±1.35 0.06 44.52±2.39 33.71±5.49abc 66.98±1.19 0.08 26.95±3.70 50.79±7.75a 65.40±2.57 0.10 43.93±7.11 29.60±5.33bc 64.71±2.79 P值 P-value 0.170 0 0.020 7 0.769 6

表6 饲粮亚油酸添加水平对幼虫FAS活性的影响 Table 6 Effects of linoleic acid supplemental level on FAS activity of larvae

由表7可以看出，饲粮亚油酸添加水平仅对5和6日龄幼虫ACC浓度有显著影响(P<0.05)，对7日龄蛹的ACC浓度无显著影响 (P>0.05)。与对照组相比，0.06%和0.08%的 亚油酸能显著提高5日龄幼虫的ACC浓度(P<0.05)，但是仅0.08%的亚油酸提高了6日龄幼虫的ACC浓度(P<0.05)。

表7

Table 7

表7(Table 7)

表7 饲粮亚油酸添加水平对幼虫ACC浓度的影响 Table 7 Effects of linoleic acid supplemental level on ACC concentration of larvae ng/mL 亚油酸添加水平 Linoleic acid supplemental level/% 5日龄 5 days old 6日龄 6 days old 7日龄 7 days old 0 9.45±2.15b 22.24±6.24b 94.73±1.63 0.02 10.68±3.38b 20.34±0.63b 96.67±3.67 0.04 20.02±1.58ab 22.49±0.73b 96.46±3.19 0.06 25.82±3.58a 17.51±0.55b 96.58±2.08 0.08 19.37±4.42ab 95.78±6.84a 96.12±1.73 0.10 32.19±5.15a 18.69±3.80b 98.44±3.29 P值 P-value 0.017 8 <0.000 1 0.960 2

表7 饲粮亚油酸添加水平对幼虫ACC浓度的影响 Table 7 Effects of linoleic acid supplemental level on ACC concentration of larvae ng/mL

由图2可以看出，饲粮亚油酸添加水平对5、7日龄幼虫FAS基因相对表达量的影响不显著(P>0.05)。

图2(Figure 1)

Fig. 2

同一日龄，数据柱形标注相同或无小写字母表示差异不显著（P>0.05），不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。下图同。 Value columns of the same days old with no or the same small letters mean no significant difference (P>0.05)， while with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as below.图2 饲粮亚油酸添加水平对意蜂幼虫FAS 基因相对表达量的影响 Fig. 2 Effects of linoleic acid supplemental level on FAS gene relative expression level of larvae

饲粮亚油酸添加水平对5日龄幼虫ACC基因相对表达量的影响不显著(P>0.05)(图3)，对7日龄幼虫来说，与对照组相比，0.02%组ACC基因相对表达量有上升的趋势，0.04%和0.10%组有下降的趋势，且0.02%组ACC基因相对表达量显著高于0.04%和0.10%组。

图3(Figure 3)

Fig. 3

图3 饲粮亚油酸添加水平对幼虫ACC 基因相对表达量的影响 Fig. 3 Effects of linoleic acid supplemental level on ACC gene relative expression level of larvae

本试验结果表明，饲粮添加不同水平的亚油酸对意蜂幼虫化蛹时体重无显著影响。目前关于亚油酸对昆虫生长性能影响的研究极少，但在畜禽上研究较多。以畜禽为例，李荣刚等^[13]研究表明饲粮添加亚油酸对断奶至2月龄肉兔平均日增重无显著影响。Uwayjan等^[14]通过饲喂不同日龄蛋鸡富含亚油酸的饲粮，同样发现其对生长性能无显著影响。本试验在意大利蜜蜂工蜂幼虫上的研究结果与上述报道相似，发现饲粮添加亚油酸并未显著改变工蜂幼虫化蛹时的体重。然而，王菊花等^[15]研究表明，当饲粮中CLA的添加量为1.0%和2.0%时，可以显著提高断奶仔猪的日增重和饲料利用率。在家禽方面，刘光芒等^[16]研究发现，添加低水平的CLA可以提高肉鸭生产性能，但添加水平过高则会降低平均日增重。由此可见，亚油酸对畜禽乃至蜜蜂体增重的影响仍存在争议，这可能与添加的亚油酸的剂量、种类，研究的物种，物种所处的生理阶段以及饲养管理等因素有关。

对化蛹率的统计结果显示，当亚油酸添加水平为0.10%时，幼虫化蛹率显著下降，其他组无显著差异。分析可能是因为PUFA结构中的不饱和双键会发生过氧化反应，产生自由基，细胞自由基过多会使细胞功能减弱，导致幼虫无法进入蛹期。由此可见，工蜂幼虫饲粮中亚油酸的水平应该处于一个合理范围内，并非多多益善。

本试验结果显示，饲粮亚油酸添加水平亚油酸对5、6日龄幼虫虫体蛋白质浓度无显著影响，而对7日龄幼虫虫体蛋白质浓度有影响显著，亚油酸添加水平适中时，虫体蛋白质浓度最高，添加水平过高则会降低虫体蛋白质浓度。付世建等^[17]通过饲喂南方鲇不同蛋白质脂肪比的饲料，发现提高饲料中脂肪含量将有助于提高蛋白质的利用效率，具有节约蛋白质的效果。以上研究的结果与本试验在工蜂幼虫上的结果相吻合，即低水平亚油酸可以提高机体蛋白质浓度，这可能是因为脂肪和蛋白质之间可以相互转化，而亚油酸水平偏高时会对幼虫的生理机能产生负面影响，这可能在一定程度上影响了蛋白质的代谢，所以高水平亚油酸反而降低了虫体蛋白质浓度。

尽管3种PPARs亚型的氨基酸序列相似，但研究表明PPARα和PPARγ分别在脂质代谢和储存中具有不同的功能^[18]。PPARα主要在肝脏中表达，在饥饿状态下活化，通过调节涉及脂肪酸动员、活化和降解过程中的多种基因来提供能量，并起到降低血脂的作用^{[19, 20, 21, 22]}。PPARγ主要存在于脂肪组织，在生理状态下，PPARγ主要在进食后激活，促进脂肪在脂肪组织聚集^{[23, 24]}。

本试验结果显示，虫体的PPARs活性受饲粮亚油酸添加水平的影响，当亚油酸添加水平升高到0.08%时，虫体PPARα和PPARγ活性均显著高于对照组，整体上呈现上升的趋势。有研究证明，脂肪酸及其衍生物可以作为配体有效激活PPARs^{[25, 26]}。赵占宇^[27]通过在大黄鱼基础饲粮中添加0、1%、2%和4%的CLA，发现CLA(0.4 g/kg BW)能够显著提高大黄鱼肝脏中PRARα和PPARγ基因的表达量。另外，马宏峰^[28]也发现亚油酸可以促进高脂小鼠PPARγ mRNA的表达。本试验在意大利蜜蜂工蜂幼虫上的研究结果与前人在其他动物上的研究结果基本一致，说明适宜添加水平的亚油酸对工蜂幼虫PPARs同样具有激活作用。

脂肪酸的饱和程度不同，对脂肪代谢相关酶的影响也不一样，影响强弱顺序从大到小依次是PUFA、单不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸。本试验研究了饲粮亚油酸添加水平对意大利蜜蜂幼虫虫体FAS活性和ACC浓度的影响，结果显示亚油酸在低水平范围显著提高了FAS活性和ACC浓度，亚油酸添加水平过高时则会降低FAS的活性。FAS是催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A合成脂肪酸的酶类，ACC是催化脂肪合成的限速酶，其浓度的高低直接影响脂肪沉积量，它们均在脂肪代谢方面发挥重要作用^[29]。

Mersmann等^[30]在成年猪饲粮中添加脂肪酸，降低了脂肪酸合成的速度以及FAS和ACC的活性。Toussant等^[31]分别用无脂肪、含红花油(主要为PUFA)和含牛脂(主要为饱和脂肪酸)的饲粮喂大鼠，发现饲喂含红花油饲粮的大鼠肝脏FAS和ACC的活性显著低于饲喂含牛脂饲粮和无脂肪饲粮的大鼠。

以上这些报道都认为PUFA对脂肪代谢相关酶有抑制作用，这与本试验结果略有差异，猜测可能是由于脂肪酸种类、添加量，测定的组织部位和不同物种生理代谢的差异造成的。

本试验中，饲粮亚油酸添加水平对FAS和ACC基因的相对表达量均无显著影响。一些试验已证明：受PUFA抑制的生脂酶包括FAS、ACC、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、L-丙酮酸激酶和S14蛋白^[32]。Blake等^[33]通过饲喂大鼠PUFA(鱼油)和饱和脂肪酸，发现饲喂PUFA的大鼠肝脏中FAS mRNA丰度是饲喂饱和脂肪酸的6%，这说明了饲粮PUFA是FAS mRNA表达的强抑制剂。Clarke等^[34]研究发现饲粮中的PUFA可使大鼠肝脏中的FAS mRNA水平降低了75%~90%。韩立强等^[35]研究了CLA对小鼠乳腺脂肪合成相关基因表达的影响，发现1.5% CLA组(1.5% CLA+0.5%花生油)与对照组(2%花生油)相比，母鼠乳腺组织的FAS和ACC的mRNA表达量显著降低。但是李荣刚^[36]研究认为饲粮亚油酸水平对断奶至3月龄生长肉兔的肝脏ACC mRNA表达量影响不显著，这与本试验结果一致。

综合化蛹率和虫体蛋白质浓度2个指标并做拟合曲线得出，在人工饲养条件下，意大利蜜蜂工蜂幼虫饲粮中亚油酸的适宜添加水平为0.024%～0.037%。