自从1973年Rotruck等发现硒是谷胱甘肽过氧化物酶的组成部分以来，到目前为止人们已在人类发现了25种硒蛋白，在啮齿动物鼠中发现了24种硒蛋白^[1]。硒蛋白是一类特殊蛋白质，其硒代半胱氨酸(selenocysteine,Sec)合成进入蛋白质是由密码子UGA介导的翻译行为。在没有特殊识别因子存在时，UGA是1个终止信号；而在有特殊识别因子时，该密码子则指导Sec合成掺入到蛋白质分子中，故Sec被认为是第21种氨基酸^[2]。哺乳动物硒蛋白mRNA在其3′-非编码区(3′-UTR)中都含有Sec插入序列(selenocysteine insertion sequence，SECIS)，其二级结构为茎环结构，在蛋白质合成时，它与SECIS结合蛋白2、特殊转录因子共同作用，识别编码Sec的密码子UGA^{[3, 4]}。

目前在人和鼠中已经通过试验探明了部分硒蛋白的功能，但大部分硒蛋白生物学功能尚不清楚，当中包括硒蛋白X(SelX)。研究发现SelX基因的mRNA转录产物组织分布广泛，尤其在肝脏、白细胞等中表达量较高^[5]。猪与人类在生理结构和功能上具有多方面的相似性，这些相似性使猪成为人类一些疾病的理想动物模型^[6]，以猪为模型研究SelX生物学功能具有重要意义。在此本试验拟克隆猪SelX基因，并对其Sec密码子进行定点突变后，构建原核表达载体，表达SelX基因突变体蛋白(SelXm)，制备猪SelXm多克隆抗体，为进一步以猪为模型研究SelX生物学功能奠定基础。

健康成年雄性家兔2只(体重2.0~2.5 kg)，购自四川农业大学教学农场，克隆载体pMD18-T购自宝生物工程(大连)有限公司，大肠杆菌TOP10、原核表达载体pET30，大肠杆菌BL21(DE3)等由本实验室保存。

DNA限制性内切酶、AMV第1链cDNA合成试剂盒、T4 DNA连接酶、pfu Taq DNA聚合酶、DNA分子质量标准、3′-full RACE core set、定点突变试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司；总RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司，DNA凝胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒、快速质粒小量提取试剂盒均购自Omega公司；琼脂糖购自Biowest公司；胰蛋白胨和酵母提取物均为OXOID公司产品；His-tag凝胶层析介质购自GE公司产品；其余试剂为国产分析纯试剂；引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

通过NCBI GeneBank数据库查询猪表达序列标签(ESTs)，获得1段与与人SelX基因具有同源性的序列(GenBank登录号：CV874267)，根据该序列设计cDNA末端快速克隆(3′-RACE)上游引物F1：5′-AGGCTCAAGACCCTGCGGTGGA-3′，与3′-full RACE core set试剂盒里的3′-adaptor primer构成引物对，扩增含完整3′-端全长的SelX基因。新鲜采取长白猪肝脏组织，采用Trizol试剂盒提取总RNA，检测其质量合格后，用于克隆SelX基因。以总RNA为模板，以Oligo(dT)-3′-site Primer为引物，按3′-full RACE core set试剂盒操作合成第1链cDNA。再以F1和3′-adaptor primer组成引物对，以合成的第1链cDNA为模板扩增获得含完整ORF至poly(A)的SelX基因序列。PCR反应条件为：94 ℃初始变性5 min，然后经过35个循环(94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1.5 min)，然后72 ℃延伸10 min结束，4 ℃保存。采用T/A克隆将扩增片段连接到pMD18-T载体，采用蓝白筛选方法筛选阳性克隆，经PCR验证后进一步将获取的目的DNA送上海英骏生物技术有限公司测序。本试验中分子生物学操作参照相应试剂盒说明和《精编分子生物学实验指南》^[7]。利用NCBI Blast、SECISearch 2.18等在线分析软件对克隆的DNA序列进行序列分析，确认后提交NCBI GenBank。

以克隆的SelX-pMD18-T质粒为模版，在SelX基因的ORF内Sec密码子TGA附近设计突变引物突变引物MX-F：5′-TCAGCAGTTCCCTGAAGTTCATC-3′和MX-R：5′-ATATACAGAAGCGGGACTGTCC-3′，应用反向PCR技术，利用突变引物对进行PCR扩增，对SelX基因实现定点突变，将密码子由TGA突变成TGT。按定点突变试剂盒(TaKaRa)操作说明进行突变PCR、Blunting Kination反应和连接(Ligation)反应。电转化后，细胞涂布LB平板(含青霉素)，37 ℃过夜培养至长出单菌落，挑取单克隆菌落进行PCR验证和测序验证。

根据SelX基因的ORF设计EX-F：5′-ATATCGGATCCATGTCGTTCTGCAGCTTC-3′(引入BamHⅠ酶切位点)和Ex-R：5′-GCCGCAAGCTTGCTACTGTCCCTGGGAGG-3′(引入HindⅢ酶切位点)引物对，用于PCR扩增和原核表达载体构建。以上述突变SelX基因重组质粒为模板，pfu Taq DNA 聚合酶PCR扩增后，PCR产物经过乙醇沉淀回收并测定浓度，分别用BamHⅠ和HindⅢ双酶切处理。同时对pET30质粒进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切处理，PCR产物和pET30质粒经双酶切处理后，经1%琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒回收相应目的DNA和质粒酶切片段。DNA片段与相应酶切线性化处理的pET30载体采用T4 DNA连接酶于16 ℃过夜连接，用Qiagen PCR回收试剂盒回收连接片段后用于电转化。连接产物pET30-SelXm重组质粒转化大肠杆菌Top10感受态细胞细菌，涂布于新鲜LB平板，37 ℃过夜培养后挑取单菌落进行阳性克隆PCR筛选和双酶切鉴定。构建好的pET30-SelXm表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)细胞，筛选转化子，阳性菌落命名为pET30-SelXm/BL21。

pET30-SelXm/BL21和阴性对照菌株pET30/BL21分别接种于20 mL的LB培养基中(含卡那霉素30 mg/L)37 ℃ 200～250 r/min悬浮培养过夜，次日按1%转接至100 mL新的培养液中(含卡那霉素30 mg/L)，当OD_{600 nm}为0.4时，加入0.5 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导培养。在诱导后1、2、3 h时取菌液1 mL于离心管中，4 ℃ 8 000×g离心10 min收集菌落，加入1 mL磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细菌，再次离心收集菌体，最后用50~100 μL蒸馏水调整各样品菌样浓度尽量一致。取20 μL菌样，加入5 μL十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上样缓冲液，100 ℃煮沸10 min后，冰水放置5 min，样品离心后，取20 μL用于12% SDS-PAGE检测并分析重组蛋白表达量。根据电泳结果确定合适的诱导条件后，扩大培养体积至1 L，收集菌样用于目的蛋白纯化，该蛋白记为SelXm。用于蛋白质纯化的菌体按加入裂解液[50 mmol/L Tris pH 8.0,10 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),0.1 mol/L氯化钠(NaCl),0.25 mg/mL溶菌酶]，先冰浴超声波粉碎菌体，然后37 ℃水浴2 h。12 000×g 4 ℃，离心10 min收集包涵体，用8 mmol/L尿素溶解后，调整溶液pH为7.4，NaCl为0.5 mol/L，然后进行Ni Sepharose^TM亲和层析，纯化的蛋白质样品转入分子截留质量3.5 ku透析袋透析后，分装放-20 ℃保存。

用纯化的SelXm常规免疫家兔，每次免疫剂量为0.3 mg，溶于PBS中。首次免疫，将纯化的蛋白质加入等体积的弗氏完全佐剂，在涡旋振荡仪中振荡混匀，形成“油包水”状乳悬液，充分乳化后采取背部多点皮下免疫注射，每点注射约100 μL。2周后用同样剂量蛋白质与等体积的弗氏不完全佐剂混合后进行加强免疫。后每隔10 d，进行1次加强免疫，共进行2次加免。最后1次加强免疫后6 d，颈静脉采血，制备血清。以家兔免疫前耳静脉采集的血清作为阴性对照。

用抗原包被液(pH 9.6)稀释纯化蛋白质浓度为2 μg/mL，取100 μL纯化蛋白质(抗原)液置于96孔酶标板中，37 ℃放置过夜。然后用PBS-吐温(PBST)洗涤酶标孔3次，加入封闭液200 μL/孔于酶标板中，置37 ℃封闭1~2 h。用PBST洗涤酶标孔3次后，每孔加入稀释的待测样品抗血清(1 ∶ 500、1 ∶ 1 000、1 ∶ 2 500、1 ∶ 5 000、1 ∶ 10 000、1 ∶ 20 000)，以免疫前的血清作为相应阴性对照，加盖37 ℃孵育2 h。PBST洗涤酶标板3次后，每孔100 μL加封闭液稀释的辣根过氧化物(HRP)标记山羊抗兔酶标抗体(1 ∶ 2 500倍稀释)，37 ℃孵育1 h。PBST洗涤3次后，每孔加入100 μL新鲜配制的四甲基联苯胺(TMD)底物显示液，置暗处反应20 min。用100 μL/孔2 mmol/L H₂SO₄终止反应后，置于酶标仪中，在450 nm波长读数。若待测孔OD_{450 nm}大于或等于阴性对照孔的2.1倍，即认为是阳性值，从而得出血清的抗体效价。

将纯化的SelXm融合蛋白及空载体进行SDS-PAGE后，进行蛋白质免疫印迹(Western blot)分析，用半干法电转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%牛血清白蛋白(BSA)封闭后，以本试验制备的兔抗血清(1 ∶ 10 000)为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1 ∶ 2 000)为二抗进行反应。显色反应参照Millpore公司的ECL化学发光底物说明书进行，底片曝光操作参照《精编分子生物学实验指南》^[7]。同时对猪肝脏样品提取总蛋白，进行SDS-PAGE电泳后，进行Western-blot分析，检测制备的兔抗血清是否对肝脏中SelX具有免疫原性。

以猪肝脏总RNA为模板，经反转录合成第1链cDNA片段。利用F1引物，采用3′-RACE方法，扩增出了1条1 215 bp的目标基因片段(图1-A)。扩增的DNA片段经T/A克隆后，送上海英骏生物技术有限公司进行序列测定确定，获得了包含完整3′-UTR和ORF的SelX基因，经NCBI Blast比对分析该基因ORF区长348 bp，编码116个氨基酸残基，猪SelX Sec残基位于C-端第95个残基，ORF编码区与人SelX基因ORF区有88%序列同源性，编码的蛋白质序列与人SelX具有91%序列同源性(图1-B)。猪SelX基因提交NCBI GenBank数据库，序列号为：EF113597。SelX基因经SECISearch 2.18软件分析，具有典型的硒蛋白特有的3′-UTR SECIS发夹结构(图1-C)。采用SingalP 3.0在线软件(www.cbs.dtu.dk/services/singalP/)对克隆的猪SelX基因进行信号肽预测，结果显示SelX没有信号肽切割位点。

图1(Figure 1)

Fig. 1

A.猪SelX基因RT-PCR分析(M:DNA分子质量标准，1:PCR扩增产物)。B.猪、人和小鼠SelX氨基酸序列比对分析（高亮部分为保守残基，SelX氨基酸序列中Sec用“U”表示，SelX基因GenBank登录号：ABL61085.1（猪）、AAN61472.1(人)和BAE39689.1(鼠)]。C.猪SelX基因3′-UTR SECIS发夹结构分析。 A. RT-PCR analysis of porcine SelX gene (M: DNA molecular weight marker, lane 1: RT-PCR product). B. homology contrast analysis of SelX amino acid sequence among pig, human and mouse [conserved residues were highlighted. Sec was indicated as ‘U’ in the animo acid sequence of SelX. Accession numbers of SelX in GenBank were ABL61085.1 (pig), AAN61472.1 (human) and BAE39689.1 (mouse)]. C. SECIS hairpin structure analysis of 3′-UTR of pig. 图1 猪SelX的基因克隆及其蛋白氨基酸序列和基因序列分析 Fig. 1 Gene cloning,protein and gene sequence analysis of porcine SelX

构建好的表达载体测序结果显示Sec的编码密码子TGA突变成TGT(图2-A)，TGA在原核表达系统中是1个终止密码子经过突变成TGT后，可以在原核系统中表达目的蛋白。突变体表达载体pET30-SelXm转入大肠杆菌BL21(DE3)细胞，随机挑选3个阳性转化，采用菌落PCR，以EX-F和EX-R引物对进行PCR扩增，均扩增出分子质量约为360 bp大小的DNA片段(图2-B),与预期DNA片段大小一致，说明突变基因原核表达载体构建并转化成功。

图2(Figure 2)

Fig. 2

A.SelX基因突变前后序列（方框部分TGA密码子定点突变成TGT密码子）。B.pET30-SelXm转化子菌落PCR筛选（M:DNA分子质量标准，1~3：pET30-SelXm/BL21菌落PCR扩增产物）。 A. sequences of SelX gene before and after mutation (the codons in block indicated the mutation of TGA to TGT). B. PCR analysis of recombinant plasmid pET30-SelXm (M: DNA molecular weight marker, lanes 1 to 3: colony PCR product of pET30-SelXm/BL21). 图1 猪SelX的基因克隆及其蛋白氨基酸序列和基因序列分析 Fig. 2 Identification of site-directed mutagenesis of Sec codon and recombinant expression plasmids of SelX gene

pET30-SelXm/BL21经过IPTG诱导培养表达出目的蛋白，空载质粒pET30/BL21诱导后不能表达目的蛋白(图3-A)，经0.5 mmol/L IPTG诱导2 h即可获得理想的目的蛋白表达量。表达的蛋白经过His-tag亲和层析，得到纯化的目的蛋白，SDS-PAGE显示分子质量约为18.0 ku(图3-A)。

纯化的SelX基因突变体融合蛋白免疫家兔，经加强免疫后，颈部静脉采集血液，室温放置1 h，放入4 ℃冰箱过夜，制备抗血清。采用酶联免疫分析(ELISA)法测定多克隆抗体效价，以免疫前兔血清作为对照，结果显示，经过免疫后，制备的抗血清效价高达1 ∶ 20 000(表1),利用免疫印迹(Western-blot)方法检测表明，所获得的多克隆抗体能与纯化的SelXm特异性结合(图3-A)，制备的多克隆抗体(抗血清)与肝脏中的SelX具有交差反应(图3-B)。

图3(Figure 3)

Fig. 3

M:蛋白质分子质量标准，1:pET30-SelXm/BL21经IPTG诱导表达结果，2:pET30/BL21 IPTG诱导表达结果，3、4:纯化的重组蛋白SelXm，5、6:纯化的SelXm重组蛋白兔抗血清Western blot检测条带，7:纯化的重组蛋白SelXm，8:提取的猪肝脏总蛋白样品，9:纯化的SelXm重组蛋白兔抗血清Western blot检测条带，10:猪肝脏SelX兔抗血清Western blot检测条带。5、6、9、10为Western blot结果，其余为SDS-PAGE结果。 M: protein molecular weight marker, lane 1: pET30-SelXm/BL21 induced with IPTG, lane 2: pET30/BL21 induced with IPTG, lanes 3 and 4: purified fusion protein SelXm, lanes 5 and 6: rabbit anti-sera of purified SelXm. lane 7: purified fusion protein SelXm, lane 8: total protein extract from porcine liver tissue, lane 9: rabbit anti-sera of purified SelXm; lane 10: rabbit anti-sera of SelX in porcine liver tissue. Lanes 5, 6, 9 and 10 were results of Western blot, and the other lanes were the results of SDS-PAGE. 图1 猪SelX的基因克隆及其蛋白氨基酸序列和基因序列分析 Fig. 3 SDS-PAGE analysis of expressed fusion protein SelX and Western blot assay for the purified protein

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 间接ELISA检测猪SelXm多克隆抗体效价 Table 1 The polyclonal antibody titer of porcine SelXm determined by indirected ELISA 项目Items 组别 1 000 2 500 5 000 10 000 20 000 40 000 抗体血清OD450 nm OD450 nm of anti-sera 2.361 2.162 1.797 1.497 0.787 0.209 对照血清OD450 nm OD450 nm of control sera 0.447 0.284 0.264 0.203 0.124 0.107

表1 间接ELISA检测猪SelXm多克隆抗体效价 Table 1 The polyclonal antibody titer of porcine SelXm determined by indirected ELISA

未知序列基因克隆方法有很多种，可以根据不同物种之间基因序列同源性比较，设计引物，PCR扩增获得部分基因片段信息，在此基础上采用采用5′-RACE和3′-RACE等方法，获得基因的完整序列信息^[8]。随着猪ESTs数据库等生物信息数据库的急剧丰富，通过查询目标基因ESTs信息，在此基础上采用5′-RACE和3′-RACE等方法克隆获得基因片段，成为克隆新基因的强有力手段^[9]。本试验采用传统ESTs生物信息学分析结合3′-RACE等技术手段成功分离克隆出包含完整ORF和3′-侧翼序列的SelX基因序列片段，并将基因序列提交NCBI GenBank数据库(GenBank登录号：EF113597)，分析SelX基因ORF片段在猪和人之间的序列同源性发现，CDS编码区与人SelX基因CDS区有88%序列同源性(图1-B)，编码的蛋白序列与人SelX具有91%序列同源性。SECISearch 2.18在线生物信息学软件分析发现，克隆的SelX基因3′-UTR具有典型的硒蛋白特有的3′-UTR SECIS发夹结构(图1-C)。信号肽分析显示猪SelX没有信号肽切割位点，预示着SelX为孢内蛋白，可能定位于细胞质。

高等哺乳动物中体内要识别硒蛋白基因ORF中TGA为Sec密码子，除了需要SECIS外，还需要一套复杂的识别机制，需要SECIS识别蛋白(SPS 2)、转运Sec的tRNA(Sec-tRNA^Sec)等因子参与^[10]。原核细胞缺乏相应的识别机制，因此高等哺乳动物来源的硒蛋白不能直接在原核系统中表达，由于Sec和半胱氨酸(Cys)性质很相似，因此通过定点突变将Sec密码子突变成Cys密码子，可以在原核表达系统中表达硒蛋白类似物,表达的突变体蛋白由于相应Cys位点不含硒，因而不具有硒蛋白生物学活性，但由于二者蛋白质氨基酸序列基本一致，因而具有相应的免疫原性，可通过硒蛋白类似物来制备其对应硒蛋白抗体。周继昌等^[11]对猪硒蛋白Sep15基因进行定点突变后，成功表达了Sep15突变蛋白，免疫兔子后成功制备了猪Sep15抗血清。本试验采用快速PCR定点突变方法成功地对SelX基因进行了单碱基定点突变(图2-A)。通过在待突变位点设计突变引物(2引物5′端相邻)直接以双链DNA为模板，以突变引物进行高保真PCR扩增，得到含平末端的PCR产物，末端进行磷酸化处理后，在DNA连接酶的作用下得到含目的片段的环状双链DNA，转化相应的宿主菌后即可快速筛选出含突变基因的转化子^{[12, 13]}。SelX基因突变后，成功构建大肠杆菌表达载体，pET30-SelXm/BL21转化子细胞在0.5 mmol/L IPTG诱导培养2 h成功表达了SelXm(图3)。本试验采用pET30表达载体对猪SelX基因突变体蛋白进行融合表达，表达载体N-端含有1个6个组氨酸串联的His-tag，便于目的蛋白分离纯化，经过His-tag介质亲和层析，得到了纯化的目的蛋白，分子质量约为18.0 ku(图3-A)。

SelX属于蛋氨酸亚砜还原酶家族一员，该类蛋白质负责将氧化状态的蛋氨酸亚砜(MetSO)还原成蛋氨酸残基，从而在生物体内发挥着重要生物学功能。蛋氨酸亚砜还原酶家族包含MsrA和MsrB，目前在人体内已经鉴定出4种MsrB，SelX属于MsrB^[14]，但目前其生物学功能尚不清楚。我们在以猪为模型的研究中发现SelX基因表达量在肝脏、肾脏、肌肉、垂体、甲状腺和下丘脑等组织中不受饲粮硒水平(缺硒和高营养剂量硒)影响^[15]，这可能预示这SelX在这些组织中具有重要功能，机体在硒营养状态发生改变时优先保障其稳定表达从而保证其重要功能发挥。但对于SelX蛋白表达是否受缺硒或过量硒水平影响尚不清楚，本试验用纯化SelXm免疫家兔制备抗猪SelX的多克隆抗体，经间接ELISA检测表明，制备的抗血清效价高达1 ∶ 20 000以上(表1)；利用Wersten-blot方法检测表明，所获得的多克隆抗体能与纯化的SelXm融合蛋白特异性结合，同时也能识别猪肝脏中的SelX。因此本试验制备的多克隆抗体也可望用于检测SelX蛋白表达，为今后以猪为模型从从蛋白水平探讨SelX功能奠定了基础。

本试验成功克隆了猪SelX基因并对其序列进行比对分析(基因序列提交NCBI GenBank 数据库，序列号为：EF113597)；对其编码密码子TGA经定点突变为半胱氨酸(Cys)的TGT后，成功实现了SelX基因突变体蛋白在大肠杆菌中表达；表达的蛋白经纯化后，免疫家兔，获得了效价高达1 ∶ 20 000的多克隆抗体；Western-blot显示制备的抗血清能特异性识别纯化的SelXm和猪肝脏组织中的SelX，可用于猪组织SelX的Western-blot分析。