过去几十年里，肥胖及其相关疾病(如2型糖尿病、血脂异常及高血压)在全世界范围内流行^[1]。而且绝经期妇女容易肥胖的问题也受到广泛关注。肥胖主要是由能量代谢紊乱引起，而且还与高胰岛素血症、胰岛素抗性及脂质代谢紊乱相关。动物机体脂肪代谢要受到多种激素调节，如雌激素、生长激素、甲状腺激素、糖皮质激素、胰岛素及胰岛素样生长因子都是些常见的调节脂质代谢的激素^[2]。近年来的一些研究表明，雌激素对于动物脂质代谢的调节起到了不可忽视的作用^[3]。雌激素可以抑制脂肪细胞中脂肪合成相关基因的表达，促进脂肪细胞的脂肪分解，并且还可以激活肌肉内脂质氧化^[4]。雌激素还被证明与成熟动物采食量降低、脂肪沉积及体重有关^[5]。绝经期妇女由于雌激素分泌的锐减，导致机体代谢紊乱，进而导致骨质疏松、糖尿病、冠心病和老年痴呆等一系列疾病的发病率提高。由此可见，雌激素的剧降是绝经动物容易肥胖的一个关键因素。为了控制肥胖，研究者们正在努力寻找新的方法。为此，具有雌激素特性的药物(如大豆异黄酮等植物性激素)及外源性雌激素(如戊酸雌二醇)替代疗法进入了研究者们的视野。经研究发现，外源性雌激素替代疗法对于控制肥胖(尤其是绝经期妇女肥胖)具有一定效果。但是目前关于外源性雌激素对动物机体脂质代谢影响的研究，绝大多数以更年期动物模型为研究对象，而以非更年期动物模型为研究对象的却少见报道。外源性雌激素是否会影响雌激素分泌正常动物的脂质代谢有待进一步研究。

人和动物的脂肪组织(尤其是白色脂肪组织)在能量平衡的维持及脂质代谢方面起到了关键作用^[6]。前人研究也表明，外源性雌激素对动物机体白色脂肪组织中的脂质代谢有调节作用，但是其作用机理仍然没有完全被研究清楚。本研究以青年雌性香猪(雌激素分泌正常)为受试动物，旨在探讨戊酸雌二醇对白色脂肪组织脂质代谢的影响及其作用机制。

按单因子试验设计，在广西巴马县某香猪养殖场选择20头健康的35日龄雌性巴马香猪，随机分为2个组，即对照组与试验组，每组10个重复，每个重复1头猪。对照组饲喂基础饲粮，试验组饲喂在基础饲粮中添加0.66 mg/kg戊酸雌二醇[相当于0.5 mg/kg雌二醇(E2)](Delpharm Lille S.A.S,法国)的试验饲粮。本试验外源性雌激素的添加水平是根据本课题组前期研究报道^[7]确定，前期研究表明饲粮中添加0.5 mg/kg的雌激素对小型香猪具有一定的生理效用。试验周期为120 d。根据巴马香猪的营养需要和生理特点，配制第1阶段(1～60 d)和第2阶段(61～120 d)基础饲粮，基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) % 项目 Items 含量 Content 1～60 d 61～120 d 原料 Ingredients 玉米 Corn 41.480 40.000 麦麸 Wheat bran 20.000 24.000 次粉 Wheat middling 15.000 11.850 米糠 Rice bran 10.000 12.000 鱼粉 Fish meal 6.000 菜籽粕 Rapeseed meal 3.000 3.000 玉米蛋白粉 Corn protein meal 2.000 大米蛋白粉 Rice protein meal 4.730 石粉 Limestone 0.770 1.968 磷酸氢钙 CaHPO4 0.240 1.074 赖氨酸 Lys 0.280 0.090 食盐 NaCl 0.150 0.208 胆碱 Choline 0.080 0.080 预混料 Premix1) 1.000 1.000 合计 Total 100.000 100.000 营养水平 Nutrient levels2) 消化能 DE/(MJ/kg) 12.48 12.13 粗蛋白质 CP 15.50 14.50 赖氨酸 Lys 0.88 0.60 蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys 0.549 0.403 钙 Ca 0.74 1.00 总磷 TP 0.79 0.80 有效磷 AP 0.35 0.30 1)预混料为每千克饲粮提供The premix provided the following per kg of diets：1～60 d，Cu (as copper sulfate) 4.45 mg,Fe (as ferrous sulfate) 90.9 mg,Mn (as manganese sulfate) 3 mg，Zn (as zinc sulfate) 90.9 mg，I (as potassium iodide) 0.12 mg，Se (as sodium selenite) 0.26 mg,VA 17.14 mg,VD3 3.57 mg，VE 18.57 mg，VK3 4.20 mg，VB1 1.83 mg，VB2 5.36 mg，VB6 2.61 mg，VB12 1.07 mg，烟酸 niacin 25.00 mg，泛酸 pantothenic acid 9.52 mg，叶酸 folic acid 0.71 mg，生物素 biotin 3.57 mg，VC 10 mg；61～120 d，Cu (as copper sulfate) 4.2 mg,Fe (as ferrous sulfate) 73.5 mg,Mn (as manganese sulfate) 16.8 mg，Zn (as zinc sulfate) 52.5 mg，I (as potassium iodide) 0.13 mg，Se (as sodium selenite) 0.16 mg,VA 17.14 mg,VD3 3.57 mg，VE 18.57 mg，VK3 4.20 mg，VB1 1.83 mg，VB2 5.36 mg，VB6 2.61 mg，VB12 1.07 mg，烟酸 niacin 25.00 mg，泛酸 pantothenic acid 9.52 mg，叶酸 folic acid 0.71 mg，生物素 biotin 3.57 mg，VC 10 mg。 2)消化能为计算值，其余为实测值。DE was a calculated value， while others were measured values.

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis)

饲喂前清洗食槽，每天08:00、16:00分2次喂料。各组均采取限饲，每天饲喂量为体重的3%(饲喂过程中，每隔2周称重1次，饲喂量即为每次称重后体重的3%)。猪只单栏饲养，试验全期猪只自由饮水。

饲养结束后，每组随机抽取5头猪进行屠宰试验。屠宰前1天对各组香猪称重并记录其末体重。禁食12 h后屠宰，宰前进行前腔静脉采血，离心分离血清后于-20 ℃保存，用于后续检测。采血后屠宰，去头、蹄、尾及内脏，保留肾脏及板油，得到胴体。将胴体分为左右两半，左半胴体用于取脂肪样品，右半胴体用于胴体分割。于左半胴体取背部皮下脂肪、腹部皮下脂肪及肾周脂肪样各4份，每份约1 g，用锡箔纸包好，液氮速冻后保存于-80 ℃，备用。右半胴体分割前称重并记录，仔细分离出皮下脂肪及板油，合并所分离脂肪称重并记录。

根据公式计算出体增重及体脂肪率：

体增重=末体重-初体重；
体脂肪率=右半胴体脂肪重/右半胴体重。

血液中葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)及低密度脂蛋白(LDL)含量采用全自动生化分析仪测定，试剂盒购自北京利得曼生化股份有限公司。

采用酶联免疫吸附试验法进行血液E2水平测定。将血清于室温解冻后，1 000×g离心20 min后根据试剂盒的说明书进行测定，试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司。

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具体引物序列见表2。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 实时荧光定量PCR引物序列 Table 2 Primer sequences for fluorescence-based quantitative real-time PCR 基因 Genes 引物序列 Sequence of primers (5′—3′) 产物大小 Product size/bp 参考文献 Reference β-肌动蛋白 β-actin F:TGCGGGACATCAAGGAGAAG R:AGTTGAAGGTGGTCTCGTGG 216 Yang等[6] 脂肪酸合成酶 FAS F:CTACCTTGTGGATCACTGCATAGA R:GGCGTCTCCTCCAAGTTCTG 114 Yang等[6] 乙酰辅酶-A羧化酶 ACC F:GGAGACAAACAGGGACCATTACA R:CAGGGACTGCCGAAACATC 144 Yang等[6] 过氧化物酶体增殖因子受体-γ PPAR-γ F:CATTCGCATCTTTCAGGG R:GGACGCCATACTTTAGGA 134 Yang等[6] 过氧化物酶体增殖因子受体-α PPAR-α F:CATCCTCGCGGGAAAGG R:GGCCATACACAGTGTCTCCATGT 70 Yang等[6] 激素敏感脂肪酶 HSL F:TCAGGTGTCTTTGCGGGTAT R:CTTGTGCGGAAGAAGATGCT 215 Yang等[6] 脂肪甘油三酯脂酶 ATGL F:TCACCAACACCAGCATCCA R:GCACATCTCTCGAAGCACCA 95 Yang等[6] 脂蛋白脂肪酶 LPL F:CAAACTTGTGGCTGCCCTAT R:GTGGACATTGTTGGGAGGAT 184 Tan等[8] 雌激素受体-α ER-α F:ATTGGTCTTGTCTGGCGCTCC R:GGTCATAGAGGGGCACCACGT 451 Chen等[9] 雌激素受体-β ER-β F:AGAGACATTGAAAAGGAAGG R:GCCTTACATCCTTCACATGA 150 Chen等[9]

表2 实时荧光定量PCR引物序列 Table 2 Primer sequences for fluorescence-based quantitative real-time PCR

用Trizol试剂(Invitrogen)提取各脂肪组织样品中总RNA。对所提总RNA进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测RNA质量后用PrimeScript RT试剂盒(TaKaRa)进行反转录。根据实时荧光定量PCR原始检测结果，按照2^-△△Cｔ相对定量计算公式，分析各脂肪组织中目的基因mRNA相对表达水平。

数据先用Excel进行预处理，再用SPSS 17.0 统计软件进行独立样本t检验。结果以平均值±标准误(mean±SE)表示。P<0.05为差异显著。

戊酸雌二醇对雌性巴马香猪生长性能及体脂肪率的影响见表3。与对照组相比，试验组雌性香猪的末体重、体增重及脂肪率均显著降低(P<0.05)，表明戊酸雌二醇抑制了雌性香猪的体增重及脂肪的沉积。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 戊酸雌二醇对雌性巴马香猪生长性能及体脂肪率的影响 Table 3 Effects of estradiol valerate on growth performance and body fat percentage of female Bama Xiang-pigs 项目 Items 对照组 Control group 试验组 Experimental group 初始体重 Initial body weight/kg 4.73±0.18 4.80±0.08 末体重 Final body weight/kg 20.76±0.43a 17.72±0.39b 体增重 Body weight gain/kg 16.03±0.38a 12.92±0.37b 体脂肪率 Body fat percentage/% 16.93±0.58a 13.77±0.99b 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。 In the same row,values with different small letter superscripts mean significant difference (P＜0.05). The same as below.

表3 戊酸雌二醇对雌性巴马香猪生长性能及体脂肪率的影响 Table 3 Effects of estradiol valerate on growth performance and body fat percentage of female Bama Xiang-pigs

由表4可知，与对照组相比，试验组雌性香猪血液GLU、TG及LDL含量均显著降低(P<0.05)，表明戊酸雌二醇可以改善雌性香猪血糖及血脂水平。戊酸雌二醇对雌性香猪血液E2水平的影响不显著(P>0.05)，但相比于对照组，试验组雌性香猪血液E2水平有升高的趋势。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 戊酸雌二醇对雌性巴马香猪血液生化指标及雌二醇水平的影响 Table 4 Effects of estradiol valerate on blood biochemical indices and E2 level of female Bama Xiang-pigs 项目 Items 对照组 Control group 试验组 Experimental group 葡萄糖 GLU/(mmol/L) 4.80±0.11a 3.67±0.28b 甘油三酯 TG/(mmol/L) 0.33±0.01a 0.24±0.02b 低密度脂蛋白 LDL/(mmol/L) 0.85±0.08a 0.58±0.03b 雌二醇 E2/(pg/mL) 87.21±3.00 95.29±2.52

表4 戊酸雌二醇对雌性巴马香猪血液生化指标及雌二醇水平的影响 Table 4 Effects of estradiol valerate on blood biochemical indices and E2 level of female Bama Xiang-pigs

戊酸雌二醇对雌性巴马香猪白色脂肪组织中脂肪代谢相关基因及雌激素受体基因表达的影响见表5。

与对照组相比，试验组雌性巴马香猪背部皮下脂肪中脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰辅酶-A羧化酶(ACC)及脂蛋白脂肪酶(LPL)的mRNA的相对表达水平显著降低(P<0.05)，激素敏感脂肪酶(HSL)、脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)及雌激素受体-β(ER-β)的mRNA相对表达水平显著升高(P<0.05)，过氧化物酶体增殖因子受体-γ(PPAR-γ)、过氧化物酶体增殖因子受体-α(PPAR-α)及雌激素受体-α(ER-α)的mRNA相对表达水平无显著变化(P>0.05)。

与对照组相比，试验组雌性巴马香猪腹部皮下脂肪中的FAS、ACC及LPL的mRNA相对表达水平显著降低(P<0.05)，PPAR-α、HSL、ATGL、ER-α及ER-β的mRNA相对表达水平显著升高(P<0.05)，PPAR-γ的mRNA相对表达水平无显著变化(P>0.05)。

与对照组相比，试验组雌性巴马香猪肾周脂肪中的PPAR-γ、FAS、ER-α及ER-β的mRNA相对表达水平显著降低(P<0.05)，HSL、ATGL及LPL 的mRNA相对表达水平显著升高(P<0.05)，ACC及PPAR-α的mRNA相对表达水平无显著差异(P>0.05)。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 戊酸雌二醇对雌性巴马香猪白色脂肪组织中脂肪代谢相关基因及雌激素受体基因表达的影响 Table 5 Effects of estradiol valerate on the expression of lipid metabolism related genes and ERs genes in white adipose tissues of female Bama Xiang-pigs 基因 Genes 背部皮下脂肪 Dorsal subcutaneous adipose 对照组 Control group 试验组 Experimental group 腹部皮下脂肪 Abdominal subcutaneous adipose 对照组 Control group 试验组 Experimental group 肾周脂肪 Perirenal adipose 对照组 Control group 试验组 Experimental group 过氧化物酶体增殖因子受体-γ PPAR-γ 1 0.80±0.16 1 0.99±0.07 1a 0.47±0.05b 脂肪酸合成酶 FAS 1a 0.32±0.12b 1a 0.38±0.06b 1a 0.56±0.04b 乙酰辅酶-A羧化酶 ACC 1a 0.43±0.14b 1a 0.36±0.07b 1 1.09±0.14 过氧化物酶体增殖因子受体-α PPAR-α 1 0.97±0.05 1b 2.11±0.23a 1 1.25±0.12 激素敏感脂肪酶 HSL 1b 2.02±0.19a 1b 2.36±0.09a 1b 1.95±0.16a 脂肪甘油三酯脂酶 ATGL 1b 5.06±1.17a 1b 3.01±0.60a 1b 2.42±0.28a 雌激素受体-α ER-α 1 1.10±0.14 1b 1.91±0.14a 1a 0.36±0.10b 雌激素受体-β ER-β 1b 3.33±0.73a 1b 1.83±0.12a 1a 0.34±0.11b 脂蛋白脂肪酶 LPL 1a 0.42±0.11b 1a 0.38±0.08b 1b 2.48±0.30a

表5 戊酸雌二醇对雌性巴马香猪白色脂肪组织中脂肪代谢相关基因及雌激素受体基因表达的影响 Table 5 Effects of estradiol valerate on the expression of lipid metabolism related genes and ERs genes in white adipose tissues of female Bama Xiang-pigs

体增重及体脂肪率是衡量动物机体是否肥胖的2个重要表观指标。为了了解戊酸雌二醇是否能够控制雌性巴马香猪肥胖，本试验测定了雌性香猪体增重及体脂肪率这2个指标。Chmouliovsky等^[10]研究表明，雌激素替代疗法有利于胰岛素反应，促进血脂和能量消耗，并有利于提高脂质氧化作用而使体重减轻。Hao等^[11]研究表明，去卵巢大鼠饲喂雌激素后，体重及体脂肪重显著下降。王瑞云等^[12]报道，绝经后妇女服用雌激素后，体重也有一定程度降低。这些报道的研究结果基本与本试验结果一致。本试验在非绝经雌性香猪饲粮中添加戊酸雌二醇显著降低了体增重及体脂肪率。

糖脂代谢紊乱是心血管疾病的危险因素已被人们广泛认同，胰岛素抵抗是绝经妇女心血管疾病等慢性病发生的病理基础。雌激素补充治疗对绝经妇女糖脂代谢及胰岛素的影响也越来越受到公众关注。血液中GLU、TG及LDL含量等生化指标是动物机体糖脂代谢的间接反映指标。近些年也有大量有关外源性雌激素对动物血糖、血脂影响的研究。杨树琳等^[13]研究表明，口服戊酸雌二醇可显著降低自然更年期大鼠血液GLU、TG及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量。杨树琳等^[14]还报道，戊酸雌二醇可以升高去势大鼠血液高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量，降低LDL-C含量，而对血液GLU及TG含量没有显著影响。本实验结果证实：饲粮中添加戊酸雌二醇可以显著降低雌性香猪血液GLU、TG及LDL含量，这与上述前人的研究结果基本保持一致。然而，也有些研究表明，饲粮添加雌激素对试验动物血糖、血脂水平无显著影响，甚至有升高血糖、血脂作用，这些研究结果的差异可能与给药方式、给药剂量、试验动物性别有关。

雌激素已经被证明与人或动物机体脂质代谢密切相关，并且绝经妇女或动物容易肥胖的一个决定性因素就是体内雌激素水平急剧下降。外源性雌激素替代治疗之所以能够改善脂质代谢，其中的一个原因就是外源雌激素可以补给体内雌激素，从而使动物机体雌激素水平上升达到正常水平。杨树琳等^[14]报道，戊酸雌二醇可以显著升高去势大鼠血液E2水平。王瑞云等^[12]报道称，绝经妇女在接受戊酸雌二醇治疗后，血液E2水平显著升高。本试验结果表明，戊酸雌二醇对雌性香猪血液E2水平无显著影响，但有提高血液E2水平的趋势。前人研究表明，外源性雌激素可以补给绝经或更年期动物雌激素，从而使血液雌激素水平升高。但本试验中，外源性雌激素对雌激素分泌正常的雌性香猪的血液雌激素水平的提高没有像绝经或更年期动物那么明显，其中原因可能是因为雌激素分泌正常的雌性香猪的雌激素分泌具有反馈调节作用。虽然戊酸雌二醇对雌性香猪血液雌激素水平无显著影响，但还是有一定的升高趋势，可能少量的雌激素水平升高，也能够发挥雌激素对香猪脂质代谢调控的效应。

众所周知，脂肪组织中脂质代谢包括脂肪合成与脂肪分解代谢，脂肪组织质量受脂肪合成与脂肪分解代谢平衡的调节。脂肪细胞的生长分化由激素引发的CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)与过氧化物酶体增殖因子受体(PPARs)协同作用调节，并且PPARs是最主要的脂肪合成转录因子^[15]。PPAR-α及PPAR-γ是PPARs蛋白家族的2个重要成员，PPAR-α主要调控脂肪分解相关基因的转录，而PPAR-γ主要调控脂肪细胞分化相关基因的表达及胰岛素感应^[15]。FAS及ACC是PPAR-γ的2个重要的下游基因，在脂肪合成代谢中起到关键作用^{[6, 16]}。HSL及ATGL是PPAR-α的2个重要的下游基因，ATGL是脂肪分解过程中的关键酶，主要负责TG分解代谢的第1步，HSL是脂肪组织中TG分解代谢过程中另一个关键酶，主要负责TG分解代谢的第2步(即将二酰甘油分解为单酰甘油)^[17]。因此，可以将PPAR-γ、FAS及ACC称为脂肪合成基因，而将PPAR-α、HSL及ATGL称为脂肪分解基因。本试验结果表明，饲粮添加戊酸雌二醇抑制了雌性巴马香猪白色脂肪组织中脂肪合成基因的表达，而促进了脂肪分解基因的表达，由此可见，戊酸雌二醇可能通过抑制脂肪合成途径及促进脂肪分解途径来调控白色脂肪组织脂质代谢。

雌激素是雄性及雌性动物脂肪组织中调控脂肪细胞生长和数量的关键激素^[18]。Misso等^[19]研究表明，雌激素与雌激素受体结合可以降低LPL(一种调控脂肪细胞摄取脂质的关键酶)的活性来抑制脂肪合成。雌激素受体广泛分布于各脂肪组织中，ER-α及ER-β是动物组织中表达的2种主要的雌激素受体，且均与雌激素有良好的亲和能力。既然雌激素可以通过与雌激素受体的结合来抑制脂肪的合成，那么我们可以认为，除了对脂肪合成与脂肪分解基因表达的调节，戊酸雌二醇还有可能通过对雌激素受体基因表达的调控来调节脂肪的合成。本试验结果表明：戊酸雌二醇上调了背部及腹部皮下脂肪中ER-α及ER-β的表达，且下调了背部及腹部皮下脂肪中LPL的表达；但却下调了肾周脂肪中ER-α及ER-β的表达，上调了肾周脂肪中LPL的表达。由此可见，饲粮中添加戊酸雌二醇的确可以通过调节脂肪组织中雌激素受体基因的表达来调节LPL的表达，进而影响脂肪组织中脂质的合成。由这些结果还可以看出，戊酸雌二醇对雌激素受体基因表达的调节具有部位特异性，这与Dieudonné等^[20]的研究结果一致，Dieudonné等^[20]发现，对来自不同脂肪组织的脂肪细胞进行雌激素处理，不同脂肪组织的脂肪细胞中雌激素受体基因的表达不一致。

① 戊酸雌二醇可以有效地控制雌性巴马香猪的体增重及脂肪的沉积，并且能有效地改善血糖及血脂水平。

② 戊酸雌二醇可能通过2个途径来调节非绝经雌性香猪白色脂肪组织中的脂质代谢：其一，通过对脂肪合成及脂肪分解相关基因表达的调节来影响脂质代谢；其二，通过对雌激素受体基因表达的调节来调控LPL的表达，进而影响脂肪的合成代谢。