2. 山东省功能糖工程研究中心, 禹城 251200;
3. 山东省秸秆生物炼制技术重点实验室, 禹城 251200
, XU Guohui2, XIAO Lin2, CHEN Xiaogang2, XIA Ruirui3, ZAHNG Liyang1, LU Lin1, LUO Xugang1
2. High-Technology Development Zone, Functional Sugar Engineering Research Center of Shandong Province, Yucheng 251200, China;
3. High-Technology Development Zone, Shandong Key Laboratory of Straw and Stover Biorefinement Technologies, Yucheng 251200, China
低聚木糖(xylooligosaccharides,XOS)是一种新型的绿色饲料添加剂，由2～7个木糖分子以糖苷键连接而成，其主要成分为木糖、木二糖、木三糖、木四糖及少量木四糖以上的木聚糖，其中以木二糖、木三糖和木四糖为主要有效成分。XOS具有促进动物肠道健康和增强机体免疫的功能，并且具有较高的生物活性，其添加量为低聚异麦芽糖的1/20，为低聚果糖的1/7~1/10[1]。XOS可高选择性地促使双歧杆菌、乳酸菌等有益菌增殖，提高机体免疫力和抗癌能力，抑制外源性病菌对机体的侵入，防治肠道疾病，降低机体胆固醇水平等[2]。因此，XOS成为国内外竞相研究开发的功能性低聚糖之一。
作为一种新型添加剂，XOS逐渐成为研究热点，并得到了广泛的应用，因而评价其安全性具有重要意义。研究显示，一般剂量的XOS对人和动物机体没有任何明显的毒害或副作用。少数研究发现，高剂量的XOS条件下，动物少数出现肝细胞和肾间质细胞点状坏死，肾小管变性等，但病变程度较轻，且无组间特异性分布[3]。然而，关于XOS对肉鸡的饲用安全性评价还未见报道。根据农业部颁布的《饲料和饲料添加剂畜禽靶动物耐受性评价试验指南(试行)》中有关观察与检测指标的规定，本试验通过观测肉仔鸡生长性能、血液生理和血浆生化指标、器官发育和组织病理学变化以评价玉米-豆粕型饲粮添加高剂量XOS对1～21日龄和22～42日龄肉仔鸡的影响，为确定XOS在肉仔鸡饲粮中最高添加量的安全系数提供科学依据，以确保其在肉鸡生产中的安全应用。
1 材料与方法 1.1 试验设计与处理试验采用单因子完全随机设计。根据前期试验研究得到的肉仔鸡玉米-豆粕型饲粮中XOS的适宜添加水平为52.5～100 mg/kg[4, 5, 6]，将53 mg/kg看作是肉鸡饲粮XOS的最低有效推荐量，以及根据农业部颁布的《饲料和饲料添加剂畜禽靶动物耐受性评价试验指南(试行)》中的有关规定，设置4个组，即不添加XOS的对照组、XOS使用剂量组(为最低有效推荐加量的3倍)、分别为使用剂量组的5和10倍的2个XOS高量添加组，即XOS的添加水平分别为0、160、800 和1 600 mg/kg。
1.2 试验动物与饲粮从北京华都肉鸡公司购买300只健康商品代1日龄爱拔益加(AA)雏鸡，从中选取240只按体重随机分为4个组，每个组60只鸡，分6个重复笼饲养，每个重复笼10只鸡(公母各占1/2)。试验期为42 d，分为2个阶段：1～21日龄和22～42日龄。饲养管理和常规免疫按《AA肉仔鸡饲养管理手册》进行。鸡只自由采食和饮用自来水。试验期每天观察并记录临床症状、发病和死亡鸡只，如有鸡只死亡，解剖观察病理学变化。分别于试验期第21和42天末以重复笼为单元称鸡空腹体重和耗料量，计算耗料量、日增重、饲料转化效率、鸡只发病和死亡率。
参照NRC(1994)[7]家禽营养需要量中肉仔鸡营养建议量配制试验鸡1～21日龄和22～42日龄的玉米-豆粕型基础饲粮(表1)，并按上述分组分别在各阶段基础饲粮中通过调整玉米淀粉的用量而配制4种试验饲粮。XOS试验产品由山东龙力生物科技股份有限公司提供，其中XOS实测含量为36.83%。饲粮以粉料喂给。
 | 表1 基础饲粮组成及营养水平(饲喂基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (as-fed basis) % |
配合试验饲粮时现场采样，粉碎过200目筛后置于封口样品袋中低温干燥保存以备分析钙、磷、粗蛋白质和XOS含量，从而确保与理论设置值接近。分别于试验的21和42日龄试验结束时，所有鸡只禁食而不禁水一夜后，于第2天08:00分别称鸡只空腹个体活重，从每个重复笼中按笼平均体重选取2只鸡(公母各1只)，翅静脉采血10～15 mL。其中，取1份抗凝血测定血液常规生理指标；取第2份抗凝血于3 000 r/min离心20 min，分离血浆并分装，于-20 ℃冻存，以备分析血浆生化指标。各重复笼2只鸡的全血或血浆合为1个分析样品。
于上述第42日龄试验结束采血后，将所有采血鸡只屠宰，摘取胸腺、法氏囊、脾脏、胰脏、心脏、肺脏、肝脏、肾脏、腺胃和肌胃，另取出十二指肠、空肠和回肠挤出其中内容物，分别称重，计算器官指数；测量十二指肠、空肠、回肠长度，计算小肠发育指数；同时观察记录各个脏器的形态变化。
脏器指数(%)=100×器官重量/活体体重；
小肠各段长度指数(%)=100×
小肠各段长度/小肠总长度。
各脏器称重后，每组从其中3个重复笼各取1只公鸡、另3个重复笼各取1只母鸡的部分肝脏、肾脏、心脏、肺和脾脏，放入装有4%福尔马林溶液的棕色瓶中固定，以备制作切片，观测其组织病理学变化。
1.4 样品分析 1.4.1 钙含量用IRIS IntrepidⅡ等离子体发射光谱仪(TE，美国)测定饲料原料和饲粮中的钙含量。
1.4.2 粗蛋白质含量用凯氏定氮法[8]测定饲料原料及饲粮样品中的氮含量。
1.4.3 XOS含量用高效液相色谱法[9]测定XOS产品和基础饲粮中的XOS含量。
1.4.4 全血、血浆指标用KX-21血细胞自动分析仪(SYSMEX,日本)测定全血红细胞数(RBC)、白细胞数(WBC)、血小板数(PLT)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)；采用TBA-40FR全自动生化分析仪(Toshiba,日本)测定血浆谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)、肌酸磷酸激酶(CPK)和碱性磷酸酶(AKP)活性以及尿酸、总蛋白、白蛋白、葡萄糖、总胆红素、肌酐、总胆固醇和甘油三酯浓度。
1.4.5 组织病理学检测将固定的标本经水洗、透明、浸蜡、包埋等处理后，制成3～5 μm的切片，经苏木精-伊红(HE)染色后，在显微镜下观察肝脏、肾脏、心脏、肺脏和脾脏组织病理学形态变化,并用图像采集系统采集相应组织图像。
1.5 数据统计分析所有数据均用SAS 9.0[10]软件中的一般线 线性模型(general linear model，GLM)进行方差分析。因在所观测的所有指标上均未发现XOS与鸡只性别间存在明显的交互作用(P>0.05)，故将2种性别鸡只的数据合并起来进行统计分析。统计模型仅含处理效应，并以重复笼为试验单元。差异显著者，以最小显著差异(LSD)法比较各组平均值间的差异显著性。以0.05作为本研究中各项数据的差异显著性检验水平。
2 结果与分析 2.1 饲粮XOS添加水平对肉仔鸡生长性能及死亡率的影响由表2可见，饲粮XOS添加水平对1～21日 龄和22～42日龄阶段肉仔鸡平均日增重、平均日 采食量、料重比和死亡率均无显著影响(P>0.05)。试验期间，各组无任何鸡只出现毒性反应和死亡。以上结果表明，在本试验条件下，饲粮添加XOS对肉仔鸡生长性能均无显著影响，所有鸡只均未出现毒性反应和发生死亡。
| 表2 饲粮低聚木糖添加水平对肉仔鸡生长性能及死亡率的影响
Table 2 Effects of XOS added level on the growth performance and mortality of broilers
|
由表3可见，饲粮中添加XOS对21和42日 龄肉仔鸡红细胞数、白细胞数、血小板数、血红蛋 白浓度和红细胞压积均无显著影响(P>0.05),表明饲粮中添加XOS不显著影响肉仔鸡的主要血液常规生理指标。
| 表3 饲粮低聚木糖添加水平对肉仔鸡血液常规生理指标的影响
Table 3 Effects of XOS added level on hematological parameters of broilers
|
由表4可见，饲粮中添加XOS对21日龄肉仔鸡血浆球蛋白浓度，磷酸肌酸激酶、谷丙转氨酶活性及42日龄肉仔鸡血浆葡萄糖、甘油三酯浓度有显著影响(P<0.05)；而对21和42日龄肉仔鸡其他血浆生化指标无显著影响(P>0.05)。1 600 mg/kg添加组21日龄肉仔鸡血浆球蛋白浓度显著高于160和800 mg/kg添加组(P<0.05)，也有高于对照组的趋势(P>0.05)；1 600 mg/kg添加组21日龄肉仔鸡血浆磷酸肌酸激酶活性显著低于对照组和160 mg/kg添加组(P<0.05)，也有低于800 mg/kg添加组的趋势(P>0.05)；800、1 600 mg/kg添加组21日龄肉仔鸡血浆谷丙转氨酶活性显著低于对照组和160 mg/kg添加组(P<0.05)，而这2个添加组间很接近(P>0.05)。XOS的3个添加组42日龄肉仔鸡血浆葡萄糖浓度显著高于对照组(P<0.05)，且随XOS添加水平的增加而显著线性升高(P<0.05)；800、1 600 mg/kg添加组42日龄肉仔鸡血浆甘油三酯浓度显著低于对照组和160 mg/kg添加组(P<0.05)；1 600 mg/kg添加组42日龄肉仔鸡血浆肌酐浓度有高于对照组和800 mg/kg添加组的趋势(P>0.05)。
| 表4 饲粮低聚木糖添加水平对42日龄肉仔鸡血浆生化指标的影响 Table 4 Effects of dietary XOS added level on plasma biochemical parameters of broiler chicks at age of 42 days |
以上结果表明，在本次试验条件下，饲粮添加XOS对肉仔鸡多数血浆生化指标无显著影响。
2.4 饲粮XOS添加水平对42日龄肉仔鸡脏器指数的影响由表5可见，饲粮XOS添加水平除对42日龄肉仔鸡肾脏指数有显著影响(P<0.05)外，对其胸腺、法氏囊、脾脏、心脏、肝脏、肺脏、胰脏、腺胃、肌胃、十二指肠、空肠、回肠、十二指肠、空肠和回肠指数均无显著影响(P>0.05)。800 mg/kg添加组鸡肾脏指数显著高于对照组和1 600 mg/kg添加组(P<0.05)。此外，以上脏器外观未观测到任何异常变化。
| 表5 饲粮低聚木糖添加水平对42日龄肉仔鸡器官指数的影响 Table 5 Effects of dietary XOS added level on organ indices of broiler chicks at age of 42 days % |
以上结果表明，在本次试验条件下，饲粮添加XOS对肉仔鸡相关消化、呼吸、泌尿、免疫等主要内脏器官的发育均无不良影响。
2.5 饲粮XOS添加水平对42日龄肉仔鸡主要脏器组织病理学的影响由图1可见，XOS添加各组42日龄肉仔鸡心脏未见组织病理学变化。心脏被膜光滑；心肌细胞呈短柱状，排列紧密、整齐，细胞染色均匀；心肌细胞之间的闰盘结构及横纹间质无炎性细胞浸润；细胞核呈圆形或椭圆形，其长轴与肌原纤维的方向一致，位于肌细胞的中央。
 |
F表示母鸡，M表示公鸡。下图同。F means females, and M means males. The same as below.
图1 饲粮低聚木糖添加水平对42日龄肉仔鸡心脏组织病理变化的影响
Fig. 1 Effects of dietary XOS level on hispathological changes of heart in broiler chicks at age of 42 days |
由图2可见，XOS添加各组肉仔鸡肝脏未见组织病理学变化。肝小叶呈多角棱柱体，结构规则，分布均匀，有丰富的血管网，呈红褐色；肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，界限清晰，呈均匀的网状结构；肝细胞在肝小叶的边缘排列成环形肝板；肝索和肝窦结构完整清晰。
 |
图2 饲粮低聚木糖添加水平对42日龄肉仔鸡肝脏组织病理变化的影响
Fig. 2 Effects of dietary XOS level on hispathological changes of liver in broiler chicks at age of 42 days |
由图3可见，XOS添加各组肉仔鸡肾脏未见组织病理学变化。肾脏皮质部肾小球似球形，体积适中，结构正常，囊腔清晰；肾小球外有肾小囊包绕，结构完整清晰；肾小管上皮细胞结构正常，胞浆均质红染；髓质小体的集合管上皮细胞胞浆较均质。以上结果与上面的42日龄肉仔鸡血浆肾功指标结果完全一致。
 | 图3 饲粮低聚木糖添加水平对42日龄肉仔鸡肾脏组织病理变化的影响
Fig. 3 Effects of dietary XOS level on hispathological changes of kidney in broiler chicks on at age of 42 days |
由图4可见，XOS添加各组肉仔鸡脾脏未见组织病理学变化。脾脏结构清晰完整；脾小结数量和脾小结直径未见变化；中央动脉直径和周围淋巴鞘厚度、形状未见差异；脾索和脾窦相间排列，结构完整清晰，未见差异。
 | 图4 饲粮低聚木糖添加水平对42日龄肉仔鸡脾脏组织病理变化的影响
Fig. 4 Effects of dietary XOS level on hispathological changes of spleen in broiler chicks at age of 42 days |
由图5可见，XOS添加各组肉仔鸡肺脏未见组织病理学变化。肺呈鲜红色，表面覆被一层光滑的浆膜；三级支气管上皮细胞无炎性渗出物，表面微绒毛粗细一致，分布均匀；由单层上皮细胞构成的半球状肺泡结构清晰完整，形状未见差异；肺房上皮表面平整，细胞核呈圆形或椭圆形，位于细胞的中央；肺房隔内淋巴细胞有的形成淋巴小结；呼吸毛细管径大小均匀一致，管腔内无异物，上皮细胞表面光滑；呼吸毛细管周围毛细血管丰富，未见差异。
以上结果表明，在本次试验条件下，饲粮XOS添加各组肉仔鸡主要脏器均未观测到其显微结构和形态的组织病理学变化。
 | 图5 饲粮低聚木糖添加水平对42日龄肉仔鸡肺脏组织病理变化的影响
Fig. 5 Effects of dietary XOS level on hispathological changes of lung in broiler chicks at age of 42 days |
3 讨 论 3.1 饲粮XOS添加水平对肉仔鸡生长性能的影响
许多报道表明，饲粮中添加适宜的寡聚糖对家禽生长性能、屠宰性能及健康状况有明显改善作用，并能提高饲料报酬[11, 12]。但从目前的研究成果来看,有关XOS对家禽生长性能影响的研究结果并不一致。闫际平等[13]报道，与对照组及添加其它类别的低聚糖相比，肉仔鸡基础饲粮中添加XOS提高了肉仔鸡的日增重,但差异不显著。党国华[6]研究发现，饲粮中添加52.5 mg/kg的XOS可显著提高21日龄肉仔鸡日增重。石宁[4]发现XOS能增加42日龄Ross鸡的体重、提高日增重和降低耗料增重比。本实验室前期研究发现饲粮中添加100 mg/kg的XOS可明显改善生长后期肉仔鸡的饲料转化效率。本试验研究发现饲粮中添加高剂量XOS对肉仔鸡生长性能没有影响，可能是由于饲粮中添加的XOS水平过高，但均未造成明显的毒性反应。
3.2 饲粮XOS添加水平对肉仔鸡血液常规生理指标的影响血红蛋白存在于血液的红细胞中，主要功能是在血液中结合并转运氧气，也能和二氧化碳结合，维持血液酸碱平衡。谢玮等[3]用XOS喂养大鼠结果表明，各试验组大鼠生长发育良好，血常规测定结果在正常值范围内且与对照组无显著差异，表明XOS对大鼠血液常规生理指标未产生明显毒性作用。本研究结果同样表明，饲粮中添加XOS不影响血液中血红蛋白含量和红细胞压积，这表明饲粮中添加XOS对肉仔鸡血液生理指标无明显影响。
3.3 饲粮XOS添加水平对肉仔鸡血浆生化指标的 影响血清总蛋白、白蛋白和球蛋白的浓度反映了机体蛋白质的吸收和代谢状况。本研究结果表明饲粮中添加1 600 mg/kgXOS显著提高肉仔鸡前期血清球蛋白浓度，与陈雁南等[5]研究结果类似。这说明XOS对肉鸡机体蛋白质的吸收和代谢有一定的影响。
血清中总胆固醇、甘油三酯等浓度反映了脂类物质代谢状况，血清胆固醇浓度可近似代表体内胆固醇合成情况，血清甘油三酯浓度的高低反映了脂类在机体内的吸收利用状况。韩玉洁等[14]试验表明，XOS可有效降低高脂血症小鼠总胆固醇、甘油三酯浓度。陈雁南等[5]研究发现，XOS有降低肉仔鸡血清总胆固醇、甘油三酯浓度的趋势。本试验同样发现饲粮中添加800、1 600 mg/kgXOS能显著降低血清甘油三酯浓度。这说明XOS参与肉鸡机体的脂类代谢，能有效控制血清的甘油三酯水平。
血浆中磷酸肌酸激酶活性能反映出心肌细胞受损的水平[15]，本研究中，饲粮添加XOS肉仔鸡前期血浆磷酸肌酸激酶活性降低，说明XOS对肉仔鸡前期心肌有一定的保护作用，但这种作用在后期不再显现，具体原因有待进一步研究。这说明高剂量的XOS对肉仔鸡心肌无不良影响。
血清中谷丙转氨酶活性是反映肝脏功能的一个重要指标。肝细胞受损会导致血中谷丙转氨酶升高，也会引起肝脏代谢和解毒能力降低，从而使身体毒素不能及时排出。本研究结果表明，饲粮中添加800、1 600 mg/kg的XOS可显著降低肉仔鸡前期血清谷丙转氨酶活性，说明XOS对肉仔鸡前期肝脏有一定的保护作用，但这种作用在后期不再显现，具体原因有待进一步研究。这说明高剂量的XOS对肉仔鸡肝脏无不良影响。
3.4 饲粮XOS添加水平对42日龄肉仔鸡脏器指数的影响免疫器官指数和消化器官指数是反映动物免疫和消化功能的重要参考指标。本研究中，虽然800 mg/kg的添加剂量相比对照组和其他剂量组提高了肉仔鸡肾脏相对重量，但对其他器官指数均无显著影响，表明饲粮添加高剂量XOS对肉仔鸡免疫、消化、呼吸、泌尿系统内脏器官发育均无不良影响。Juskiewicz等[16]试验也表明低聚糖对火鸡的胃、小肠、结肠的相对重量均无显著影响。党国华[6]研究表明，XOS对肉仔鸡肠道生长发育具有积极的作用,对回肠生长发育有一定的促进趋势，但没有发现可以影响到空肠的发育。以上结果的不同可能是由于XOS的添加剂量或外界条件的不同造成的。
3.5 饲粮XOS添加水平对42日龄肉仔鸡重要组织病理变化的影响在较高XOS剂量下，少数研究发现，高剂量组动物少数出现肝细胞和肾间质细胞点状坏死，肾小管变性等，但病变程度较轻，且无组间特异性分布[3]。山东龙力公司技术部[17]用XOS灌胃给予小鼠，研究小鼠的遗传毒理学变化，发现其对小鼠精子和睾丸染色体无致癌变和畸变作用。谢玮等[3]用XOS喂养大鼠结果表明，各试验组大鼠生长发育良好，病理组织学检查未见异常，说明XOS对大鼠组织器官未产生明显毒性作用。而在本试验中同样未观测到肉仔鸡肝脏和肾等主要内脏器官组织显微结构和形态的组织病理学变化，表明饲粮添加高剂量XOS不会引起肉仔鸡重要组织的病理变化。
总之，饲粮添加高剂量XOS对肉仔鸡生长性能、血液主要生理指标、多数血浆生化指标和主要脏器发育均未产生影响。可能的原因是：适宜的XOS水平可调节动物肠道微生物区系平衡，建立健康有益的肠道内环境，促进肠道的生长，增加对营养物质的消化吸收，从而对动物机体产生有利影响[6]。而本试验饲粮中添加的XOS水平过高，可能产生抗营养的作用，因而未能对动物肠道微生物区系和肠道的生长产生有利影响，且机体存在一定的耐受性。所以在本试验的添加剂量下，XOS未能对动物生长性能和其他一些指标产生影响。
4 结 论① 饲粮添加160～1 600 mg/kg的XOS水平对肉仔鸡生长性能指标、血液主要生理指标、多数血浆生化指标和主要脏器发育均无不良影响。
② 主要内脏均未观测到组织病理学变化，所有鸡只均未出现毒性反应和死亡。
③ 肉仔鸡玉米-豆粕型饲粮中XOS的最高添加限量定为160 mg/kg，具有10倍的安全系数，对肉仔鸡饲用是安全的。
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