沙柳(Salix psammophila)别名北沙柳，属杨柳科，是草原地带典型的沙生中旱落叶灌木[1]，是我国北方沙漠地区重要的树种。沙柳枝叶中含有丰富的营养物质，是极具开发潜力的非常规粗料资源。但是由于沙柳的适口性较差，牛羊很少采食。如果将沙柳通过发酵处理，使其转变为能够被反刍动物利用的新型饲料，对缓解我国饲料资源短缺，促进畜牧业的可持续发展有着十分重要的意义。但目前国内外对沙柳的研究只停留在营养成分的测定[2, 3, 4, 5]上，而对沙柳进行发酵处理后的研究主要来自本课题组的报道[6]。目前，沙柳混合发酵饲料在对绵羊瘤胃微生物体外发酵方面的研究尚未见报道，开展这方面的应用研究工作十分重要。因此，本试验利用体外产气法研究不同发酵时间的沙柳混合发酵饲料对绵羊瘤胃发酵参数的影响，为今后开展沙柳发酵饲料在反刍动物营养研究中提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料发酵原料由沙柳、玉米粉、糖蜜、土豆渣、混合草、预混料、石粉和食盐组成。
复合菌剂由内蒙古自治区奥德威生物技术有限责任公司提供，由枯草芽孢杆菌、乳酸菌、细菌生长促进剂及载体等多种成分组成，活菌数≥5×107 CFU/g。
1.2 沙柳混合发酵饲料的制备将新鲜收割的沙柳用揉丝机揉成丝段，根据沙柳的不同添加量分为2组，分别用FF1和FF2表示。将复合菌剂用水活化后均匀喷洒到混合好的原料中，使各组初始活菌数量达到1×105 CFU/g。然后以每袋500 g装入聚乙烯真空袋中，含水量为55%，用真空封口机抽真空并封口，室温(白天15～24 ℃，夜间-2～13 ℃)下避光存放。发酵饲料组成及营养水平见表1。
 | 表1 沙柳混合发酵饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of Salix mixed fermented feed (DM basis) |
FF1组和FF2组分别在发酵的1、3、5、7、10、12、15、22、30、45和60 d时开封，每个取样时间设置3个重复，经65 ℃烘干制成风干样后，粉碎过40目筛用于人工瘤胃发酵试验。分别在体外培养3、6、9、12、24、48、72和96 h时记录产气量。此外，在培养24 h时测定培养液的pH以及氨态氮、挥发性脂肪酸和微生物蛋白的浓度。
1.4 试验方法 1.4.1 体外发酵装置与培养液配制人工瘤胃装置主体为恒温水浴摇床，水浴温度和振荡频率可调；用玻璃注射器(可计量容积为100 mL)作为发酵培养管，顶端安装可打开和关闭的塑料三通阀，改变三通阀的开关位置，可以排放气体和释放压力。人工瘤胃培养液参照Menke等[8]的方法配制。
1.4.2 瘤胃液供体动物及其饲养选取4只体重[(40±1) kg]相近且安装永久性瘤胃瘘管的内蒙古半细毛成年羯羊，用于瘤胃内容物的采集。基础饲粮由精料和粗料青干草组成，精粗比30 ∶ 70，自由饮水，单笼饲养。
1.4.3 瘤胃液的采集与体外培养晨饲前2 h通过瘤胃瘘管采集瘤胃内容物，混合后装入保温瓶内，迅速带回实验室，在缓慢通入CO2条件下，用4层纱布过滤收集瘤胃液，滤液收集到预热达39 ℃并通有CO2的烧杯中。
准确称取饲料样品0.200 0 g，置于玻璃注射器的前端。每个样品称取3个平行样，每批培养有3个空白(没有饲料样品)。称完所有的样品后，用凡士林涂抹注射器芯杆，用来减少摩擦和防止漏气。通过塑料三通阀将30 mL培养液(瘤胃液与人工瘤胃培养液的混合物，体积比为1 ∶ 2)分装到注射器中，将气泡推出，关闭三通阀门。记录初始刻度后，把注射器放入39 ℃的恒温水浴摇床中培养。
1.5 检测指标及测定方法 1.5.1 产气量培养3、6、9、12、24、48、72和96 h时，通过注射器上的刻度记录产气量。
根据Ørskov等[9]的产气模型公式将各种样品在3、6、9、12、24、48、72和96 h时的产气量代入下列公式计算出各部分产气量：
GP=a+b(l-exp-ct)。
式中：GP是在t时间的产气量(mL)；a为快速降解部分产气量(mL/g)；b为慢速降解部分产气量(mL/g)；c为产气速率(%/h)。快速降解部分产气量+慢速降解部分产气量为潜在产气量(mL/g)。
1.5.2 可消化有机物和代谢能根据样品体外培养24 h后得到的产气量计算可消化有机物含量[10]，计算公式如下：
DOM=7.65(±0.062)×GP24 h+353(±0.59)。
式中:DOM为可消化有机物(g/kg)；GP24 h为24 h累积产气量(mL)。
代谢能根据下列公式[6]计算：
DO=17.04+1.108 5×GP24 h；
ME=-0.20+0.141 0×DO。
式中：DO为有机物消化率(%)；ME为代谢能(MJ/kg)。
1.5.3 pH采用PHS-3C精密pH计(上海雷磁)于采样后立即测定pH。
1.5.4 氨态氮参照冯宗慈等[11]的方法测定氨态氮浓度。
1.5.5 微生物蛋白采用考马斯亮蓝比色法[12]测定微生物蛋白浓度。
1.5.6 挥发性脂肪酸挥发性脂肪酸浓度采用日本岛津GC-2014气相测谱仪进行测定，包括乙酸、丙酸和丁酸，内标物为巴豆酸。色谱条件：色谱柱为2 m不锈钢填充柱，内填10%硝基对苯二甲酸改性的聚乙二醇(FFAP)+1%磷酸涂于chromosorb GAW DMCS 60-80目担体上；汽化室温度为230 ℃，检测器温度为240 ℃，柱箱温度为150 ℃，载气为氮气，25 mL/min，检测器为氢火焰离子化检测器(FID)。
1.6 数据处理与分析数据统计方式利用Excel软件处理基础数据并制作图表，用SAS 9.1.3软件中的GLM过程进行方差分析，多重比较采用Duncan氏法。
2 结果与分析 2.1 发酵时间对沙柳混合发酵饲料体外培养产气量的影响由表2和表3可知，发酵时间和组别及二者交互作用对96 h累积产气量、可消化有机物含量和代谢能的影响均显著(P<0.05)。随着培养时间的延长，各组产气量逐渐上升，其中发酵初期增长速度较快。随着饲料发酵时间的延长，2组沙柳混合发酵饲料96 h累积产气量、可消化有机物含量和代谢能均呈现先下降后升高的趋势，FF1组和FF2组均在发酵的5 d达到最低值，之后又缓慢上升，60 d与1 d差异不显著(P>0.05)。
| 表2 发酵时间对体外培养96 h产气量动态变化的影响 Table 2 Effects of fermentation time on the dynamic change of GP in 96 h of in vitro culture |
| 表3 发酵时间对体外培养96 h累积产气量、可消化有机物含量和代谢能的影响 Table 3 Effects of fermentation time on accumulation of GP in 96 h,digestible organic matter content and metabolizable energy of in vitro culture |
由表4可知，发酵时间、组别对快速降解部分产气量、慢速降解部分产气量、潜在产气量和产气速率均有显著影响(P<0.05)，二者交互作用对除产气速率外的3个指标均有显著影响(P<0.05)。FF1组和FF2组慢速降解部分产气量和潜在产气量随着发酵时间的延长呈现先下降后升高的趋势；60 d与1 d相比，FF1组差异不显著(P>0.05)FF2组60 d显著低于1 d(P<0.05)。
| 表4 发酵时间对体外培养各组分产气量的影响 Table 4 Effects of fermentation time on GP of each component of in vitro culture |
由表5可知，发酵时间对培养液pH、氨态氮和微生物蛋白浓度均有显著影响(P<0.05)，组别及二者交互作用对培养液氨态氮和微生物蛋白浓度均有显著影响(P<0.05)。随着饲料发酵时间的延长，培养液pH、氨态氮浓度逐渐下降，微生物蛋白浓度逐渐上升；FF1组和FF2组的氨态氮浓度分别 在发酵的45和30 d后保持相对稳定(P>0.05)，微生物蛋白浓度在45 d后保持相对稳定(P>0.05)。60 d FF1组和FF2组的氨态氮和微生物蛋白浓度分别为7.55 和8.37 mg/dL、0.36和0.31 mg/dL，与1 d相比，FF1组和FF2组的氨态氮浓度分别降低了52.12%和52.25%，微生物蛋白浓度分别提高了176.92%和158.33%。
| 表5 发酵时间对体外培养24 h的pH、氨态氮和微生物蛋白浓度的影响 Table 5 Effects of fermentation time on pH,concentrations of ammonia nitrogen and microbial protein in 24 h of in vitro culture |
由表6可知，发酵时间、组别对各挥发性脂肪酸、总挥发性脂肪酸浓度及乙酸/丙酸均有显著影响(P<0.05)，二者交互作用仅显著影响了丙酸浓度和乙酸/丙酸(P<0.05)。随着饲料发酵时间的延长，培养液的乙酸和丙酸浓度逐渐上升，60 d FF1组和FF2组的乙酸和丙酸浓度分别为13.54和13.39 mmol/L、13.05和12.35 mmol/L，与1 d 相比，分别提高了44.66%和43.52%、114.29%和111.84%。随着发酵时间的延长，培养液丁酸浓度逐渐下降，60 d与1 d相比，FF1组和FF2组下降了32.56%和17.62%。随着发酵时间的延长，乙酸/丙酸逐渐下降，FF1组和FF2组发酵饲料分别从1.53和1.60下降到1.04和1.09。随着发酵时间的延长，总挥发性脂肪酸浓度逐渐上升。
| 表6 发酵时间对体外培养24 h的挥发性脂肪酸浓度的影响 Table 6 Effects of fermentation time on concentrations of volatile fatty acids in 24 h of in vitro culture |
饲料体外发酵产气的底物主要是碳水化合物，一定时间内的产气量反映了底物被瘤胃微生物利用的程度，表现瘤胃中微生物活动的总体趋势，反映饲料营养价值的高低程度[13, 14]。产气量的大小反映了饲料的可消化性的大小，与饲料中有机物的降解程度呈正比[13]。程鹏辉等[15]的研究表明饲草品质越好，产气量越大。但由于体外产气法发酵容器内容物不能外移，造成发酵终产物积累，使得瘤胃微生物的生存环境发生改变，从而影响结果的稳定性和准确性[14]。本试验中，随着饲料发酵时间的延长，沙柳混合发酵饲料96 h累积产气量呈现先下降后升高的趋势，这是因为在发酵初期，饲料中易消化物质被复合菌自身繁殖所利用，其消耗的大于分解的，因而出现产气量下降；之后，随着发酵时间的延长，饲料可溶性部分含量增加，大分子物质被分解为小分子物质，从而提高了瘤胃微生物对沙柳混合发酵饲料的分解速度。可消化有机物和代谢能与24 h产气量成正比关系，因而，这2个指标也是呈现先下降后升高的趋势。
3.2 发酵时间对培养液pH、氨态氮和微生物蛋白浓度的影响瘤胃液pH是反映瘤胃内部环境与发酵水平的一项综合指标，它受饲粮类型、唾液分泌、瘤胃代谢产物的吸收与外排等诸多因素的影响[16]。瘤胃液pH的正常变化范围为5.5～7.5，当pH低于下限时，瘤胃内的微生物活力降低、数量减少甚至消失，对机体生理机能有很大的影响[17]。本试验中，各组的培养液pH均在适宜范围内，表明发酵时间不会影响瘤胃微生物生长繁殖。培养液pH随着饲料发酵时间的延长而显著下降，说明沙柳混合发酵饲料经过发酵可以促进瘤胃微生物对饲料中碳水化合物成分消化，从而产生更多的挥发性脂肪酸使培养液pH逐渐下降。
瘤胃液中氨态氮是瘤胃微生物分解含氮物质的终产物，同时也是瘤胃微生物合成微生物蛋白的主要原料[18]。氨态氮浓度是衡量瘤胃氮代谢的一个重要指标，能够间接反映出瘤胃微生物利用氨态氮合成微生物蛋白和微生物分解饲料蛋白生成氨态氮的平衡情况[19]。瘤胃液中氨态氮浓度过高或过低都不利于微生物的生长繁殖，因此保持瘤胃液中最适氨态氮浓度是保证微生物蛋白合成的首要条件。研究表明，瘤胃液氨态氮浓度最佳范围为6.3～27.3 mg/dL[20]。本试验中，各组的氨态氮浓度均处于最佳浓度范围，且培养液氨态氮浓度随着饲料发酵时间的延长而下降，说明沙柳混合发酵饲料经过发酵可以促进瘤胃微生物的生长，提高了瘤胃微生物对氨态氮的利用，使其更多地转化为微生物蛋白，从而提高蛋白质的利用效率。
微生物蛋白是反刍动物最主要的氮源供应者，能为反刍动物提供蛋白质需要的40%～80%[21]。微生物蛋白浓度的大小反映了瘤胃微生物利用氨态氮的能力，微生物蛋白浓度也间接地反映了培养体系中微生物种群的数量[13]。当瘤胃中氨和能量不同步释放，可导致可发酵底物利用率下降和微生物蛋白合成量减少[22]。本试验中，各组的微生物蛋白浓度随着饲料发酵时间的延长而上升，说明沙柳混合发酵饲料经过发酵提高了能量、碳架和氮源释放的同步性，提高了瘤胃真菌利用氨态氮合成微生物蛋白的能力，或提高了瘤胃真菌的数量[23]。这一结果与氨态氮浓度降低的趋势相一致。
3.3 发酵时间对培养液挥发性脂肪酸浓度的影响挥发性脂肪酸是反刍动物能量的主要来源，可为反刍动物提供总能量需要量的70%～80%，也是瘤胃微生物增殖的主要碳架来源[24]。挥发性脂肪酸浓度的高低不仅说明了碳水化合物在瘤胃中消化率的高低[25]，同时，其含量及组成比例是反映瘤胃消化代谢活动的重要指标之一。乙酸、丙酸和丁酸约占总挥发性脂肪酸产量的95%左右，并且对能量转化效率的影响较大[26]。乙酸是反刍动物乳脂合成的主要前体，丙酸则是反刍动物重要的葡萄糖前体[27]，因此丙酸型发酵能为机体提供生长和生产所需的能量[28]，从而可以进一步提高动物的生产水平和饲料利用率。本试验中，随着饲料发酵时间的延长降低了乙酸/丙酸的比例，从而提高了瘤胃发酵的能量利用效率[24]。而且总挥发性脂肪酸浓度随着饲料发酵时间的延长而显著上升，说明沙柳混合发酵饲料经过发酵可以提高瘤胃微生物的活性。
4 结 论① 在体外培养条件下，按沙柳添加量36.44%和67.08%调制的2种发酵饲料可以有效地促进瘤胃微生物发酵，提高瘤胃发酵的能量利用效率，增加了微生物蛋白在瘤胃内的合成。因此，沙柳通过发酵处理可以成为一种新型发酵饲料。
② 综合各项指标，沙柳添加量为36.44%时优于为67.08%时。
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