2. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193
2. Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China
与哺乳动物不同，鸡的脂肪酸合成仅有很少部分在脂肪组织中进行，鸡体内脂质代谢的最主要场所是肝脏[1]。产蛋期，蛋鸡肝脏大量合成脂肪，与载脂蛋白等结合形成极低密度脂蛋白转运到肝外组织以满足蛋黄中沉积脂质的需要，此时肝脏代谢负担沉重，极易发生脂肪肝出血综合征(fatty liver hemorrhagic syndrome,FLHS)。FLHS可造成整个鸡群产蛋率下降，而且蛋鸡一旦患此病会给蛋鸡生产造成巨大的损失[2]。然而FLHS的诱发机制还不清楚，有研究报道，FLHS发生的主要原因为肝脏脂肪来源多于脂肪输出而导致脂肪代谢平衡失调,以致大量脂肪沉积于肝细胞内[3, 4]。也有学者认为FLHS发生的主要原因为产蛋期蛋鸡代谢比较旺盛，肝脏内游离的脂肪酸比较多，易被氧化产生大量的自由基，破坏细胞的生物膜结构，导致肝细胞氧化损伤[5]。目前防止该病多采用配制营养均衡的饲粮并适当降低能量水平，与之矛盾的是降低饲粮能量水平必定会引起群体产蛋率下降，这就要求研究者们寻求其他的解决办法[6]。
苜草素是由紫花苜蓿经水提后喷雾干燥形成的植物饲料添加剂，其主要成分有苜蓿黄酮、皂苷和多糖。肝脏自由基水平升高是FLHS发生的原因之一[5]，而苜蓿多糖作为苜草素主要成分之一，体外试验证实其具有清除自由基的抗氧化作用[7]。植物黄酮类物质具有增强免疫和调节内分泌的功能[8]。Malinow等[9, 10, 11]和刘凯等[12, 13]报道，苜蓿皂苷能调节机体脂质代谢，防止高胆固醇血症的发生。饲粮中添加苜草素可促进动物生长发育，改善体内脂质代谢[14]。然而，目前还未见直接使用苜草素预防蛋鸡FLHS的研究报道。因此，本试验通过人工诱发(高能低蛋白质饲粮)FLHS的发生，研究饲粮中添加不同剂量的苜草素对蛋鸡生产性能、肝脏病变、蛋黄脂质含量的影响，旨在为预防FLHS提供新的依据和参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料苜草素是以天然植物药物提取原理，采用破壁萃取技术从干燥的紫花苜蓿中提取的一种植物 饲料添加剂，其主要有效成分为多糖(≥15%)、黄 酮(≥5%)、皂苷(≥5%)。苜草素由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提供。
1.2 试验动物和试验饲粮选取健康的体重相近(1 770.4±222.8) g的266日龄京红1号产蛋鸡50只，购自北京正大畜牧有限公司，随机等分为5组，每组5个重复，每个重复2只鸡，密闭鸡舍单笼饲养，自由采食，每天饲喂量为110 g/只，自由饮水，光照时间为16 h/d，舍内温度为18～21℃，相对湿度为50%～70%，按正常免疫程序免疫接种，试验期60 d。
Ⅰ组为对照组，饲喂基础饲粮；Ⅱ～Ⅴ组为试验组，饲喂高能低蛋白质饲粮，并分别在饲粮中添加0、200、600、1 000 mg/kg的苜草素。参照NRC(1994)蛋鸡营养需要配制基础饲粮，各组饲粮组成及营养水平见表1。
 | 表1 试验饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) |
试验期每天观察鸡只健康状况，记录环境温度、湿度，每天对每个重复鸡只的产蛋情况进行记录并且称重，每周结料1次。试验结束后根据记录计算每只鸡的平均日采食量、产蛋率、蛋重、料蛋比、产蛋量。
1.3.2 肝脏指标的测定试验30和60 d，每重复取1只蛋鸡，空腹称鸡活体重(称重前12 h禁食)，麻醉处死，开膛后立即用数码相机拍照，然后小心取出整个肝脏，用预冷的生理盐水冲洗上面血渍，用滤纸擦干并称重记录，然后取5 g肝脏组织，锡箔纸包装，液氮速冻，-20℃冻存。试验结束后根据记录计算肝脏指数、肝脏出血指数、FLHS发生率，并测定肝脂率。
1.3.2.1 肝脏指数肝脏指数(%)=(肝脏湿重/活体重)×100。
1.3.2.2 肝脏出血指数和FLHS发生率(观测)参照董晓芳等[15]试验的划分标准，将本试验肝脏出血程度划分为4级：0＝没有出血，1＝有少数出血点或斑，2＝有明显的出血区或血肿；3＝有广泛的局灶性出血区或大出血。2、3级判为FLHS鸡，1级为亚临床鸡。肝脏出血分级见图1。
 | A：未出血 nonbleeding；B：1级出血 level 1 bleeding；C：2级出血 level 2 bleeding；D：3级出血 level 3 bleeding。 图1 肝脏出血分级 Fig. 1 Liver hemorrhagic classification |
参照Folch等[16]的方法，稍作修改。测定步骤：准确称量肝脏样品(约2 g),将丁基羟基甲苯(50 μL,7.2%溶于乙醇)和30 mL Folch 1(氯仿 ∶ 甲醇=2 ∶ 1，V/V)溶液加入到50 mL的试管中，利用均浆机将肝脏样品在高速匀浆下均质化(Ultra-Turrax T10,IKA Works Inc,USA)。4℃过夜,将匀浆液过滤到100 mL量筒中，滤纸用10 mL Folch 1溶液冲洗2遍。然后向量筒中加入10 mL(滤液体积的1／4)0.88%的氯化钠(NaCl)溶液，混匀。量筒内壁用5 mL的Folch 2(氯仿 ∶ 甲醇 ∶ 水=3 ∶ 47 ∶ 48)溶液冲洗2次，室温静置5 h，液相分离后，记录脂层溶液体积，抽取上层溶液(甲醇和水)，小心移除，以免污染氯仿层。将有机层(20 mL)移入玻璃闪烁瓶中，在液氮流下50℃干燥5 h。然后计算干燥脂质的含量。
肝脂率(%)=(肝脏脂肪含量/肝脏湿重)×100。
1.3.3 蛋黄脂质含量的测定试验30 d前每周每个重复取2枚鸡蛋，将其蛋黄混合后放于自封袋中，-20℃冻存；试验30~60 d每周每个重复取1枚鸡蛋，将其蛋黄放于自封袋中，-20℃冻存。试验结束后测定14、28、42、56 d的蛋黄总脂、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)含量。
1.3.3.1 蛋黄总脂含量参照Folch等[16]的方法，稍作修改。测定步骤：准确称量蛋黄样品(约2 g),将丁基羟基甲苯(50 μL,7.2%溶于乙醇)和30 mL Folch 1(氯仿 ∶ 甲醇=2 ∶ 1，V/V)溶液加入到一个50 mL的试管中，利用均浆机将肝脏样品在高速匀浆下均质化(Ultra-Turrax T10,IKA Works Inc,USA)。4℃过夜,将匀浆液过滤到100 mL量筒中，滤纸用10 mL Folch 1溶液冲洗2遍。然后向量筒中加入10 mL(滤液体积的1／4)0.88%的NaCl溶液，混匀。量筒内壁用5 mL的Folch 2(氯仿 ∶ 甲醇 ∶ 水=3 ∶ 47 ∶ 48)溶液冲洗2次，室温静置5 h，液相分离后，记录脂层溶液体积，抽取上层溶液(甲醇和水)，小心移除，以免污染氯仿层。将有机层(20 mL)移入玻璃闪烁瓶中，在液氮流下50℃干燥5 h。然后计算干燥脂质的含量。
干燥脂质的含量(%)=(脂质的量／蛋黄的量)×100。
1.3.3.2 蛋黄甘油三酯含量前处理参照Elkin等[17]的方法,1 g蛋黄样加入15 mL Folch 1溶液，冰浴下匀浆30 s，盖上盖子，摇匀。静置30 min后重新摇晃混匀，超声波萃取后过滤，静置分层。根据甘油三酯含量测定试剂盒进行测定，试剂盒购自北京中生北控生物科技股份有限公司。
1.3.3.3 蛋黄总胆固醇含量参照Pasin等[18]的测定方法，稍作修改。称取3 g蛋黄液，加入27 mL 2%(w/V，0.32 mol/L)的NaCl溶液，在室温下摇床振荡2 h(盖上盖子，防止挥发)。然后取上述混合液1 mL，加入9 mL 2%(w/V)的NaCl溶液制备成待测样。根据总胆固醇含量测定试剂盒进行测定，试剂盒购自北京中生北控生物科技股份有限公司。
1.4 数据统计分析试验结果用“平均值±标准差”表示。采用SAS 9.2统计软件利用ANOVA进行单因素方差分析，Duncan氏法进行多重比较,以P<0.05为差异显著水平。
2 结 果 2.1 苜草素对蛋鸡生产性能的影响由表2可知，1～30 d，各组平均日采食量、产蛋率、蛋重、产蛋量差异不显著(P>0.05)，Ⅱ组料蛋比显著高于Ⅰ组、Ⅳ组(P<0.05)。31～60 d，各组产蛋率、蛋重、料蛋比、产蛋量差异不显著(P>0.05)，Ⅱ组平均日采食量显著低于Ⅰ组(P<0.05)。1～60 d，各组产蛋率、蛋重、料蛋比、产蛋量差异不显著(P>0.05)，Ⅱ组平均日采食量显著低于Ⅰ组(P<0.05)。
| 表2 常见的肠道细菌代谢产物及其免疫调节作用 Table 2 Common gut bacteria metabolites and their immunoregulatory functions(n=5) |
由表3可知，30 d，各组间的肝脏指数差异不显著(P>0.05)，Ⅱ组的肝脏出血指数显著高于Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ组(P<0.05)，Ⅱ组肝脂率显著高于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组(P<0.05)；60 d，各组间肝脏指数、肝脏出 血指数、肝脂率差异不显著(P>0.05)。30 d，各组的FLHS发生率分别为0、60%、40%、0、0；60 d，各组的FLHS发生率分别为0、40%、40%、40%、20%。
| 表3 苜草素对蛋鸡肝脏病变的影响 Table 3 Effects of polysavone on hepatic pathological changes in laying hens(n=5) |
由表4可知，14 d,各组间蛋黄重和蛋黄总脂、总胆固醇含量差异不显著(P>0.05)，Ⅱ组蛋黄甘油三酯含量显著高于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组(P<0.05)；28 d，各组间蛋黄重、蛋黄总胆固醇含量差异不显著(P>0.05)，Ⅱ组蛋黄总脂含量与Ⅰ组差异不显著(P>0.05)，Ⅴ组蛋黄总脂含量显著低于Ⅱ组(P<0.05)，Ⅱ组蛋黄甘油三酯含量与Ⅰ组差异不显著(P>0.05)，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组蛋黄甘油三酯含量显著低于Ⅱ组(P<0.05)；42 d，各组间蛋黄重和蛋黄总脂、总胆固醇含量差异不显著(P>0.05)，Ⅱ组蛋黄甘油三酯含量与Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ组差异不显著(P>0.05)，Ⅳ组蛋黄甘油三酯含量显著低于Ⅱ组(P<0.05)；56 d，各组间蛋黄重、蛋黄总胆固醇含量差异不显著(P>0.05)，Ⅱ组蛋黄总脂含量与Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组差异不显著(P>0.05)，Ⅴ组蛋黄总脂含量显著低于Ⅱ组(P<0.05)，Ⅱ组蛋黄甘油三酯含量与Ⅰ组差异不显著(P>0.05)，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组蛋黄甘油三酯含量显著低于Ⅱ组(P<0.05)。
3 讨 论 3.1 FLHS病理模型的建立利用高能低蛋白质饲粮饲喂蛋鸡能够成功诱 发蛋鸡FLHS的发生。董晓芳等[15]采用代谢能13.46 MJ/㎏、粗蛋白质13.0%的高能低蛋白质饲粮饲喂36周龄海兰灰商品蛋鸡24 d即可引发蛋鸡FLHS的发生。本试验采用代谢能12.85 MJ/kg、粗蛋白质13.97%的高能低蛋白质饲粮，饲喂蛋鸡30 d，蛋鸡表现出明显的FLHS病理特征。蛋鸡FLHS的发生与诸多因素有关，其中饲粮能量过高或蛋白质不足是其诱因之一，而诱发机制仍未清楚。目前研究表明高能低蛋白质饲粮引起FLHS有3种可能：1)产蛋期，肝脏开始大量重新合成脂肪，与载脂蛋白等结合形成极低密度脂蛋白转运到肝外组织以满足蛋黄对脂质的需要；当肝脏中脂肪合成速度大于向外转运速度时，过量的脂肪就会沉积在肝脏中，使肝脏脂肪含量升高；当蛋鸡采食高能低蛋白质饲粮后，过量的能量通过合成甘油三酯贮存在肝脏中，从而诱发病征。2)长期饮食高能低蛋白质饲粮容易造成肝脏脂肪酸β氧化出现异常，导致过量的中性脂肪贮存在肝脏中。3)产蛋期，蛋鸡代谢比较旺盛，肝脏内游离的脂肪酸比较多，易被氧化成大量的自由基，破坏细胞的生物膜结构，导致肝细胞损伤。
| 表4 苜草素对蛋鸡蛋黄脂质含量的影响 Table 4 Effects of polysavone on contents of yolk lipids in laying hens(n=5) |
张彩英等[19]研究显示，与常规饲粮组相比，采用代谢能12.81 MJ/㎏、粗蛋白质13.04%的高能低蛋白质饲粮饲喂300日龄海兰褐蛋鸡60 d，蛋鸡采食量、产蛋率显著降低，料蛋比显著升高。本研究中，与对照组相比，未加苜草素的高能低蛋白质饲粮组，1～30 d料蛋比显著升高，1～60 d平均日采食量显著降低。蛋鸡长期进食高脂饲粮可能会降低血液雌激素水平进而引发产蛋率降低。而本研究中，与对照组相比，未添加苜草素的高能低蛋白质饲粮组，蛋鸡产蛋率未明显降低，这可能与鸡只体况较好有关，还可能与蛋鸡维持繁殖机能有关，对此有待进一步研究。本研究中，1～30 d，与未添加苜草素的高能低蛋白质饲粮组相比，添加600 mg/kg苜草素的高能低蛋白质饲粮组，蛋鸡料蛋比显著降低。有研究报道，苜草素可显著降低58~65周龄蛋鸡的料蛋比[20]。苜草素的主要活性成分为多糖、黄酮、皂苷。黄酮具有弱雌激素和抗雌激素活性双向调节作用，当雌激素水平低时，黄酮与雌激素受体结合表现出雌激素作用[21]，进而提高产蛋率。另外，苜蓿皂苷能够降低动物对脂肪的消化吸收率[22]。这些有可能是苜草素改善蛋鸡饲料利用率的作用机理。
3.3 苜草素对蛋鸡肝脏病变的影响蛋鸡FLHS是由于肝脏脂肪代谢紊乱而造成肝脏脂肪堆积的营养性代谢疾病，目前其发病机制还不明确，但最基本的临床典型特征是肝脏脂肪升高并伴有出血。本研究中，与对照组相比，30 d时，未添加苜草素的高能低蛋白质饲粮组蛋鸡肝脏出血指数、肝脂率显著升高，FLHS发生率为60%；60 d时，未添加苜草素的高能低蛋白质饲粮组FLHS发生率为40%。蛋鸡长期进食高能饲粮，会导致血浆胰岛素水平升高，进而导致肝脏脂肪酸合成增加。血浆胰岛素水平升高会抑制肉碱酯酰转移酶的活性，抑制脂肪酸的β氧化，这样就会导致脂肪在肝脏中堆积而发生过氧化反应产生过多的自由基，使毛细血管通透性升高从而导致出血。这些是高能低蛋白质饲粮饲喂蛋鸡导致FLHS发生的可能机制。本研究还表明，与未添加苜草素的高能低蛋白质饲粮组相比，30 d时，添加不同剂量苜草素的高能低蛋白质饲粮组肝脂率、肝脏出血指数、FLHS发生率均出现不同程度的降低；60 d时，添加1 000 mg/kg苜草素的高能低蛋白质饲粮组FLHS发生率降低了50%。这表明苜草素能够保护肝细胞免受损伤。有研究报道，苜草素能够降低肉仔鸡血液胰岛素水平，升高血液甲状腺激素水平，降低肝脏中脂肪酸合成酶mRNA的表达量，从而降低肝脏脂肪酸合成[23]。苜蓿皂苷作为苜草素的重要成分，能够降低动物对脂肪的消化吸收，降低肝脏脂肪酸重新合成的原料乙酰辅酶A，进而导致肝脏脂肪酸合成减少[22]；苜蓿皂苷还具有抗氧化作用[22]。苜草素的另一重要成分苜蓿多糖具有清除自由基的抗氧化作用[7]。这些可能是苜草素能够降低蛋鸡FLHS的机制。而本研究中，60 d时，200、600 mg/kg苜草素对高能低蛋白质饲粮诱发产蛋高峰期蛋鸡FLHS无明显的预防作用，这可能与鸡只产蛋率降低、肝脏合成的脂肪转运到卵黄减少、肝脏脂肪沉积增多有关，也可能与苜草素作用效果减弱有关，对此有待进一步研究。
3.4 苜草素对鸡蛋蛋黄脂质含量的影响肝脏是蛋禽脂肪合成和转运的主要器官，脂肪在肝脏中合成后一部分以极低密度脂蛋白的形式沉积到卵泡中而形成蛋黄。有研究表明，患有FLHS的蛋鸡，其鸡蛋的甘油三酯、总胆固醇含量会明显升高[24]。本研究中，与对照组相比，未添加苜草素的高能低蛋白质饲粮组，14 d时，蛋黄甘油三酯含量显著升高。蛋鸡长期进食高能低蛋白质饲粮，使肝脏中堆积过多的脂肪，此时机体可能代偿性的补偿合成更多的极低密度脂蛋白来转运脂肪，最终导致蛋黄脂肪含量增多。本研究还表明，与未添加苜草素的高能低蛋白质饲粮组相比，添加不同剂量苜草素的高能低蛋白质饲粮组，14、28、56 d蛋黄甘油三酯含量显著降低。另有研究表明，在58～65周龄海兰褐蛋鸡基础饲粮中添加1 000 mg/kg苜草素后能显著降低蛋黄甘油三酯含量[25]。苜草素能够降低肝脏甘油三酯含量，从而减少肝脏中极低密度脂蛋白的组装以及运输，最终导致蛋黄甘油三酯含量降低[25]。
4 结 论30 d时，不同剂量苜草素对高能低蛋白质饲粮诱发产蛋高峰期蛋鸡FLHS均具有一定的预防作用；而60 d时，1 000 mg/kg苜草素对高能低蛋白质饲粮诱发产蛋高峰期蛋鸡FLHS发生率降低了50%。
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