镰刀菌是农作物的重要病原菌，产生的镰刀菌毒素通常由脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON，又称呕吐毒素)、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)和烟曲霉毒素(FUM)等组成。全球范围内谷物和动物饲料易受到镰刀菌毒素的污染^[1]。调查我国主要的饲料原料和产品发现，镰刀菌毒素在我国污染较为普遍，黄河流域以北尤为严重^[2]。动物肠道既是营养物质消化吸收的主要场所，又是机体抵御外界病原微生物的第1道防线^[3]。前人研究证实镰刀菌毒素不仅能够通过氧化损伤途径对动物小肠造成危害，进而影响消化道功能^{[4, 5]}，而且会使仔猪小肠各肠段绒毛萎缩并影响肠道上皮细胞炎性因子mRNA的表达，造成肠道结构和组织成分的变化^{[6, 7]}。然而，镰刀菌毒素是否通过影响断奶仔猪小肠二糖酶活性和抗氧化能力造成肠道损伤方面的研究尚未见报道。本试验旨在研究自然霉变玉米和霉变玉米蛋白粉中镰刀菌毒素对断奶仔猪生长性能、小肠二糖酶活性和抗氧化能力的影响，为养猪生产提供科学依据。

选择35日龄的三元杂交(杜×长×大)断奶仔猪40头，平均体重为(8.45±0.94) kg，对照组20头，试验组20头，各组间初始体重差异不显著(P>0.05)。

仔猪采用单体笼(0.48 m²)饲养。单体笼使用塑料漏缝地板，安装有乳头饮水器和料槽，仔猪自由采食和饮水。试验开始前对猪舍进行全面清扫、消毒，试验期间每周进行1次猪舍消毒。舍内安装红外保温灯，第1周猪舍内温度维持在30 ℃左右，之后将猪舍内环境温度调整在26～28 ℃，猪 舍相对湿度为65%左右。

断奶仔猪基础饲粮参考美国NRC(2012)^[8]猪营养需要配制，饲粮组成及营养水平见表1。试验采用单因子试验设计，对照组饲喂基础饲粮，试验组用霉变玉米和霉变玉米蛋白粉代替基础饲粮中50%的玉米和玉米蛋白粉，预试期7 d，正试期35 d(试验在山东农业大学畜牧科技园进行)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of diets (air-dry basis) % 项目 Items 饲粮 Diets 对照组 Control group 试验组 Experimental group 原料 Ingredients 玉米 Corn 61.70 30.85 霉变玉米 Contaminated-corn 30.85 玉米蛋白粉 Corn gluten meal 5.00 2.50 霉变玉米蛋白粉 Contaminated-corn gluten meal 2.50 豆粕 Soybean meal 24.00 24.00 乳清粉 Whey powder 3.00 3.00 豆油 Soybean oil 2.50 2.50 磷酸氢钙 CaHPO4 1.30 1.30 石粉 Limestone 1.10 1.10 食盐 NaCl 0.40 0.40 预混料 Premix1) 1.00 1.00 合计 Total 100.00 100.00 营养水平 Nutrient levels2) 消化能 DE/(MJ/kg) 14.25 14.25 粗蛋白质 CP 19.26 19.11 钙 Ca 0.82 0.82 有效磷 AP 0.33 0.33 食盐 NaCl 0.42 0.42 赖氨酸 Lys 1.11 1.11 蛋氨酸 Met 0.41 0.41 苏氨酸 Thr 0.78 0.78 毒素含量 Toxin contents/(μg/kg)3) 玉米赤霉烯酮 ZEN 899.40 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 DON 170.20 1 429.40 烟曲霉毒素 FUM 340.00 5 846.50 1)预混料为每千克饲粮提供The premix provided the following per kg of diets：VA 330 0 IU，VD3 330 IU，VE 24 IU，VK3 0.75 mg，VB1 1.50 mg，VB2 5.25 mg，VB6 2.25 mg，VB12 0.026 mg，泛酸 pantothenic acid 15.00 mg，尼克酸 niacin 22.5 mg，生物素 biotin 0.075 mg，叶酸 folic acid 0.45 mg，Mn 6.00 mg，Fe 150 mg，Zn 150 mg，Cu 9.00 mg，I 0.21 mg，Se 0.45 mg。 2)粗蛋白质为实测值，其他营养水平为计算计值。CP was a measured value,and the other nutrient levels were calculated values. 3)实测值Measured values。

表1 饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of diets (air-dry basis)

本课题组于2013年6—12月相继从山东省16个饲料厂和21个养殖场抽检饲料原料样品共计153个，检测其毒素含量，调查毒素污染状况。从中选择毒素含量低于检测限的原料先配制对照组饲粮(基础饲粮)，再用全部自然霉变玉米和霉变玉米蛋白粉代替基础饲粮中的玉米和玉米蛋白粉配制100%镰刀菌毒素饲粮；然后用等量的对照饲粮和100%镰刀菌毒素饲粮混合配制成50%镰刀菌毒素饲粮(试验组饲粮)。试验所需饲粮于试验正式开始前1周一次性配制完成，在试验开始和结束后分别取样，用以分析饲粮中的毒素含量和粗蛋白质水平^[9]。

ZEN、黄曲霉毒素(AFL)、T-2毒素和FUM含量的测定采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光测定法，DON含量的测定采用高效液相色谱(HPLC)法。ZEN、DON、AFL、FUM和T-2毒素含量的最低检测限分别为0.1 mg/kg、0.1 mg/kg、1.0 μg/kg、0.25 mg/kg和1.0 μg/kg。饲粮毒素含量见表1，AFL和T-2毒素未检出或低于检测限水平。

每天记录仔猪的采食量和剩料量，试验前后对仔猪进行称重，并根据以上数据计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比[F/G，增重(g)/采食量(g)]。每天上午、下午2次记录仔猪排便情况，记录下痢拉稀仔猪数。

在试验第35天每个组随机挑选10头仔猪进行屠宰取样。仔猪电击致死后放血，剖开腹腔，将小肠从其肠系膜处取下并立即放入冰块中。十二指肠是胃和胆管在小肠开口处之间的部分，在距胃贲门5 cm处取样；空肠是十二指肠和回肠间的部分，于空肠的1/2处取样；回肠是回盲瓣和结肠间的部分，于回肠的1/2处取样。在十二指肠、空肠和回肠中部各取10 cm左右的肠段，并用冰冻的生理盐水轻轻冲洗肠内容物，用滤纸吸干水分，取下的每个肠段再均匀裁切成2段后分装在5 mL无菌冻存管中，立即放入液氮中速冻，再转入-80 ℃低温冰箱中冻存。

准确称取一定量肠段，按重量(g) ∶ 体积(mL)=1 ∶ 9加入生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，冷冻离心机离心(4 ℃，3 000 r/min)10 min，分离上清液，制备成10%的组织匀浆，待测各肠段中二糖酶活性以及抗氧化指标。

二糖酶活性的测定采用Hans^[10]推荐的酶偶联法(葡萄糖氧化酶-过氧化物酶偶联法)。乳糖酶试剂盒(A082-1)、蔗糖酶试剂盒(A082-2)和麦芽糖酶试剂盒(A082-3)购自南京建成生物工程研究所，具体测定方法均按试剂盒说明书进行。

谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)活性采用可见光法测定，总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性采用羟胺法测定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定。GSH-Px试剂盒(A005)、CAT试剂盒(A007-1)、T-SOD试剂盒(A001-1)和MDA试剂盒(A003-1)购自南京建成生物工程研究所，具体测定方法均按试剂盒说明书进行。

数据采用SAS 9.2统计软件进行均值的双样本成对t检验分析(two sample paired t-test for the means)，P<0.05为差异显著。

镰刀菌毒素对断奶仔猪生长性能的影响见表2。与对照组相比，镰刀菌毒素显著降低了仔猪的ADG和ADFI(P<0.05)，显著升高了F/G(P<0.05)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 镰刀菌毒素对断奶仔猪生长性能的影响 Table 2 Effects of Fusarium toxins on growth performance of weaning piglets (n=20) 项目 Items 对照组 Control group 试验组 Experimental group P值 P-value 平均日采食量 ADFI/(g/d) 794.40±18.29a 708.85±15.87b <0.001 平均日增重 ADG/(g/d) 546.86±14.70a 343.93±13.06b <0.001 料重比 F/G 1.43±0.04b 2.08±0.07a <0.001 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。 Values in the same row with the different small letter superscripts mean significantly different (P<0.05). The same as below.

表2 镰刀菌毒素对断奶仔猪生长性能的影响 Table 2 Effects of Fusarium toxins on growth performance of weaning piglets (n=20)

镰刀菌毒素对断奶仔猪小肠二糖酶活性的影响见表3。与对照组相比，镰刀菌毒素显著降低了十二指肠和空肠的乳糖酶活性、空肠和回肠的蔗糖酶活性(P<0.05)。试验组空肠的麦芽糖酶活性与对照组相比有上升的趋势(P<0.10)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 镰刀菌毒素对断奶仔猪小肠二糖酶活性的影响 Table 3 Effects of Fusarium toxins on small intestinal disaccharidase activities of weaning piglets (n=10) U/mg prot 项目 Items 对照组 Control group 试验组 Experimental group P值 P-value 乳糖酶 Lactase 十二指肠 Duodenum 19.38±1.83a 13.47±0.58b 0.042 空肠 Jejunum 102.15±4.51a 85.40±4.16b 0.032 回肠 Ileum 40.16±4.61 45.86±3.74 0.267 蔗糖酶 Suctase 十二指肠 Duodenum 7.65±0.27 6.97±0.31 0.159 空肠 Jejunum 66.83±1.08a 57.49±2.59b 0.012 回肠 Ileum 62.13±1.90a 37.80±2.69b 0.020 麦芽糖酶 Maltase 十二指肠 Duodenum 52.30±2.27 55.30±1.26 0.264 空肠 Jejunum 154.72±6.69 173.39±1.92 0.082 回肠 Ileum 56.37±3.51 46.32±1.21 0.126

表3 镰刀菌毒素对断奶仔猪小肠二糖酶活性的影响 Table 3 Effects of Fusarium toxins on small intestinal disaccharidase activities of weaning piglets (n=10)

镰刀菌毒素对断奶仔猪小肠抗氧化指标的影响见表4。与对照组相比，镰刀菌毒素显著降低了空肠和回肠的CAT活性以及十二指肠、空肠和回肠的T-SOD和GSH-Px活性(P<0.05)。试验组空肠和回肠的MDA含量则显著高于对照组(P<0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 镰刀菌毒素对断奶仔猪小肠抗氧化指标的影响 Table 4 Effects of Fusarium toxins on small intestinal antioxidant indices of weaning piglets (n=10) 项目 Items 对照组 Control group 试验组 Experimental group P值 P-value 过氧化氢酶 CAT/(U/mg prot) 十二指肠 Duodenum 26.96±2.53 28.56±3.50 0.668 空肠 Jejunum 8.30±0.24a 4.42±0.50b 0.009 回肠 Ileum 4.04±0.15a 1.48±0.24b 0.005 总超氧化物歧化酶 T-SOD/(U/mg prot) 十二指肠 Duodenum 142.14±2.99a 103.75±1.59b 0.003 空肠 Jejunum 87.76±2.43a 44.49±3.50b 0.003 回肠 Ileum 50.81±0.74a 36.04±2.55b 0.017 谷胱甘肽过氧化物酶 GSH-Px/(U/mg prot) 十二指肠 Duodenum 54.29±0.80a 43.24±1.84b 0.002 空肠 Jejunum 49.32±4.75a 33.84±3.50b 0.092 回肠 Ileum 157.95±10.87a 63.01±4.35b 0.006 丙二醛 MDA/(nmol/mg prot) 十二指肠 Duodenum 0.85±0.01 0.96±0.12 0.452 空肠 Jejunum 0.49±0.03b 1.62±0.08a <0.001 回肠 Ileum 1.16±0.07b 1.93±0.09a 0.013

表4 镰刀菌毒素对断奶仔猪小肠抗氧化指标的影响 Table 4 Effects of Fusarium toxins on small intestinal antioxidant indices of weaning piglets (n=10)

本试验采用已知镰刀菌毒素含量的自然霉变玉米和霉变玉米蛋白粉配制饲粮，以便更好地指导动物生产。尽管我们选择优质原料配制对照组饲粮，但是遗憾的是对照组饲粮中也检测到不同程度的毒素含量，这进一步说明我国毒素污染的普遍性及本研究的迫切性。由于本试验对照组饲粮中ZEN、DON和FUM的含量远低于我国《饲料卫生标准》规定的仔猪饲粮中ZEN、DON含量分别小于0.5(GB 13078.2—2006)、1 mg/kg(GB 13078.3—2007)(我国对于仔猪饲粮中FUM含量还没有制定相应的限量标准)以及欧盟关于仔猪饲粮中ZEN、DON和FUM含量分别小于0.1、0.9和5 mg/kg的最高限量规定^[11]，且试验组镰刀菌毒素含量均超过上述标准，因此对照组镰刀菌毒素含量不影响试验组结果的判断。但是，对照无毒素饲粮在仔猪上的试验仍需进一步研究。

镰刀菌毒素污染的饲粮会对仔猪的增重以及采食量产生负面影响^[12]。苏军^[6]用50%污染玉米饲粮(3.98 mg/kg DON，1.30 mg/kg ZEN，0.58 mg/kg FUM)饲喂断奶仔猪，与对照组相比显著降低了仔猪各阶段的ADFI和ADG。Winker等^[13]研究发现，镰刀菌毒素(50%霉变饲粮组：1.78 mg/kg DON，0.28 mg/kg ZEN；100%霉变饲粮组：3.97 mg/kg DON，0.63 mg/kg ZEN)显著降低了小母牛的生产性能，这与杨军^[14]在肉鸡上的研究和Wan等^[15]在肉鸭上的研究结论一致。但是，有研究指出ZEN(1.0～3.2 mg/kg)对断奶仔猪ADG和ADFI无显著影响^{[16, 17]}。DÄnicke等^[18]用含DON 2.19 mg/kg的饲粮饲喂仔猪，对仔猪ADG、ADFI和F/G也无显著影响。Yang等^[19]研究发现，自然霉变饲粮中霉菌毒素[霉变玉米含170 μg/kg黄曲霉毒素B₁(AFLB₁)，0.35 mg/kg ZEN，0.99 mg/kg DON，3.52 mg/kg FUM]显著降低肉鸭对干物质、氨基酸、能量的表观和真代谢率。本试验中,试验组ADFI比对照组降低10.8%，而ADG却比对照组降低37.1%，因此我们认为饲粮中镰刀菌毒素可能影响肠道健康，进而影响养分消化率，从而对生长性能产生负面影响，但其机理尚需进一步研究。镰刀菌毒素对动物生长性能影响结果的差异可能是因为较低剂量下，单一的镰刀菌毒素对仔猪生长性能的影响较小，而几种镰刀菌毒素的协同作用会显著影响断奶仔猪的生产性能^[6]。镰刀菌毒素协同作用的机理和剂量还有待进一步的研究。

饲粮中的碳水化合物主要由多糖、寡糖、二糖和单糖组成，动物体可直接吸收单糖，多糖和寡糖需先经过一系列消化酶的作用转变为二糖，二糖的消化吸收则需要小肠二糖酶的参与。因此，小肠二糖酶是碳水化合物消化吸收的关键酶^[20]。戴文波特^[21]认为二糖酶不是由消化腺分泌出来的，实质是来自脱落肠黏膜上皮细胞。因此，二糖酶活性的变化能够说明肠道的损伤状况。有关镰刀菌毒素与仔猪小肠二糖酶活性关系的报道较少，体内试验尚未见报道。本试验条件下，与对照组相比，试验组十二指肠的乳糖酶活性、空肠的乳糖酶和蔗糖酶活性以及回肠的蔗糖酶活性都有显著的下降，这与苏军^[6]以原代培养新生仔猪上皮细胞(PIEC)进行不同浓度梯度(0、2、4 mg/kg DON和0、5、10 mg/kg ZEN)的DON和ZEN联合攻毒试验，细胞增殖受到抑制，进而降低了二糖酶活性的结果一致。Wan等^[22]对仔猪空肠上皮细胞进行镰刀菌毒素(0.25~2 μmol/L DON和2.5~40 μmol/L ZEN或FUM)单独和联合攻毒试验，结果表明镰刀菌毒素能够降低空肠上皮细胞的存活率，并且DON-ZEN-FUM组有可加交互作用。因此,我们可以推测二糖酶活性下降很可能是由饲粮中的镰刀菌毒素使仔猪小肠受损，其上皮细胞的生成和脱落受到影响造成的，但其机理尚需进一步证实。此外，小肠二糖酶活性的下降与毒素直接的细胞毒性也有关^[23]。本试验中空肠二糖酶活性最高，这与黄晶晶等^[24]所用内毒素构建仔猪肠道损伤模型测定二糖酶活性的结果一致。值得注意的是，本试验中试验组空肠段的麦芽糖酶活性有上升的趋势，可能是因为镰刀菌毒素影响肾上腺和脑垂体发育^[25]，导致激素分泌异常，进而影响到了空肠段上皮细胞的半寿期，但具体影响途径和机制需要进一步研究证实。

CAT、GSH-Px和T-SOD是机体内重要的抗氧化酶，能够清除体内的氧自由基，并反映组织氧化损伤情况。镰刀菌毒素能够导致氧化应激，这可能会改变体内主要代谢过程如细胞膜代谢、蛋白质生物合成以及糖酵解^[26]。雷晓娅^[27]用自然霉变玉米配制饲粮(0.041 mg/kg ZEN，0.168 mg/kg AFLB₁)饲喂仔猪并对空肠黏膜的抗氧化指标进行测定，发现各抗氧化相关酶活性均降低。相似的是，本试验中，镰刀菌毒素显著降低了空肠和回肠的CAT活性以及十二指肠、空肠和回肠的T-SOD和GSH-Px活性。Taranu等^[28]用10 μmol/L ZEN对猪的空肠上皮细胞进行攻毒，发现毒素处理过的细胞中GSH-Px和CAT的基因水平被显著改变。相似的试验结果证明镰刀菌毒素能够影响抗氧化酶的基因表达，降低抗氧化酶活性，最终导致肠道细胞不能被抗氧化酶保护^[29]，肠道消除活性氧的能力下降，进而造成细胞内脂质过氧化物的生成增多，这与Kouadio等^[30]用浓度为10 μmol/L以上DON和ZEN诱导Caco-2细胞所得结论一致。MDA能够反映机体内脂质过氧化的程度，可以间接评价组织受损程度^{[31, 32]}。孟锐^[4]在小鼠上所做的DON、ZEN单独及联合染毒(0、1.5、2.5 mg/kg BW DON和0、20、30 mg/kg BW ZEN)的试验表明镰刀菌毒素能够增加空肠MDA含量。同时苏军^[6]用PIEC进行不同浓度梯度(0、2、4 mg/kg DON和0、5、10 mg/kg ZEN)的DON和ZEN联合攻毒试验，证实毒素能够显著增加其MDA含量。本试验中，试验组空肠和回肠的MDA含量显著高于对照组，这说明小肠细胞内氧自由基含量升高，细胞内的脂质过氧化物堆积，造成了具有酶活性的蛋白质功能的丧失。本试验中仔猪小肠抗氧化能力测定的结果证实镰刀菌毒素能够影响抗氧化酶活，通过加速自由基的产生和损害抗氧化系统来加速脂质的过氧化反应^[33]，造成肠道细胞的损伤，但其诱导机制还有待进一步研究。

本试验条件下，用污染镰刀菌毒素的饲粮(0.90 mg/kg ZEN，1.43 mg/kg DON，5.85 mg/kg FUM)饲喂断奶仔猪会降低其小肠二糖酶活性和抗氧化能力，危害小肠健康，并对生长性能造成负面影响。