当动物机体受到内源或外源的刺激时，大量活性氧自由基(reactions oxygen species，ROS)、活性氮(reactive nitrogen species，RNS)在体内积聚，造成细胞氧化损伤，即产生氧化应激^{[1, 2]}。早期断奶仔猪由于受到来自营养、免疫、环境和心理等方面的应激，易出现采食量下降、饲料利用率降低、生长缓慢和抗病力减弱等为特征的“仔猪早期断奶综合征”，给养猪场带来经济损失。乳铁蛋白(lactoferrin，LF)是一种天然的铁结合性糖蛋白。它不仅参与铁的转运，而且具有调节免疫、保护动物消化道、促进铁的吸收等功能，是新生动物必需的营养调节物质^{[3, 4]}。滇撒配套系猪是我国第1个具有地方猪血缘的配套系品种，具有产仔数高、抗病力强、肉质优良等特点^{[5, 6]}，是极具开发潜力的地方猪种遗传资源。Comstock等^[7]研究表明，饲喂新生仔猪含367或1 300 mg/kg牛LF的饲料代替初乳，发现其显著提高了血清免疫球蛋白(Ig)G、IgA和脾细胞白细胞介素(IL)-10等免疫参数水平。Okazaki等^[8]研究发现，牛LF能改善氮三乙酸根合铁络合物(Fe-NTA)诱导的肾小管氧化损伤。目前国内外对LF的研究主要集中于人和动物在营养、免疫和抗癌等相关方向，LF对断奶仔猪抗氧化保护的研究鲜见报道。谷氧还蛋白(glutaredoxin，GRX)和硫氧还蛋白(thioredoxin，TRX)是机体内有别于超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶的抗氧化系统，主要通过介导巯基(-SH)和二硫键(-S-S-)的转换，完成机体内氧化还原反应，实现调控。探究GRX和TRX 2个抗氧化系统在断奶仔猪抗氧化上的作用具有重要意义。因此，本试验通过在滇撒配套系仔猪饲粮中添加不同水平的LF，研究其对滇撒配套系仔猪生长性能和抗氧化能力的影响，探讨LF在滇撒配套系仔猪上的抗氧化效果，为提高滇撒配套系仔猪抗氧化能力提供科学依据。

选用(28±2)日龄[平均体重为(6.71±0.59) kg]滇撒配套系断奶仔猪192头作为试验动物，随机分为4个处理，每个处理6个重复，每个重复8头，对照组饲喂基础饲粮，参照NRC(2012)猪营养需要量配制基础饲粮，其组成及营养水平见表1。LF1、LF2和LF3 3个试验组分别饲喂在基础饲粮中添加125、250和500 mg/kg LF的试验饲粮。试验期42 d，仔猪自由饮水，按猪场常规程序消毒、免疫，仔猪的环境条件、饲粮和饲养管理皆逐步过渡，尽量减少应激反应。LF来源：进口LF(荷兰DMV公司)，以乳牛初乳为原料，利用超滤法从牛乳中分离纯化LF，纯度为95%。

表 1

Table 1

表 1(Table 1)

表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % 项目 Items 含量 Content 原料 Ingredients 膨化玉米 Extruded corn 56.90 膨化大豆 Extruded soybean 20.00 大豆粕 Soybean meal 12.00 乳清粉 Dried milk whey 2.00 小麦麸 Wheat bran 5.00 L-赖氨酸盐酸盐 L-Lys·HCl 0.10 预混料 Premix1) 4.00 合计 Total 100.00 营养水平 Nutrient levels2) 消化能 DE/(MJ/kg) 14.76 粗蛋白质 CP 18.30 赖氨酸 Lys 1.31 蛋氨酸 Met 0.62 苏氨酸 Thr 0.70 色氨酸 Trp 0.21 异亮氨酸 Ile 0.69 钙 Ca 0.84 总磷 TP 0.55 有效磷 AP 0.34 1)预混料为每千克饲粮提供The premix provided the following per kg of diets：VA 18 000 IU，VD3 3 400 IU，VE 32 mg，VK 4 mg，生物素 biotin 0.32 mg，叶酸 folic acid 1.6 mg，VC 304 mg，胆碱 choline 0.5 mg，Cu (as copper sulfate) 7 mg，Fe (as ferrous sulfate) 102 mg，Zn (as zinc sulfate) 103.5 mg，Mn (as manganese sulfate) 6.36 mg，I (as potassium iodide) 0.144 mg，Co (as cobalt sulfate) 0.32 mg，Se (as sodium selenite) 0.32 mg。 2)消化能为计算值，其余均为实测值。DE was a calculated value,while the others were measured values.

表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

RNAsimple Total RNA Kit(北京天根生化科技有限公司)；PrimeScript^® RT Master Mix (Perfect Real Time)反转录试剂盒(日本TaKaRa公司)；SsoFast^TM EvaGreen^® Supermix(美国Bio-Rad公司)。

iCyclerr iQ^TM Real-Time PCR Detection System(美国Bio-Rad公司)；CFX96^TM Real-Time PCR Detection System(美国Bio-Rad公司)。

测定试验开始和结束时的试验猪空腹体重，计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)和腹泻率。

第42天08:00，所有试验猪空腹称重后，使用普通血清管于前腔静脉采血10 mL，垂直放于37 ℃水浴锅中，待血液凝固后取出，冷藏至析出血清，3 000 r/min离心10 min，分离制备血清，保存于-20 ℃冰箱中。 采血后立即屠宰，每组每个重复屠宰1头，共24头仔猪，宰后迅速收集心脏和肝脏于5 mL冻存管内，放入液氮迅冻，于-80 ℃保存。

采用硫代巴比妥酸(thibabituric acid，TBA)法 测定血清中丙二醛(MDA)含量，采用比色法测定 血清中总超氧化物歧化酶(T-SOD)、GSH-Px活力和总抗氧化能力(T-AOC)。以上指标均使用南京建成生物工程研究所生产试剂盒进行检测，并严格按照说明书操作方法测定。

参照NCBI普通猪的GRX1、TRX1、SOD和GSH-Px基因序列，并用NCBI数据库中的Primer-Blast工具确认引物的特异性，利用Primer 5.0软件设计进行引物设计，由上海生工生物工程股份有限公司合成引物。选用在猪机体内稳定表达的β肌动蛋白(β-actin)基因作为内参基因。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)引物信息见表2。

表 2

Table 2

表 2(Table 2)

表 2 实时荧光定量PCR引物信息 Table 2 Information of primers used for RT-qPCR 基因 Genes 引物序列 Primer sequences (5′—3′) 引物长度 Primer length/nt 扩增长度 Amplification length/bp GenBank登录号 GenBank accession No. 超氧化物歧化酶 SOD 上游：CAGGTCCTCACTTCAATC 下游：CAAACGACTTCCAGCAT 18 17 254 NM_001190422.1 谷胱甘肽过氧化物酶 GSH-Px 上游：AGAAGTGTGAGGTGAATGGC 下游：CCCGAGAGTAGCACTGTAAC 20 20 325 NM_214201.1 谷氧还蛋白1 GRX1 上游：TTTTCATCAAGCCCACC 下游：CCACCTATACACTCTTTACCG 17 21 196 NM_214233.1 硫氧还蛋白1 TRX1 上游：CAAGCCTTTCTTCCATTC 下游：ACCCACCTTCTGTCCCT 18 17 148 NM_214313.2 β肌动蛋白 β-actin 上游：TCTGGCACCACACCTTCT 下游：TGATCTGGGTCATCTTCTCAC 18 21 114 NM_214313.2

表 2 实时荧光定量PCR引物信息 Table 2 Information of primers used for RT-qPCR

按照RNAsimple Total RNA Kit试剂盒说明书提取滇撒配套系仔猪心脏和肝脏总RNA，将提取的所有总RNA进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测其完整性，结果如图1所示，28S、18S条带清晰，无DNA污染条带，无明显降解条带。吸取总RNA样品1 μL，加入99 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水，分别测OD_260nm、OD_{280 nm}，OD_260nm/OD_{280 nm}在1.8~2.0间的RNA样品可用。参照PrimeScript^® RT Master Mix (Perfect Real Time)反转录试剂盒说明书将提取的总RNA进行反转录，合成cDNA的第1条链，-20 ℃冰箱保存。

图 1(Figure 1)

Fig. 1

图 1 总RNA提取电泳图 Fig. 1 Agarose gel electrophoresis result of total RNA extraction

以合成的cDNA第1条链为模板，由GRX1、TRX1、SOD、GSH-Px和β-actin基因的特异性引物进行RT-qPCR扩增。采用Eva Green Ⅰ染料法，按照预先筛选好的RT-qPCR反应条件和体系在美国Bio-Rad公司的CFX96^TM Real-Time PCR Detection System仪器上进行。每次反应都设置标准品、未知样品(重复3次)和1个阴性对照。结果通过Bio-Rad CFX96TM软件分析制作标准曲线，根据标准曲线和熔解曲线的循环阈值(Ct)计算定量结果。反应体系为20 μL：SsoFast^TM EvaGreen^® Supermix 10L，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA模板2 μL，加灭菌去离子水至20 μL。经过优化，最后确定实施试验的反应条件为：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，59 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，40个循环。

所有组织的GRX1、TRX1、SOD和GSH-Px基因表达量均以β-actin为内参基因，最终以相对表达量来表示，相对荧光定量计算方法采用Pfaffl^[9]方法。所有数据均先用Excel进行初步整理，后采用SPSS 17.0统计软件进行统计处理，结果用平均值±标准差表示，采用Duncan氏法进行多重比较。P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著。

由表3可知，4组所选滇撒配套系断奶仔猪在初重上没有显著性差异(P＞0.05)，42 d试验期结束后，LF2组仔猪末重显著高于对照组和LF1组(P＜0.05)，LF3组显著高于对照组(P＜0.05)。与对照组相比，LF2和LF3组仔猪的ADG和ADFI显著升高(P＜0.05)，且LF2组仔猪ADG和ADFI均高于LF1组(P＜0.05)，LF2组的ADFI也显著高于LF3组(P＜0.05)。LF2组仔猪料重比和腹泻率均显著低于LF1、LF3组和对照组(P＜0.05)，且LF1组仔猪料重比显著低于对照组(P＜0.05)；而在仔猪腹泻率上，LF3组显著低于对照组(P＜0.05)。

表 3

Table 3

表 3(Table 3)

表 3 不同水平乳铁蛋白对滇撒配套系仔猪生产性能的影响 Table 3 Effects of different levels of lactoferrin on growth performance of Diansa piglets 项目 Items 对照组 Control group LF1组 LF1 group LF2组 LF2 group LF3组 LF3 group 初重 Initial weight/kg 6.56±0.71 6.81±0.52 6.73±0.49 6.76±0.65 末重 Final weight/kg 20.10±0.84 c 21.22±0.58 bc 22.76±0.97 a 21.45±1.05 ab 平均日增重 ADG/g 322.38±15.27 c 343.09±25.41 bc 381.67±18.62 a 350.00±14.29 ab 平均日采食量 ADFI/g 577.06±16.42 c 600.41±20.31 bc 681.31±18.86 a 619.50±24.17 b 料重比 F/G 1.79±0.04 c 1.75±0.06 b 1.62±0.03 a 1.77±0.05 bc 腹泻率 Dairrhea rate/% 6.92±0.97 c 6.06±0.65 c 2.98±0.82 a 4.97±0.59 b 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著( P＜0.05)，不同大写字母表示差异极显著( P＜0.01)，相同或无字母表示差异不显著( P＞0.05)。下表同。 In the same row,values with different small letter superscripts mean significant difference ( P＜0.05),and with different capital letter supercripts mean extremely significant difference ( P＜0.01),while with the same or no letter superscripts mean no significant difference ( P＞0.05). The same as below.

表 3 不同水平乳铁蛋白对滇撒配套系仔猪生产性能的影响 Table 3 Effects of different levels of lactoferrin on growth performance of Diansa piglets

由表4可知，血清中，与对照组相比，LF1(P＜0.05)、LF2(P＜0.01)和LF3组(P＜0.05)T-SOD活力均显著或极显著提高；LF2组GSH-Px活力及T-AOC均显著提高(P＜0.05)；LF2和LF3组的MDA含量均显著降低(P＜0.05)。

与对照组相比，LF1和LF2组GRX1基因在心脏和肝脏表达量均有升高，其中LF2组在肝脏中的表达量极显著上调(P＜0.01)；而LF3组GRX1基因在心脏(P＜0.01)和肝脏中(P>0.05)的表达量均降低(图2-A)。与对照组相比，心脏和肝脏TRX1基因表达量在LF1组中升高，LF2和LF3组下降，其中LF1组在肝脏中及LF3组在心脏中差异极显著(P＜0.01)(图2-B)。与对照组相比，LF1和LF2组SOD和GSH-Px基因在2个组织中表达量均增加，其中LF1组肝脏GSH-Px差异显著(P＜0.05)，LF2组肝脏这2个基因表达量差异极显著(P＜0.01)；LF3组心脏SOD(P＜0.01)和GSH-Px基因表达量(P>0.05)下调，肝脏SOD和GSH-Px基因表达量(P>0.05)上调(图2-C、图2-D)。

表 4

Table 4

表 4(Table 4)

表 4 不同水平乳铁蛋白对滇撒配套系仔猪血清抗氧化指标的影响 Table 4 Effects of different levels of lactoferrin on serum antioxidant indexes of Diansa piglets 项目 Items 对照组 Control group LF1组 LF1 group LF2组 LF2 group LF3组 LF3 group 总超氧化物歧化酶 T-SOD/(U/mL) 166.50±9.34 Bc 208.13±13.04 ABb 299.70±13.65 Aa 222.00±10.25 ABb 谷胱甘肽过氧化物酶 GSH-Px/(U/mL) 245.04±10.66 b 256.54±10.02 b 315.77±11.39 a 260.42±11.53 b 总抗氧化能力 T-AOC/(U/mL) 1.70±0.21 b 1.89±0.29 ab 2.60±0.36 a 2.34±0.35 ab 丙二醛 MDA/(nmol/mL) 5.41±0.80 a 4.20±0.64 ab 3.28±0.57 bc 3.89±0.63 bc

表 4 不同水平乳铁蛋白对滇撒配套系仔猪血清抗氧化指标的影响 Table 4 Effects of different levels of lactoferrin on serum antioxidant indexes of Diansa piglets

图 2(Figure 2)

Fig. 2

相同组织不同组之间,数据柱形标注不同的小写字母表示差异显著(P< 0.05),不同大写字母表示差异极显著(P< 0.01);相同组不同组织之间,数据柱形标注*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01)。下图同。 　　 For different groups in the same tissue,value columns with different small letters mean significant difference (P<0.05),and with different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01).For different tissues in the same group,value col-umns with mean significant difference (P<0.05),and with ** mean extremely significant difference (P<0.01).The same as below. 图 2 不同水平乳铁蛋白对滇撒配套系仔猪心脏和肝脏GRX1、TRX1、SOD和GSH-Px基因表达量的影响 Fig. 2 Effects of different levelsof lactoferrin on expression levels of GRX1,TRX1,SOD and GSH-Px genes in heart and liver of Diansa piglets

在肝脏中，LF1和对照组GSH-Px基因表达量最高，其次为SOD、TRX1和GRX1基因，而LF2和LF3组则为TRX1基因表达量最低。其中，LF1组GSH-Px和SOD基因表达量极显著高于GRX1和TRX1基因(P＜0.01)，且GSH-Px基因表达量高于SOD基因(P＜0.05)；LF2组GSH-Px和SOD基因表达量极显著高于GRX1和TRX1基因(P＜0.01)；LF3组同LF2组；对照组同LF1组(图3-A)。

在心脏中，LF1、LF3和对照组的GSH-Px基因表达量最高，其次为SOD、TRX1基因，GRX1基因表达量最低，而LF2组的TRX1基因表达量最低。其中LF1组GSH-Px和SOD基因表达量极显著高于GRX1和TRX1基因(P＜0.01)；LF2组GSH-Px基因表达量显著高于TRX1基因(P＜0.05)；LF3组GSH-Px和SOD基因表达量极显著高于GRX1基因(P＜0.01)，GSH-Px基因表达量显著高于TRX1基因(P＜0.05)；对照组GSH-Px基因表达量极显著高于GRX1基因(P＜0.01)，显著高于TRX1基因(P＜0.05)，SOD基因表达量显著高于GRX1基因(P＜0.05)(图3-B)。

图 3(Figure 3)

Fig. 3

图 3 GRX1、TRX1、SOD和GSH-Px基因在滇撒配套系仔猪相同组织(肝脏/心脏)中的表达差异 Fig. 3 Differences of expression levels of GRX1,TRX1,SOD and GSH-Px genes in the same tissue (liver/heart) of Diansa piglets

Wang等^[10]在断奶仔猪(杜洛克×长白×约克夏)饲粮中添加1.0 g/kg的LF，30 d后发现，饲喂LF的仔猪ADG和ADFI分别比对照组极显著和显著提高34.0%和17.0%，料重比和腹泻率分别显著降低12.8%和66.2%，李美君等^[11]和伍喜林^[12]在断奶仔猪饲粮中添加LF，也得到类似的结果。这些试验均与本试验结果一致。以上试验均证实，LF可通过免疫调节、促铁离子吸收等途径改善肠黏膜形态，刺激肠道细胞生长，使肠绒毛长度增长，表面积增大；同时抑制肠道需铁有害菌的生长，增加益生菌数量，保护肠道功能，从而降低断奶仔猪腹泻率，提高断奶仔猪的生长性能^{[10, 11]}。本试验在滇撒配套系断奶仔猪饲粮中添加125、250和500 mg/kg的LF，结果发现，3组均能在不同程度上够改善断奶仔猪的生长性能，而其中以250 mg/kg添加组得到的效果最佳。

李婷等^[13]研究表明，LF对脂质过氧化、羟自由基和二苯基苦酰肼基自由基(DPPH)这3种自由基有明显的清除作用。Kruzel等^[14]也发现LF可以减轻脂多糖(LPS)诱导的线粒体功能障碍，减少氧化应激和氧化所致的DNA损伤。张凯^[15]在早期断奶仔猪饲粮中添加LF，500和700 mg/kg添加组与对照组相比，血清中MDA含量显著降低，T-SOD和GSH-Px活力显著增加。本试验在断奶仔猪饲粮中添加不同水平的LF，检测血清中抗氧化指标，发现当添加量为125 mg/kg时，T-SOD、GSH-Px活力和T-AOC升高，MDA含量下降，当添加水平提高到250 mg/kg时，作用效果达到最大，但继续增加LF(添加量500 mg/kg)，T-SOD、GSH-Px活力和T-AOC下降，MDA含量增加。推测可能是由于LF添加超过最适水平后，自由基被大量清除，抗氧化酶活力也随之降低，也可能是LF的过量添加抑制了抗氧化酶活力。罗芳^[16]提取牛初乳中的LF，体外测定LF的T-AOC及羟基自由基和超氧自由基的清除率，发现在LF水平在2~6 mg/mL范围时，T-AOC及羟基自由基和超氧自由基的清除率随LF水平增大而增大，而当水平在6~10 mg/mL范围内时，变化就不太明显。这与本试验结果一致。另有研究表明，LF对Fe³⁺、Cu²⁺、Co³⁺、Mn²⁺等分子大小相近的金属都有结合作用^{[15, 17, 18]}，促进微量金属元素在肠道的吸收，而这些微量元素作为T-SOD和GSH-Px等抗氧化酶的重要辅酶、辅基或酶激活剂，可以显著提高抗氧化酶活力。因此LF可以降低脂质氧化和氧自由基的产生，提高机体的抗氧化能力，维持机体健康生长。

GRX和TRX分别是GRX酶系统和TRX酶系统的重要成员，通过调控巯基和二硫键之间的转换来改变细胞内的氧化还原状态，使蛋白质巯基免受氧化损伤，从而实现对蛋白质功能的调控^{[19, 20]}。此外GRX还能特异地修复某些蛋白质和酶，如肌动蛋白(actin)、酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)等的生物学活力来发挥抗氧化作用。本试验通过在滇撒配套系仔猪饲料中添加不同水平的LF，发现当添加量为125 mg/kg时，TRX1基因在心脏和肝脏中的表达量达到最高，继续添加，其表达量降低。添加量为250 mg/kg时，GRX1基因表达量最高，继续添加，其表达量降低。说明TRX1基因对LF的敏感度高于GRX1基因，即TRX1基因最适的LF添加水平低于GRX1基因。Gallogly等^[21]发现，在氧化应激状态下，细胞中的GRX1基因表达量会增加，抑制GRX1基因表达时，氧化性的细胞会增加。说明在氧化应激条件下，GRX1和TRX1的基因表达量会增加。饲粮中加入一定量的LF，能进一步诱导其表达量上调。安清聪等^[22]研究报道，培养的胎儿皮肤成纤维细胞随着维生素E水平的增大，GRX1、TRX1基因表达量增高，浓度大于80 μg/mL时，其表达量呈下降趋势。维生素E与LF都能够阻断脂质过氧化的达到抗氧化作用，两者作用机理相似。试验添加适量维生素E能够诱导GRX1、TRX1基因表达，但添加量超过最适水平，其表达量会随之下调，这与本试验结果一致。

SOD和GSH-Px一起构成体内重要的抗氧化系统，保护细胞膜及细胞内的核酸免受自由基的攻击。本试验在断奶仔猪饲粮中添加不同水平的LF，检测到在肝脏中，3个添加水平(125、250和500 mg/kg)的SOD基因的表达量分别比对照组高出55.71%、79.24%和50.84%。而在心脏中，SOD基因表达量则是先升高后降低。GSH-Px基因在心脏和肝脏中的表达量变化与SOD基因类似：肝脏中，125、250和500 mg/kg 3组的GSH-Px基因表达量分别比对照组高出56.13%、74.56%和43.11%。3个试验组的这2个基因在心脏中的表达量都高于肝脏，与本试验中GRX1和TRX1基因表达结果一致。Xu等^[23]在仔猪饲料中添加牛LF，研究发现，500 mg/kg添加组能显著增加血清中铜/锌SOD(Cu/Zn-SOD)、GSH-Px活力和T-AOC及Cu/Zn-SOD和GSH-Px基因在肝脏中的表达量，降低血清MDA含量，这与本试验结果一致。当机体发生氧化应激时，自由基增加，刺激机体SOD和GSH-Px基因表达，此时外源地添加一定量的LF，能进一步增加其表达量。且在本试验中，组织SOD和GSH-Px基因表达量的上调与血清中相应酶的活性增加的结果是一致的。

综上，在滇撒配套系断奶仔猪饲粮中添加适宜水平LF，可改善仔猪的生长性能，改善血液抗氧化指标，提高仔猪抗氧化能力。

① 添加适宜LF可提高滇撒配套系断奶仔猪的ADG和ADFI，降低仔猪料重比和腹泻率，改善仔猪生产性能。综合仔猪生产性能和血液抗氧化参数结果，推荐LF适宜添加量为250 mg/kg。

② LF可改善滇撒配套系断奶仔猪血清T-SOD、GSH-Px活力，降低血清MDA含量，提高仔猪抗氧化能力。

③ LF可以提高滇撒配套系断奶仔猪心脏和肝脏中抗氧化基因GRX1、TRX1、SOD和GSH-Px基因的表达，提高仔猪抗氧化能力。