2. 青岛农业大学优质水禽研究所, 青岛 266109
2. Institute of High Quality Waterfowl, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China
果胶酶是一个复合酶系，可分解位于植物细胞壁及胞间质层的果胶，促使植物组织崩解，使营养成分得到充分释放和利用[1]。在玉米-豆粕型饲粮中添加果胶酶和纤维素酶能有效消除所含果胶等非淀粉多糖(NSP)的抗营养作用[2]，提高动物生产性能。已有研究表明，饲粮中添加纤维素酶和果胶酶能够提高粗饲料的转化率，改善动物的生产性能[3, 4]。吕东海[5]研究表明，在肉鸭饲粮中添加纤维素酶能够显著提高肉鸭日增重以及对干物质(DM)和粗纤维(CF)的消化率。王宝维等[6]研究表明，在肉鸡饲粮中添加果胶酶可以显著提高CF、中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)的利用率，增加肠道有益微生物数量，降低有害微生物数量，改善肠道酶活性，果胶酶与纤维素酶协同添加作用更明显。目前国内外关于果胶酶的研究主要集中在肉鸡和肉鸭方面，在鹅方面的应用相对较少，而关于果胶酶和纤维素酶对鹅排泄物指标的研究以及果胶酶和纤维素酶的配合使用尚未见报道。鉴于此，本试验从养分表观利用率、消化酶活性和盲肠微生物区系以及排泄物指标等角度研究在高纤维基础饲粮中添加不同水平果胶酶和纤维素酶对五龙鹅养分利用率和肠道微生态的影响，为果胶酶和纤维素酶的科学添加提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料果胶酶(5 000 U/g)和纤维素酶(20 000 U/g)购自山东潍坊苏柯汉生物科技有限公司。
1.2 试验设计与饲粮配方选216只1日龄健康五龙鹅随机分成6组，每组3个重复，每个重复12只。Ⅰ组为对照组，饲喂高纤维基础饲粮，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组在基础饲粮中分别添加5 000、10 000、15 000 U/kg的果胶酶，Ⅴ组添加5 000 U/kg的果胶酶和40 000 U/kg的纤维素酶，Ⅵ组添加10 000 U/kg的果胶酶和40 000 U/kg的纤维素酶(纤维素酶按厂家最佳效果推荐量添加)。基础饲粮参照NRC(1994)鹅饲养标准和《中国饲料营养成分表》配制，以玉米、豆粕为主要原料，玉米秸秆为纤维源，分1~4周龄和5~16周龄2个阶段，基础饲粮组成及营养水平见表1。
 | 表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) |
试验鹅自由采食和饮水，全期舍饲，喂自配混合料。育雏期随时调节育雏温度，育雏前3周温度分别为28~30 ℃、26~27 ℃、24~25 ℃，3周龄以后逐渐降到常温。光照：第1~2周，23 h；第3周，18 h；第4~12周采用自然光照。平均相对湿度65%。按常规程序进行疫苗的免疫接种，每天记录喂料量、死淘数等相关数据，并密切注意观察鹅的生长状况。
1.4 测定指标及方法 1.4.1 养分表观利用率饲养试验结束后，每重复按平均体重分别选取2只健康试验鹅，饲养于代谢笼中，公母各占1/2，共36只，均单笼饲养。代谢试验开始前禁食24 h，然后每天每只饲喂200 g饲粮，自由饮水。试验分为2个阶段：预试期4 d，正试期3 d。正试期采用全收粪法分个体连续收集3 d的排泄物，用镊子取出粪中混有的皮屑和羽毛，并用10%的盐酸固氮，混匀，在65~75 ℃烘箱中烘干，自然状态下回潮24 h，粉碎、制样待测。
DM含量采用烘箱干燥法(GB 5435—86)方法测定；能量测定采用氧弹式测热法；粗蛋白质(CP)含量采用凯氏定氮法(GB/T 6432—1994)测定；粗脂肪(EE)含量采用乙醚抽提法(GB/T 6433—2006)测定；CF含量采用酸碱消煮法(GB/T 6434—1994)测定；钙(Ca)含量采用高锰酸钾滴定法(GB/T 6436—2002)测定；磷(P)含量采用钼黄比色法(GB/T 6437—2002)测定；NDF、ADF含量采用Van Soest洗涤纤维分析法(GB/T 6434—2006)测定。计算DM、粗灰分含量，有机物含量根据公式推算：
有机物含量=DM含量-粗灰分含量。
饲粮养分表观利用率按下列公式计算：
养分表观利用率(%)=[(饲粮中某养分的含量-
粪尿排泄物中某养分的含量)/
饲粮中某养分的含量]×100。
无菌称取0.5 g盲肠内容物于9.5 mL灭菌生理盐水的容器内(10倍稀释)，振荡3 min，取此稀释液0.5 mL于盛有4.5 mL灭菌生理盐水的容器内，依次进行10-2~10-7倍比稀释，取3个适当稀释度，每个稀释度做2个重复。分别将盲肠内容物的稀释液接种于相应的培养基平皿上，采用倾注平板法进行培养，每种指标检测3个稀释梯度，取适当稀释度每个梯度设2个重复。大肠杆菌(Escherichia coli)采用麦康凯培养基，37 ℃有氧培养24 h后进行菌落计数；乳酸杆菌(Lactobacillus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)和产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)分别采用MRS培养基、TPY琼脂培养基和TSC琼脂培养基，35 ℃厌氧培养48 h后进行菌落计数。
计算公式如下：
每克盲肠内容物菌落数=lg(菌落数×稀释倍数×
每次稀释取样体积)/(接种用样品体积×
样品质量)。
4、16周龄时，从每个重复中抽取2只试验鹅，共36只，将试验鹅快速致死，迅速剖开腹腔，分离十二指肠和胰腺，用液氮速冻后转至-20 ℃的冰箱保存备用。
胰腺上清液的制备：将待用胰腺解冻后，从头、体、尾3个部位采集胰腺样品，用4 ℃的去离子水按其重量10倍体积稀释，于低温状态下用玻璃匀浆器匀浆，匀浆液在4 ℃下离心20 min(3 000 r/min)，上清液分装标号，于-20 ℃冰箱中保存待用。
十二指肠上清液的制备：将解冻后的待用十二指肠前沿肠管纵向剪开，采集食糜和肠黏膜，用4 ℃的去离子水按其重量10倍体积稀释，于低温状态下用玻璃匀浆器匀浆。匀浆液在4 ℃下离心15 min(3 000 r/min)，上清液分装标号，于-20 ℃冰箱中保存待用。
分别测定胰腺和十二指肠的胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，试剂盒购自南京建成生物工程研究所，方法参见说明书。
1.4.4 鹅粪中大肠杆菌数量和总氮、总磷含量测定代谢试验过程中，分别无菌称取新鲜鹅粪0.5 g于10 mL无菌离心管中，加入9.5 mL灭菌生理盐水，用漩涡混匀仪振荡混匀，静置后，取100 μL上清液于盛有900 μL灭菌生理盐水的无菌离心管中，并依次进行10倍稀释，取10-3、10-4、10-5等梯度稀释液10 μL。使用麦康凯培养基在37 ℃有氧条件下培养24 h后，用平板菌落计数法计数，以每克新鲜粪中细菌个数的对数[lg(CFU/g)]表示。
分别称取代谢试验鹅新鲜粪便5 g溶于50 mL水中，用漩涡混匀仪将稀释液混匀，静置后，分别取1 mL上清液定容至100 mL，制成待测液。分别取试样分解液3 mL，用碱性过硫酸钾消解-离子色谱法测定鹅粪中总氮含量。再分别取试样分解液25 mL，经硝酸高氯酸消解后用钼蓝法比色测定鹅粪中总磷含量。
1.5 统计分析采用SPSS 19.0软件中单因素方差分析(one-way ANOVA)中的LSD法进行多重比较。试验数据以“平均值±标准差”表示。P<0.05和P<0.01分别为差异显著和极显著水平。
2 结 果 2.1 果胶酶对五龙鹅养分利用率的影响由表2可见，Ⅴ和Ⅵ组与Ⅰ组相比，均能显著提高DM、CP、CF、NDF、ADF、能量的表观利用率(P<0.05)，Ⅲ和Ⅳ组与Ⅰ组相比，有提高的趋势，但差异不显著(P>0.05)；Ⅴ和Ⅵ组Ca表观利用率极显著高于Ⅰ组(P<0.01),Ⅲ和Ⅳ组显著高于Ⅰ组(P<0.05)；OM、EE、P表观利用率各组间差异均不显著(P>0.05)。
| 表2 果胶酶和纤维素酶对五龙鹅养分表观利用率的影响
Table 2 Effects of pectinase and cellulose on nutrient apparent utilization of Wulong geese
|
由表3可见，4周龄时，胰蛋白酶和脂肪酶活性在各组之间差异不显著(P>0.05)，Ⅴ和Ⅵ组淀粉酶活性显著高于Ⅰ组(P<0.05)，与Ⅰ组相比，Ⅲ组有提高的趋势，但差异不显著(P>0.05)。
| 表3 果胶酶和纤维素酶对五龙鹅胰腺消化酶活性的影响
Table 3 Effects of pectinase and cellulose on pancreatic digestive enzyme activities of Wulong geese
|
16周龄时，胰蛋白酶活性各组之间差异均不显著(P>0.05)；Ⅴ和Ⅵ组淀粉酶和脂肪酶活性显著高于Ⅰ组(P<0.05)，与Ⅰ组相比，Ⅲ和Ⅳ组有提高的趋势，但差异不显著(P>0.05)。
2.2.2 果胶酶和纤维素酶对五龙鹅十二指肠消化酶活性的影响由表4可见，4周龄时，各组之间胰蛋白酶活性差异不显著(P＞0.05)，与Ⅰ组相比，Ⅴ和Ⅵ组淀粉酶和脂肪酶活性显著提高(P<0.05)，Ⅲ和Ⅳ组有提高的趋势但差异不显著(P>0.05)。
| 表4 果胶酶和纤维素酶对五龙鹅十二指肠消化酶活性的影响
Table 4 Effect of pectinase and cellulose on duodenum digestive enzyme activities of Wulong geese
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16周龄时，Ⅴ和Ⅵ组的胰蛋白酶和脂肪酶活性显著高于Ⅰ组(P<0.05)，Ⅲ和Ⅳ组相对于Ⅰ组差异均不显著(P>0.05)；Ⅴ和Ⅵ组淀粉酶活性极显著高于Ⅰ组(P<0.01)，Ⅲ和Ⅳ组显著高于Ⅰ组(P<0.05)。
2.3 果胶酶和纤维素酶对五龙鹅盲肠微生物区系的 影响由表5可见，4周龄时，各组之间大肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌和产气荚膜梭菌的数量差异均不显著(P>0.05)。
16周龄时，各组之间大肠杆菌数差异不显著(P>0.05)；Ⅴ和Ⅵ组与Ⅰ组相比，均能提高乳酸杆菌和双歧杆菌的数量，差异显著(P<0.05)，Ⅲ和Ⅳ组与Ⅰ组相比，差异均不显著(P>0.05)；Ⅴ和Ⅵ组与Ⅰ组相比，能降低产气荚膜梭菌的数量，差异显著(P<0.05)，Ⅲ和Ⅳ组与Ⅰ组相比，差异不显著(P>0.05)。
| 表5 果胶酶和纤维素酶对五龙鹅盲肠微生物区系的影响
Table 5 Effects of pectinase and cellulose on cecal microflora of Wulong geese
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由表6可见，添加果胶酶对鹅粪中大肠菌数量无显著影响(P>0.05)，与添加量无线性相关，Ⅴ、Ⅵ组与Ⅰ组相比有降低的趋势，但差异不显著 (P>0.05)；添加果胶酶和纤维素酶对鹅粪中总氮的含量有降低的趋势，但影响不显著(P>0.05)；对鹅粪中总磷的含量有降低的趋势，但影响不显著(P>0.05)。
| 表6 果胶酶和纤维素酶对五龙鹅粪中大肠杆菌数量和总氮、总磷含量的影响 Table 6 Effects of pectinase and cellulose on the number of Escherichia coli and the contents of total nitrogen and total phosphorus in fecal of Wulong geese |
饲用果胶酶和纤维素酶能提高饲料的养分利用率和饲粮中粗饲料的添加比例。张礼星等[7]研究表明，饲粮添加0.1%的果胶酶可显著提高肉仔鸡DM、CP、OM和CF的消化率。Saleh等[8]在肉鸡玉米-豆粕饲粮中添加纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶组成的复合酶，OM和CP消化率显著高于对照组高。Tahir等[9]研究表明，果胶酶和纤维素酶配合使用对CP、DM的影响不显著，单独添加果胶酶对CP、DM表观消化率影响也不显著。Olkowski[10]研究表明，羽扇豆饲粮中添加以果胶酶和半纤维素酶为主的复合酶能显著提高雏鸡OM和CP的消化率。王宝维等[6]研究表明，在肉鸡饲粮中添加果胶酶可以显著提高CF、NDF和ADF的利用率，与纤维素酶同时添加协同作用明显。赵必迁等[11]研究表明，饲粮中添加木聚糖酶、纤维素酶、甘露聚糖酶和果胶酶组成的复合酶对DM、CF、EE和能量的表观利用影响均不显著。
本试验结果显示，果胶酶和纤维素酶配合使用能显著提高五龙鹅DM、CP、CF、NDF、ADF和能量的表观利用率，单独添加果胶酶影响不显著，与之前的研究结果基本一致。由于植物细胞壁是由纤维素和果胶质交结形成的多糖和蛋白质及其他成分构成的[12]，果胶酶和纤维素酶配合使用可相互增强分解植物细胞壁的能力，缓解或消除饲料抗营养因子，释放胞内养分,提高养分利用率[13]。本试验研究发现，单独添加果胶酶能显著提高Ca的养分利用率，与王宝维等[6]的研究结果一致；果胶酶和纤维素酶配合使用能极显著提高Ca的养分利用率，这可能与植物细胞壁的组成有关，细胞壁中存在大量果胶酸钙[14]，果胶酶能分解果胶酸钙释放钙离子，提高其养分利用率[15]。
本试验研究结果表明，高纤维基础饲粮中添加10 000 U/kg果胶酶与40 000 U/kg的纤维素酶能显著改善饲料的养分利用率，关于果胶酶和纤维素酶对Ca利用率影响的研究相对较少，还有待于进一步的研究。
3.2 果胶酶和纤维素酶对五龙鹅消化酶活性的影响外源酶与动物内源酶之间的影响机制十分复杂，为很多研究人员所关注。一般认为，果胶酶和纤维素酶作为NSP酶，能补充动物内源酶的不足，刺激内源酶的分泌。Mirzaei等[16]研究表明，蛋鸡小麦饲粮中添加木聚糖酶对消化道内源酶酶活无显著影响。Li等[17]研究表明，饲粮中添加NSP酶对猪消化道酶活无显著影响。何万领等[18]研究表明，在肉鸡饲粮中添加纤维素酶能提高消化道消化酶的活性，能显著提高淀粉酶和脂肪酶的活性。
本试验研究发现，高纤维基础饲粮中添加果胶酶对16周龄鹅十二指肠淀粉酶活性影响显著，添加果胶酶和纤维素酶对1~16周龄肠道酶活性都有一定的提高作用，对淀粉酶的影响尤为显著，这与王宝维等[6]的试验结果存在一定的一致性。Lin等[19]研究表明，高果胶类物质能显著降低鹅消化道酶活，因此，可以认为添加果胶酶能降低果胶类物质的影响，改善肠道酶活性，而与纤维素酶配合使用，效果相对明显。外源酶对内源酶分泌的影响机制尚不清楚。从目前研究结果来看，动物种类、饲粮类型及酶制剂的种类和剂量等因素都可能影响到内源酶的分泌[20]，而有益菌产生和分泌的一些维生素、酶类、短链脂肪酸等也可促进肠道酶的分泌，本试验研究表明，添加果胶酶和纤维素酶能提高肠道有益菌的数量。
目前，有关果胶酶和纤维素酶对鹅消化道生理的影响尚未见报道，其影响机制还有待于进一步研究。
3.3 果胶酶和纤维素酶对五龙鹅盲肠微生物的影响大量研究表明，食糜黏度过大可引起有害微生物大量繁殖，抑制有益微生物生长[21, 22]。添加NSP酶可降低食糜黏度，防止有害微生物的滋生，促进有益微生物的增长[2, 23]。肠道微生物菌群是动物消化系统的一个重要组成部分，鹅能够利用饲粮中的部分CF，主要依靠盲肠微生物的发酵作用[24]。Apajalahti等[25]研究表明，添加木聚糖酶能显著降低饲喂小麦饲粮的肉鸡盲肠微生物菌群数量，而Santos等[26]研究表明，添加NSP酶可提高肉鸡肠道乳酸杆菌的数量。王宝维等[6]研究表明，添加果胶酶能够显著降低肉鸡盲肠中大肠杆菌数量，提高双歧杆菌和乳酸杆菌数量，与纤维素酶配合使用效果更显著。周小娟等[27]研究表明，肉鸡饲粮中添加纤维素酶、果胶酶等多种酶组成的复合酶能显著降低大肠杆菌的数量，提高乳酸杆菌的数量。
本试验结果表明，添加果胶酶和纤维素酶对1~4周龄五龙鹅盲肠微生物影响不显著；5~12周龄，单独添加果胶酶对盲肠微生物影响不显著；果胶酶和纤维素酶配合使用能显著降低盲肠中产气荚膜梭菌数量，显著提高双歧杆菌和乳酸杆菌的数量，对大肠杆菌数量有降低的趋势，但差异不显著，与Santos等[26]、周小娟等[27]、Bindelle等[28]的研究结果一致。崔秀艳等[29]研究表明，雏鹅到46日龄才能完成微生物定植过程，因此，1~4周龄时，鹅盲肠微生物还处于定植过程中，存在某种菌群平衡关系，而受外源酶影响不明显。5~16周龄时，已经完成定植过程，大肠杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌均为盲肠优势菌群[30, 31]，外源酶对其影响相对明显；NSP酶能降解NSP，经微生物发酵，产生挥发性脂肪酸，降低肠道pH。pH的降低可抑制大肠杆菌的生长，促进双歧杆菌、乳酸杆菌的增殖[32]；乳酸杆菌可以产生乳酸菌肽，保护肠道黏膜不被其他病原微生物入侵，降低盲肠中大肠杆菌等有害细菌的定植[33]。
3.4 果胶酶和纤维素酶对五龙鹅粪中大肠菌群及总氮总磷的影响水禽粪尿是水禽养殖过程中对环境影响最大的污染源[34]。粪尿中的含氮物质在空气的作用下形成大量硝酸盐，随水流入江河湖泊中，可以刺激藻类等水生植物的生长，引起土壤和水体的“营养富集”，影响植物生长[35]。张军等[36]的研究表明，饲料中的可溶性非淀粉多糖(SNSP)含量越高，饲料中氨基酸表观消化率越低，并导致内源氮损失以及总氮的排泄量增加。因此，降低NSP的抗营养影响，有利于提高饲料氮、磷的消化利用，减少氮磷排泄，降低对环境的污染。研究发现，在幼鹅饲粮中添加可溶性果胶，与对照组相比显著降低了胰蛋白酶和糜蛋白酶等消化酶的活性[37]，可能会导致氨基酸表观消化率的降低，增加总氮的排泄量。Meng等[38]报道，在肉鸡饲粮中添加复合酶制剂(纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、半乳聚糖酶和甘露聚糖酶)，可显著提高家禽对饲粮中CP的利用，极显著提高家禽对饲粮中磷的利用率，从而减少粪尿中氮、磷等元素的排放，减少粪尿对环境的污染。隋毅[39]研究表明，饲粮中添加含果胶酶、纤维素酶和β-葡聚糖酶等NSP酶组成的复合酶制剂，对肉仔鸡粪便中大肠杆菌数有显著影响，其数量与复合酶的组成有关。
本试验研究表明，在高CF饲粮中添加果胶酶和纤维素酶对对五龙鹅粪尿中大肠杆菌数量有降低的趋势，但影响不显著；对粪尿中总氮、总磷的含量影响不显著，这与之前的研究结果不一致，导致这种原因，可能与动物品种、动物日龄、饲粮中CF含量、酶的组成和酶活性等因素的差异存在一定关系。
4 结 论① 饲粮中添加果胶酶对五龙鹅常规饲料养分利用率影响不显著，果胶酶和纤维素酶配合使用效果显著，10 000 U/kg果胶酶和40 000 U/kg纤维素酶配合可显著提高营养物质消化率。
② 饲粮中添加果胶酶仅能提高五龙鹅16周龄十二指肠淀粉酶活性，果胶酶和纤维素酶配合使用可改善肠道菌群平衡，适宜添加水平为10 000 U/kg果胶酶和40 000 U/kg纤维素酶。
③ 饲粮中添加果胶酶和纤维素酶对五龙鹅排泄物中大肠杆菌数量及总氮、总磷含量无显著影响。
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