轮状病毒(rotavirus，RV)是仔猪病原性腹泻的主要致病因子之一。流行病学上的研究发现，仔猪对RV极为易感，RV感染初生仔猪死亡率可达100%。已有的研究表明，RV感染可引起幼龄动物抗氧化能力降低，尤其可引起肠道细胞抗氧化物质的活性降低，促进了脂质过氧化反应，继而产生损伤，而这一过程可能是RV导致仔猪腹泻的发病机制之一^{[1, 2, 3]}。

而近年的研究也发现，鼠李糖乳酸杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG，LGG)具有较强的抗氧化能力^{[4, 5, 6]}，并对多种应激源诱导的氧化损伤有显著缓解作用^[7]。Sun等^[8]研究也发现饲喂LGG可以清除小鼠应激产生的活性氧(ROS)，抑制产生ROS的微生物，增强机体抗氧化能力。崔志文等^[9]报道，鼠李糖乳酸杆菌可以提高Caco-2细胞的抗氧化能力。结合前人研究结果推测，饲粮中LGG补充可能会在一定程度上缓解RV诱导的仔猪抗氧化能力降低，但相关研究尚未见报道。因此，本试验的目的在于考察饲粮中添加LGG对RV感染仔猪生产性能和抗氧化能力的影响。

LGG菌粉：10¹⁰ CFU/g，脱脂乳包被(中国农业大学农业部饲料工业中心提供)。

RV：OSU毒株(G5P9)株(ATCC#VR-893)，购自国家兽医微生物菌种保藏管理中心。

本试验选取24头健康的21日龄的“杜×长×大”去势公猪，平均体重为(6.69±0.32) kg。试验采用2×2两因素设计，饲粮中分别添加0和10⁹ CFU/kg的LGG，用RV进行感染处理。试验第1天空腹称重，根据体重相近原则随机分为2个处理，每个处理12个重复，每个重复1头猪，全部猪只单笼饲养，2个处理分别饲喂添加或未添加LGG的饲粮。试验第15天，空腹称重，根据体重相近、健康状况相当的原则，每个处理随机选取6头仔猪口服RV 3 mL，剩余仔猪口服无菌MEM培养基3 mL。感染后，试验为4个处理，每个处理6个重复，每个重复1头猪。试验期为19 d。

试验基础饲粮为玉米-豆粕型，参照NRC(2012)7~11 kg阶段猪营养需要配制。试验饲粮分别于基础饲粮中添加0和10⁹ CFU/kg的鼠李糖乳酸杆菌构成，添加的鼠李糖乳酸杆菌等量替代基础饲粮中的玉米。基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲粮组成及营养水平 (风干基础) Table 1 Composition and nutrition levels of the basal diet (air-dry basis) % 项目 Items 含量 Content 原料 Ingredients 玉米 Corn 29.585 膨化玉米 Extruded corn 29.585 鱼粉 Fish meal 5.000 乳清粉 Whey powder 3.000 豆粕 Soybean meal 11.000 大豆浓缩蛋白 Soybean protein concentrate 5.500 膨化大豆 Extruded soybean 12.000 大豆油 Soybean oil 2.000 L-赖氨酸盐酸盐 L-Lys·HCl 0.220 L-苏氨酸 L-Thr 0.060 DL-蛋氨酸 DL-Met 0.120 胆碱 Choline 0.150 食盐 NaCl 0.300 碳酸钙 CaCO3 0.400 磷酸氢钙 CaHPO4 0.750 维生素预混料 Vitamin premix1) 0.030 矿物质预混料 Mineral premix2) 0.300 合计 Total 100.000 营养水平 Nutrient levels3) 消化能 DE/(MJ/kg) 14.85 粗蛋白质 CP 20.93 钙 Ca 0.80 总磷 TP 0.63 有效磷 AP 0.44 赖氨酸 Lys 1.33 蛋氨酸 Met 0.44 蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys 0.71 苏氨酸 Thr 0.74 色氨酸 Trp 0.21 1)维生素预混料为每千克饲粮提供Vitamin premix provides per kg of the diet：VA 9 000 IU，VD3 3 000 IU，VE 20.0 IU，VK3 3.0 mg，VB1 1.5 mg，VB2 4.0 mg，VB6 3.0 mg，VB12 0.2 mg，烟酸 niacin 30.0 mg，泛酸 pantothennic acid 15.0 mg，叶酸 folic acid 0.75 mg，生物素 biotin 0.1 mg。 2)矿物质预混料为每千克饲粮提供Mineral premix provides per kg of the diet：Fe 96.0 mg，Cu 84.0 mg，Zn 93 mg，Mn 4.0 mg，I 0.14 mg，Se 0.30 mg。 3)营养水平为计算值。Nutrient levels are calculated values.

表1 基础饲粮组成及营养水平 (风干基础) Table 1 Composition and nutrition levels of the basal diet (air-dry basis)

试验在四川农业大学动物营养研究所教学试验基地进行。猪的饲养采用分4个时间点定时饲喂(分别是08:00、12:00、16:00、20:00)，饲喂量确保料槽内略有剩余，自由饮水，圈舍温度控制在27~30 ℃，湿度不高于80%，各组饲养管理条件一致。

研究发现，恒河猴肾细胞(MA104)对RV高度易感，最适宜用于其体外培养^{[10, 11, 12]}。因而，本试验选用MA104细胞进行RV的培养和强化，使用病毒为RV OSU毒株。MA104细胞使用MEM培养基添加10%胎牛血清进行培养，待细胞长到70%~80%时接种病毒，37 ℃感染2 h，随后补足MEM无血清培养基，继续培养3~5 d，收毒。RV在细胞上多次传代可以提高病毒毒力，收集的病毒重复上述步骤数次，当接种病毒后72 h，70%以上细胞出现明显细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)，收集病毒，测定毒力，-80 ℃保存备用。

试验第15天称重，按体重相近及猪只健康状况为原则进行组内分组，分别对2个感染处理口服感染1.4×10⁷ TCID₅₀/mL RV 3 mL，2个未感染处理灌服3 mL无菌MEM培养基。

以重复为单位，于试验第1、15和20天对猪进行空腹称重，记录每日的采食量，计算各阶段及全期平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

每日记录感染后仔猪腹泻程度和头数，统计腹泻情况并计算腹泻指数。粪便评分标准见表2。参照Yuan等^[13]，腹泻指数的计算公式如下：

腹泻指数=SUM腹泻评分/总头数。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 腹泻情况发生评判标准 Table 2 The standard that fecal consistency was scored 腹泻程度 Diarrhea degree 粪便外观 Excrement shape 腹泻评分 Excrement score 正常 Normal 坚硬的条形或粒状 0 轻度 Light 软便、能成形 1 中度 Middle 浆糊状、不成形 2 重度 Severity 液状、粪水分离 3

表2 腹泻情况发生评判标准 Table 2 The standard that fecal consistency was scored

于试验第20天对猪空腹进行前腔静脉采血置于普通离心管，室温下静置30 min，3 000 r/min离心15 min制备血清，-20 ℃保存，用于测定血清中丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平，总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性和总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)。所有试剂均购自于南京建成生物工程研究所，操作均按说明书进行。

试验第20天采血后重新饲喂仔猪，并于2 h后，屠宰全部试验猪，各称取约1 g十二指肠、空肠、回肠肠道组织，按重量体积比1 ∶ 9的比例加入预冷的生理盐水，置冰上匀浆后，匀浆液于冷冻离心机中按不同指标要求转速离心10 min，取上清液，保存于-80 ℃，用于测定十二指肠、空肠、回肠组织中MDA水平，T-SOD、GSH-Px活性和T-AOC。所有试剂均购自于南京建成生物工程研究所，操作均按说明书进行。

试验数据采用Microsoft Excel 2007进行初步整理，采用SAS 8.0软件中两因子方差分析，模型主效应包括RV感染和鼠李糖乳酸杆菌以及二者之间的互作，差异显著后进行Duncan氏多重比较，各指标以每个重复为单位统计。以P<0.05为差异显著判断标准。所有数据均以“平均值±标准误”表示。

饲粮中添加LGG对RV感染及未感染仔猪生产性能的影响如表3所示。从表中可以看出，试验第1~14天，添加LGG可显著降低F/G(P<0.05)，对ADFI和ADG无显著影响(P>0.05)。感染后(第15~19天)，添加LGG可显著降低F/G(P<0.05)，对ADFI和ADG无显著影响(P>0.05)；但RV感染显著提高了F/G(P<0.05)，对ADFI和ADG无显著影响(P>0.05)。LGG的添加和RV感染对断奶仔猪生产性能无显著交互作用(P>0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 饲粮中添加LGG和/或RV感染对断奶仔猪生产性能的影响 Table 3 Effects of dietary LGG supplementation and/or RV challenge on the performance in weaned piglets 项目 Items RV- RV+ P值 P-value CON LGG CON LGG LGG RV LGG×RV 第1~14天 From day 1 to day 14 (n=12) 平均日采食量 ADFI/kg 0.28±0.02 0.27±0.02 0.61 平均日增重 ADG/kg 0.20±0.02 0.21±0.01 0.57 料重比 F/G 1.50±0.09A 1.29±0.03B <0.05 第15~19天 From day 15 to day 19 (n=6) 平均日采食量 ADFI/kg 0.55±0.04 0.54±0.05 0.61±0.04 0.54±0.05 0.39 0.55 0.45 平均日增重 ADG/kg 0.43±0.02 0.47±0.04 0.40±0.04 0.42±0.05 0.50 0.33 0.84 料重比 F/G 1.27±0.05B 1.17±0.04B 1.60±0.11A 1.32±0.09B <0.05 <0.05 0.29 RV-：轮状病毒未感染；RV+：轮状病毒感染；CON：对照组；LGG：鼠李糖乳酸杆菌组。同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。 RV-：not challenge with RV；RV+：challenge with RV；CON：control group；LGG：LGG group. In the same row,values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表3 饲粮中添加LGG和/或RV感染对断奶仔猪生产性能的影响 Table 3 Effects of dietary LGG supplementation and/or RV challenge on the performance in weaned piglets

饲粮中添加LGG对RV感染及未感染仔猪腹泻的影响如表4所示。从表中可以看出，RV感染显著提高了仔猪的腹泻指数(P<0.05)。添加LGG显著降低了仔猪的腹泻指数(P<0.05)；且LGG的添加可以显著降低RV感染引起的腹泻指数增加(P<0.05)，二者存在显著的交互作用(P<0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 饲粮中添加LGG和/或RV感染对断奶仔猪腹泻的影响 Table 4 Effect of dietary LGG supplementation and/or RV challenge on the diarrhea in weaned piglets 项目 Items RV- RV+ P值 P-value CON LGG CON LGG LGG RV LGG×RV 腹泻指数 Diatthea index 0.50±0.29C 1.25±0.75BC 7.20±0.97A 3.50±0.65B <0.05 <0.05 <0.05

表4 饲粮中添加LGG和/或RV感染对断奶仔猪腹泻的影响 Table 4 Effect of dietary LGG supplementation and/or RV challenge on the diarrhea in weaned piglets

饲粮中添加LGG对RV感染及未感染仔猪抗氧化能力的影响如表5所示。从表中我们可以看出，RV感染显著提高了十二指肠、空肠、回肠和血清中MDA水平(P<0.05)，显著影响了十二指肠、空肠、回肠和血清中GSH-Px的活性以及空肠中T-SOD活性(P<0.05)，以及空肠和血清中T-AOC(P<0.05)，十二指肠T-AOC有降低趋势(P<0.10)。添加LGG显著降低了空肠中MDA水平(P<0.05)，显著提高了空肠中T-SOD和血清中GSH-Px活性(P<0.05)，显著提高了空肠和血清中T-AOC(P<0.05)。LGG的添加显著降低了RV感染引起的仔猪空肠中MDA水平的升高(P<0.05)，显著提高了RV感染引起的仔猪空肠和血清中T-AOC的下降(P<0.05)，添加LGG与RV感染，二者表现出显著的交互作用(P<0.05)。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 饲粮中添加LGG和/或RV感染对断奶仔猪十二指肠、空肠、回肠和血清抗氧化能力的影响 Table 5 Effects of dietary LGG supplementation and/or RV challenge on the antioxidant capacity in the duodenum,jejunum,ileum and serum in weaned piglets 项目 Items RV- RV+ P值 P-value CON LGG CON LGG LGG RV LGG×RV 十二指肠 Duodenum 总超氧化物歧化酶 T-SOD/(U/mg prot) 65.22±5.41 60.57±2.51 66.44±3.18 58.73±4.35 0.17 0.94 0.73 谷胱甘肽过氧化物酶 GSH-Px/(U/mg prot) 145.59±30.31A 161.33±23.14A 75.37±6.57B 106.72±4.02AB 0.26 <0.05 0.71 丙二醛 MDA/(nmol/mg prot) 0.71±0.02B 0.73±0.06B 1.34±0.08A 1.24±0.15A 0.70 <0.05 0.50 总抗氧化能力 T-AOC/(U/mg prot) 0.46±0.08A 0.53±0.06 0.32±0.03B 0.43±0.05AB 0.13 0.05 0.80 空肠 Jejunum 总超氧化物歧化酶 T-SOD/(U/mg prot) 45.34±0.91B 70.65±3.55A 35.82±0.60C 40.08±0.61C <0.05 <0.05 <0.05 谷胱甘肽过氧化物酶 GSH-Px/(U/mg prot) 158.85±16.06AB 179.34±12.11A 124.07±11.62B 122.98±6.25B 0.43 <0.05 0.38 丙二醛 MDA/(nmol/mg prot) 0.50±0.05C 0.51±0.05C 1.01±0.04A 0.69±0.07B <0.05 <0.05 <0.05 总抗氧化能力 T-AOC/(U/mg prot) 0.45±0.06A 0.47±0.04A 0.23±0.03B 0.41±0.03A <0.05 <0.05 0.08 回肠 Ileum 总超氧化物歧化酶 T-SOD/(U/mg prot) 52.05±4.62 55.25±6.45 43.98±0.77 49.55±3.62 0.30 0.12 0.78 谷胱甘肽过氧化物酶 GSH-Px/(U/mg prot) 123.91±8.27A 122.35±6.37A 91.31±3.71AB 103.88±8.82B 0.45 <0.05 0.33 丙二醛 MDA/(nmol/mg prot) 0.89±0.08B 1.04±0.12B 1.50±0.02A 1.52±0.12A 0.41 <0.05 0.54 总抗氧化能力 T-AOC(U/mg prot) 0.28±0.06 0.25±0.09 0.20±0.01 0.27±0.06 0.75 0.69 0.43 血清 Serum 总超氧化物歧化酶 T-SOD/(U/mL) 115.06±11.33 107.91±16.78 105.57±15.76 95.90±10.68 0.56 0.45 0.93 谷胱甘肽过氧化物酶 GSH-Px/(U/mL) 144.01±6.83B 191.25±9.18A 117.71±4.33BC 132.34±5.74C <0.05 <0.05 <0.05 丙二醛 MDA/(nmol/mL) 1.90±0.21C 2.81±0.20B 3.59±0.37A 3.33±0.18A 0.19 <0.05 <0.05 总抗氧化能力 T-AOC/(U/mL) 1.19±0.08A 1.25±0.15A 0.46±0.05C 0.84±0.06B <0.05 <0.05 0.09

表5 饲粮中添加LGG和/或RV感染对断奶仔猪十二指肠、空肠、回肠和血清抗氧化能力的影响 Table 5 Effects of dietary LGG supplementation and/or RV challenge on the antioxidant capacity in the duodenum,jejunum,ileum and serum in weaned piglets

腹泻对断奶仔猪生产危害极大，其发生不仅影响仔猪生产，甚至会导致仔猪死亡，严重影响仔猪的生产效益。RV对仔猪极为易感，是造成仔猪病毒性腹泻的主要因素之一，而RV诱导的肠道抗氧化能力降低可能是其导致腹泻的重要机制。本研究采用对仔猪口服灌注RV，构建RV感染模型，模拟生产实际中RV感染诱导仔猪腹泻的发生。结果表明，RV感染仔猪腹泻指数显著高于对照组，且显著提高了仔猪的F/G，但未显著影响ADFI和ADG，即RV感染降低了仔猪对营养物质的利用效率；RV感染也降低了仔猪肠道和血清的抗氧化能力，诱导了机体和肠道的氧化应激，这与前人的研究结果一致^{[3, 14]}。综上结果表明，本试验成功构建了RV感染模型。

近年相关的研究表明，饲粮补充LGG可提高动物的生产性能，减少腹泻的发生。王海东等^[15]在断奶仔猪上的研究发现，与对照组相比，饲粮中添加0.2%鼠李糖乳酸杆菌菌粉极显著提高了仔猪日增重，显著改善了饲料转化率，同时降低了断奶期仔猪腹泻率。在断乳小鼠饲粮中分别添加10²、10⁴、10⁶、10⁸ CFU/(只·d)鼠李糖乳酸杆菌MA27/B，与对照组相比，各添加组采食量、饮水量及日增重都显著提高，且作用效果具有剂量依赖效应^[16]。Surawicz^[17]研究发现，LGG可以显著降低抗生素相关性腹泻的发生。Basu等^[18]在患急性水样腹泻儿童上的研究发现，使用高剂量LGG可以显著降低患病儿腹泻持续的时间及频率。以上研究结果与本试验基本一致。另外，本试验也发现，饲粮中LGG补充可在一定程度上缓解RV感染诱导的腹泻产生，这可能与LGG可提高仔猪抗氧化能力有关。

诸多研究报道，LGG有很强的抗氧化能力。胡晓丽^[19]在DSS诱导小鼠结肠炎的研究中发现，饲喂LGG可以显著降低结肠髓过氧化物酶(MPO)活性、ROS和MDA水平，提高结肠组织T-AOC和多种抗氧化酶活性。李垚清等^[20]探讨了多种乳酸菌对MDA的抑制作用，发现LGG可以明显抑制MDA生成。王玉华等^[21]在鼠李糖乳酸杆菌B10对酒精诱导肝氧化损伤的小鼠上的研究表明，鼠李糖乳酸杆菌B10显著降低了小鼠肝脏脂肪变性和氧化损伤程度，缓解了小鼠酒精性肝损伤。本研究结果表明，与对照组相比，饲粮添加LGG可以显著提高仔猪血清和空肠的T-AOC。而本研究也表明饲粮LGG添加可在一定程度上缓解RV感染诱导的仔猪血液和肠道抗氧化能力下降，可以推测LGG缓解RV诱导的仔猪腹泻与其缓解氧化应激产生的肠道损伤有关。另外，本研究的结果还发现，虽然饲粮补充LGG缓解RV诱导的T-AOC降低和MDA水平升高，但未缓解RV对T-SOD和GSH-Px活性的影响，因此，可以进一步推测LGG缓解RV诱导的仔猪肠道抗氧化能力下降可能主要是通过非酶抗氧化系统的作用来实现的。

饲粮LGG的添加可以显著降低仔猪的料重比，并可缓解RV感染诱导的断奶仔猪腹泻，这可能源于饲粮LGG添加提高了仔猪机体(尤其是肠道)抗氧化能力，抑制脂质过氧化物，维持机体正常氧化还原平衡，继而增强仔猪的抗病力。