黄曲霉毒素B1(AFB1)是一种强致癌物质，被联合国癌症委员会确定为一类致癌物[1]。温暖潮湿气候的粮食和饲料[2]极易污染AFB1，尤其是谷物、棉籽和花生在收割前后均易污染AFB1[3]。动物摄入AFB1后，在肝脏中通过微粒体细胞色素P-450转化为黄曲霉毒素M1(AFM1)，AFM1也是一种强致癌物，通过血液循环进入到乳中，危害食品安全。因此非常有必要研究饲料中AFB1通过动物机体代谢转化到乳中AFM1的分泌规律及转化率，为有效控制饲料中AFB1污染对乳品质量安全的影响提供基础数据。
为了减少人类和动物污染黄曲霉毒素，许多国家对奶畜饲料中AFB1和乳中AFM1均设置了最大限量值，然而这些限量值在不同国家之间变化范围比较大。对于饲料，欧盟奶畜全价饲料中AFB1限量值是5 μg/kg[4]，美国动物饲料和奶畜饲料原料中黄曲霉毒素总和的限量值是20 μg/kg[5]，我国奶畜精饲料中AFB1限量值是10 μg/kg。对于乳的限量，欧盟对于液态乳和乳产品等设置的限量值是0.05 μg/kg，婴幼儿用乳中是0.025 μg/kg，美国食品药品监督管理局(FDA)和我国的限量值均是0.5 μg/kg。
对于饲料中AFB1与乳中AFM1的相关性，已有一些学者进行了相关研究[6, 7, 8, 9, 10]，然而这些研究主要是给奶畜饲喂一段时间自然霉变的饲料，探讨乳中AFM1的变化。实践中可能也会发生只饲喂1次AFB1污染的饲料导致乳中AFM1超过限量值[8]，然而对动物只饲喂1次AFB1污染的饲料导致乳中AFM1变化的研究较少。因此，本试验通过给奶山羊饲喂一次性单一剂量的AFB1，研究乳中AFM1的分泌规律及转化率，旨在对实践中偶然发生AFB1污染进行准确风险分析。
1 材料与方法 1.1 试验动物和饲养管理选择3只健康、体重在(35.00±2.65) kg的泌乳中期[泌乳天数(150±12) d]关中奶山羊，产奶量为(0.36±0.03) kg，胎次为2～3胎。试验羊单笼饲养，每天于08:00和16:00以先粗后精顺序分2次饲喂饲粮，饲粮的精粗比是50 ∶ 50，精饲料饲喂600 g/(d·只)，苜蓿饲喂376 g/(d·只)，青干草274 g/(d·只)，自由饮水。试验之前，奶山羊每天挤奶2次，08:30和16:30。
1.2 基础饲粮基础饲粮满足NRC(1981)奶山羊(体重为35 kg)的推荐量，并参照我国奶山羊饲养标准[11]配制。基础饲粮组成及营养水平见表1。
 | 表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
根据Battacone等[8, 12]的试验方法，本试验每只奶山羊饲喂1 mg AFB1，试验所用AFB1为粉末(纯度为99.9%)，用甲醇溶解后添加到300 g精饲料中，用于08:00的饲喂，添加后精饲料中AFB1的含量为3 333.3 μg/kg。
在饲喂AFB1后0、4、8、24、32、48、56、72、80、96、104及120 h记录每只羊的产奶量并采集乳样，冷冻保存。
1.4 测定指标 1.4.1 羊乳中AFM1含量羊乳中AFM1含量的检测方法参照GB 5413.37—2010，具体步骤如下。
1.4.1.1 试液提取称取20.00 g(精确至0.01 g)混匀的乳样，置于50 mL具塞离心管中，在水浴中加热到35～37 ℃。在6 000 r/min下离心10 min。收集全部上清液，供净化用。
1.4.1.2 净化① 免疫亲和柱的准备。将一次性的50 mL注射器筒与亲和柱上顶部相串联，再将亲和柱与固相萃取装置连接起来。
② 试样的纯化。将以上试液提取液移至50 mL注射器筒中，调节固相萃取装置的真空系统，控制试样以2～3 mL/min稳定的流速过柱。取下50 mL的注射器筒，装上10 mL注射器筒。注射器筒内加入水，以稳定的流速洗柱，然后，抽干亲和柱。脱开真空系统，在亲和柱下部放入10 mL刻度试管，上部装上另一个10 mL注射器筒，加入4 mL乙腈，洗脱AFM1，洗脱液收集在刻度试管中，洗脱时间不少于60 s。然后用氮气缓缓地在30 ℃下将洗脱液蒸发至近干(如果蒸发至干，会损失AFM1)，用乙腈水溶液(10%)稀释至1 mL。 1.4.1.3 检测条件
采用高效液相色谱(HPLC)串联质谱检测，仪器设备型号为waters UPLC/Quattro Premier-XE。
① HPLC条件。色谱柱：ACQUITY UPLC BEH-C18，1.7 μm,2.1 mm(内径)×100 mm；流动相：A液，0.1%甲酸溶液，B液，乙腈梯度洗脱；流 动相流速：0.3 mL/min。柱温：35 ℃；进样量： 5 μL；保留时间：3.42 min。
| 表2 高效液相色谱洗脱条件 Table 2 The elution condition for HPLC |
② 质谱条件。毛细管电压：2.5 kv；离子源温度：120 ℃；脱溶剂气流：氮气，600 L/h；脱溶剂气温度：450 ℃；碰撞室压力：3.0×10-4 kPa；扫描方式：正离子模式(ESI+)；检测方式： 多反应监测(MRM)；定量离子：328.88>258.94，碰撞能量：25 eV；定性离子：328.88>272.95，碰撞能量：25 eV。
1.4.2 羊乳中AFM1的转化率AFM1各时间点转化率(%)=100×AFM1
各时间点含量×各时间点产奶量/AFB1添加量；
AFM1总转化率(%)=∑AFM1各时间点转化率。
试验数据基本处理采用Excel 2007，数据统计分析采用SAS 9.0进行方差分析，平均值的多重比较采用Duncan氏法进行。
2 结果与分析 2.1 饲喂AFB1对各试验羊乳中AFM1分泌规律的影响由图1可知，饲喂AFB1前，3只羊的乳中均未检出AFM1，但是在饲喂AFB1后4 h收集的羊乳中，3只羊均检出了AFM1。在1号和2号羊乳中，峰值出现在饲喂AFB1后的4 h，而在3号羊乳中，峰值出现在8 h。在峰值之后，所有羊乳中AFM1含量迅速下降，在120 h时，只有1号羊乳中未检出AFM1，2号和3号羊乳中仍有微量AFM1检出。虽然3只羊乳中AFM1分泌曲线相似，即呈先增加后下降趋势，但是单一曲线在上升过程中差异较大，2号和3号羊乳中AFM1上升幅度比1号羊大。
 | 图1 饲喂AFB1后各试验羊乳中AFM1含量的分泌规律 Fig. 1 Excretion pattern of AFM1 content in milk of experimental goats after fed AFB1 |
2.2 饲喂AFB1对羊乳中AFM1平均含量的 分泌规律的影响
由图2可知，饲喂AFB1后，羊乳中AFM1的平均含量呈现先增加后下降的趋势，在4 h时达到峰值9.89 μg/kg，接近我国限量值0.5 μg/kg的20倍；在峰值之后，羊乳中AFM1平均含量减少比较快，在56 h时含量为0.39 μg/kg，低于我国限量值，到120 h为0.02 μg/kg，低于欧盟限量值0.05 μg/kg；在4和8 h时，AFM1平均含量显著高于以后其他各时间点(P<0.05)，24 h时AFM1的 平均含量显著高于56 h及以后其他各时间点(P<0.05)，32 h及以后各时间点之间AFM1平均含量差异不显著(P>0.05)。
 | 数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 Values with different small letter superscripts mean significant difference （P<0.05）.图2 饲喂AFB1后试验羊乳中AFM1平均含量的分泌规律 Fig. 2 Excretion pattern of AFM1 average content in milk of experimental goats fed AFB1 |
2.3 饲喂AFB1对羊乳中AFM1平均转化率的影响
由图3可知，随着取样时间的延长，AFB1转化为AFM1的平均转化率逐渐降低，到80 h时为0。其中AFB1转化为AFM1的总转化率为0.53%；饲喂AFB1后4 h时转化率最高为0.19%，8和24 h次之，这3个时间点平均转化率的和为0.43%。
 | 图3 饲料中AFB1转化为羊乳中AFM1的平均转化率的变化 Fig. 3 The change of average carry-over rate of AFB1 into AFM1 in milk of goats |
3 讨 论 3.1 饲喂AFB1后对试验羊乳中AFM1含量的分泌规律的影响
Battacone等[12]报道，给5只奶山羊饲喂单一剂量AFB1后，羊乳中AFM1在上升过程中变化比较大，但5只羊乳中AFM1分泌曲线却相似，这与本试验结果相似。Battacone等[12]给奶山羊饲喂0.8 mg AFB1，在饲喂后3 h时采集乳样检出了AFM1；Gallo等[13]给奶牛饲喂4.9 mg的AFB1，饲喂5 min后采血检出了AFM1；Cook等[14]给肉牛饲喂0.2～0.8 mg/kg BW的混合黄曲霉毒素(AFB1为75%)，饲喂后30 min在血液中检出了AFM1，这些结果与本试验结果相似，表明AFB1在成年反刍动物的胃肠道吸收非常快，并且它的羟基化合物AFM1也很快分泌到乳中。
Battacone等[12]报道，给奶山羊饲喂单一剂量AFB1后，羊乳中AFM1的峰值在饲喂后3和6 h达到，为0.6～1.8 μg/kg，这一结果不同于本试验结果4和8 h(5.32～13.47 μg/kg)，本试验AFM1峰值含量是Battacone等[12]试验结果的7.5～8.9倍。可能的原因有AFB1不同的喂量、奶山羊的品种、产奶量及体重等。本试验AFB1的喂量是1 mg，奶山羊为关中奶山羊，平均产奶量是0.36 kg，平均体重是35 kg，而Battacone等[12]饲喂的量是0.8 mg，奶山羊为萨能奶山羊，平均产奶量是3.35 kg，平均体重是59 kg，但不同饲粮也可能是导致2个试验峰值AFM1含量不同的原因，本试验饲喂的饲粮是精饲料、青干草与苜蓿，而Battacone等[12]饲喂的只是精饲料和干草，不含苜蓿，因此不同饲粮影响AFB1在瘤胃中的降解不同，导致羊乳中AFM1含量也不同。
3.2 饲喂AFB1对羊乳中AFM1平均含量 分泌规律的影响Battacone等[12]报道，给奶山羊饲喂AFB1后，羊乳中AFM1含量在3和6 h极显著高于其他时间点，与本试验结果AFM1平均含量在4 和8 h显著高于其他各时间点相似。
Battacone等[9]报道，给奶山羊连续7 d饲喂AFB1[128 μg/(d·只)]，羊乳中AFM1的含量在2~7 d达到一个稳定值，停止饲喂AFB1后，羊乳中AFM1含量迅速下降，在停止饲喂4 d后，羊乳中检测不到AFM1；Battacone等[12]报道，给奶山羊饲喂1次AFB1(0.8 mg)，84 h时检测不到羊乳中AFM1；本试验饲喂1次AFB1(1 mg)，在饲喂后第5天早晨(120 h)所采集的羊乳中有微量AFM1被检出(0.02 μg/kg)，不同于Battacone等[9，12]的试验结果，可能是AFB1饲喂量、饲粮及产奶量不同所致。
Battacone等[12]报道，在饲喂AFB1后36 h收集的羊乳中，AFM1含量低于欧盟限量值0.05 μg/kg；本试验结果表明，120 h羊乳中AFM1含量低于欧盟限量值。
3.3 饲喂AFB1对羊乳中AFM1平均转化率的影响本试验饲喂AFB1后4、8和24 h 3个时间点AFM1平均转化率之和为0.43%，占AFM1总转化率的81%，暗示了AFB1转化为AFM1主要在AFB1饲喂后的开始时间，即24 h内。Battacone等[8，12]报道AFB1转化为AFM1的总转化率为0.032%~0.170%，Helferich等[15]报道AFB1转化为AFM1的总转化率为0.18%～0.38%，Nageswara等[16]报道AFB1转化为AFM1的总转化率为0.40%，而本试验结果表明，AFB1转化为AFM1的总转化率为0.53%，均高于上述研究结果，可能是AFB1的饲喂量、不同的饲粮及奶山羊产奶量不同所致。
4 结 论① 饲喂AFB1前，羊乳中未检出AFM1，但是饲喂AFB1后4～8 h，羊乳中AFM1含量达到峰值，在峰值之后AFM1含量减少比较快。
② 各时间点AFB1转化为AFM1的最大平均转化率为0.19%，出现在4 h；饲喂AFB1后24 h内的AFM1平均转化率之和占AFM1总转化率的81%。
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