近年来，为规范奶牛养殖，进行了奶牛养殖结构性的调整，其中规模化牛场得到了快速发展，散户养殖逐渐减少，我国北方具有典型代表模式有规模化牛场、养殖小区与散养户，但其养殖水平参差不齐。有资料报道，规模化牛场的平均的产奶量高于散养户两2倍多，乳品质也都好于散养殖户^[1]。本试验前期研究也发现，规模化牛场的产奶量、乳品质与生产成本均高于养殖小区与散养户。从营养角度分析3种饲养模式发现，规模化牛场饲养模式为苜蓿和玉米青贮等混合粗饲料+精饲料，养殖小区与散养户其饲养模式主要是农作物副产品+精饲料，此饲养水平如不合理搭配，很容易造成能量水平不足，产奶量低，乳品质低，奶牛疾病等问题^[2]。虽然与发达国家相比，我国优质资源缺乏，但饲料资源丰富多样，来源广泛，只是未能在生产中得到有效的利用，导致生产水平无法提高，以至于长期依赖于从国外进口大量优质饲料，增加了奶牛的饲养成本。在这种饲养水平下，生产水平及品质必然出现很大的差别。那么如何充分利用我国现有资源，并找出导致这种差异的可能原因？本试验针对我国北方3种典型饲模式设计了3种典型饲粮，采用体外产气法，研究其对瘤胃发酵特性的影响，为玉米秸秆及杂粕在反刍动物饲粮中的使用提供数据参考。

参照奶牛营养需要NRC(2001)模拟3种不同饲养模式下的奶牛饲粮：MF组(对照组)模拟规模化牛场，粗饲料来源为苜蓿和玉米青贮；CSA组模拟养殖小区，粗饲料来源为玉米秸秆，CSB组与CSA组粗饲料一致，使用杂粕(菜籽粕、棉籽粕、甜菜渣)代替豆粕与膨化大豆。试验饲粮组成及营养水平见表1。

将3种饲粮置于65℃烘干、粉碎、过40目筛后封存于自封袋备用。干物质(DM)参照GB/T 6435—1986，粗蛋白质(CP)参照GB/T 6432—1994(全自动凯氏定氮仪VELP.UDK159测定)，粗脂肪(EE)按照GB/T 6433—1994，粗灰分(ash)参照GB/T 6438—1992的方法进行测定^[2]。中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)的测定参照Van Soest等^[3]的方法进行。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and of nutrient levels of experimental diets (DM basis) % 项目 Items 组别 Groups MF CSA CSB 原料 Ingredients 苜蓿 Alfalfa hay 17.30 玉米青贮 Corn silage 18.77 玉米秸秆 Corn straw 36.07 36.06 豆粕 Soybean meal 11.29 11.29 菜籽粕 Rapeseed meal 4.19 4.19 9.63 棉籽粕 Cottonseed meal 2.13 2.13 6.70 膨化大豆 Extruded soybean 2.06 2.06 甜菜渣 Sugar beet pulp 4.16 4.16 7.49 全棉籽 Whole cottonseed 10.43 10.43 10.43 玉米 Corn 25.55 25.55 23.49 小麦麸 Wheat bran 4.48 脂肪粉 Fat powder1) 1.14 1.14 酵母培养物 Yeast culture 0.33 0.33 石粉 Limestone 0.74 0.74 0.73 食盐 NaCl 0.46 0.46 0.46 预混料 Premix2) 0.53 0.53 0.53 小苏打 NaHCO3 0.92 0.92 合计 Total 100.00 100.00 100.00 营养水平 Nutrient levels3) 泌乳净能 NEL/(MJ/kg) 1.67 1.56 1.44 干物质 DM 93.14 93.15 93.05 有机物 OM 93.03 92.21 92.09 粗蛋白质 CP 18.12 16.07 15.11 粗脂肪 EE 5.6 4.74 3.36 中性洗涤纤维 NDF 47.85 54.00 57.11 酸性洗涤纤维 ADF 25.2 29.26 32.8 非纤维性碳水化合物 NFC 21.46 17.40 16.51 钙 Ca 0.75 0.67 0.67 磷 P 0.42 0.36 0.42     1)购自德国百事美公司，主要成分棕榈油、甘油。The product was from Berg-Schmidt Co. of Germany,and main compositions were palm fat and glycerinum.     2)每千克预混料含有 One kilogram of premix contained the following：VA 2 000 000 IU,VD 600 000 IU,VE 10 800 mg,Fe 5 500 mg,Cu 4 080 mg,Mn 4 989 mg,Zn 17 500 mg,I 180 mg,Se 110 mg,Co 8 805 mg。     3)泌乳净能和非纤维性碳水化合物为计算值，非纤维性碳水化合物(%)=1-(中性洗涤纤维+粗蛋白质+粗脂肪+粗灰分)；其余为实测值。NEL and NFC were calculated values,and NFC(%)=1-(NDF+CP+EE+ash); while the others were measured values.

表1 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and of nutrient levels of experimental diets (DM basis)

3组试验饲粮均设5个重复。为矫正累积产气量，设2个空白对照。

试验按照Menke等^[4]的体外产气法，在采集瘤胃液前，称取0.5 g饲料样品置于150 mL厌氧发酵瓶中。晨饲前2 h，采集2头瘘管牛的瘤胃液混合置于预热39 ℃的保温瓶中，迅速带回，于39 ℃水浴中经4层纱布过滤。接种时迅速将每个瓶中加入于39 ℃预热的缓冲液(参照Menke等^[4]方法配制)50 mL和新鲜瘤胃液25 mL，并向瓶中持续通入CO₂ 5 s后，立即加上瓶塞，将每个发酵瓶与产气装置[中国农业大学研制的AGRS-Ⅲ型64通路微生物发酵微量产气全自动记录装置与(automatedutomated trace gas recording system for microbial fermentation,AGRS)^［5]］的每个传感器相连接，于39 ℃下培养48 h。

在培养发酵48 h后结束发酵程序，从发酵瓶中采集发酵液，用pH计(Sartorius，PB-10)测pH，并用40~50 μm孔径5 cm×10 cm的尼龙袋过滤发酵液装于4个10 mL离心管中，按与发酵液3 ∶ 1的比例添加25%的偏磷酸溶液固氮，混匀后于-20 ℃冷冻保存，用于微生物蛋白(MCP)、挥发性脂肪酸(VFA)和氨氮(NH₃-N)浓度的测定。MCP浓度采用Makkar等^[6]根据Zinn等^[7]改进过的嘌呤法测定，VFA浓度采用气相色谱仪(Agilent 6890N GC system,Agilent,美国)以外标法^[8]测定，氨氮浓度采用靛酚比色法^[9]测定。将尼龙袋过滤的滤渣连同尼龙袋在水龙头下冲洗至水澄清，在65 ℃烘箱内烘至恒重。样品体外干物质降解率计算公式如下：

体外干物质降解率(%)=[(样品干物质质量-发酵后残渣干物质质量)/样品干物质质量]×100。

通过AGRS-Ⅲ型64通路微生物发酵微量产气全自动记录装置实时记录产气量。

参照指数模型对不同饲粮累积产气量数据进行非线性拟合。

GPt=A/[1+(C/t)^B]^[10]。

式中：GPt为t时间点记录到的累积产气量(mL/g DM)；A为发酵时间无限延长时的理论最大产气量(mL)；B为所形成的产气曲线的平滑度；C为达1/2理论最大产气量时间(h)。

TR_maxG=C×[(B-1)/(B-1)]^(1/B)；

R_maxG=[A×C^B×B×TR_maxS^(-B-1)]/[1+CB×TR_maxS^(-B)]²。

式中：TR_maxG为达最大产气速率时间(h)；R_maxG为最大产气速率(mL/h)。

原始数据经由Excel 2013初步处理，再采用SAS 9.2软件中的GLM模型进行分析。用Duncan氏法进行多重比较，以最小二乘平均值形式表示统计结果。

由表2可见，饲粮的体外干物质降解率呈现MF组>CSA组>CSB组，组间差异显著(P＜0.05)；48 h累积产气量和理论最大产气量CSA组显著高于CSB组(P＜0.05)，CSA组与MF组差异 不显著(P＞0.05)。达1/2理论最大产气量时间CSA组显著大于MF、CSB组(P＜0.05)；各组间最大产气速率差异不显著(P＞0.05)，而CSA组的达最大产气速率的时间显著小于CSB组(P＜0.05)。发酵前10 h MF组的累积产气量曲线斜率均大于CSA、CSB组(图1)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同饲粮对体外产气参数的影响 Table 2 Effects of different diets on gas production parameters in vitro 项目Items 组别 Groups SEM P值 P-value MF CSA CSB 体外干物质降解率 IVDMD/% 85.75a 81.87b 78.08c 0.97 <0.01 48 h累积产气量 Accumulated GP48 h/(mL/g DM) 307.30a 276.74a 223.35b 11.73 <0.01 理论最大产气量 Theological maximum GP/(mL/g DM) 332.50a 313.96a 235.64b 13.85 <0.01 产气曲线的平滑度 Smoothness of GP curve 1.22a 1.12ab 1.03b 0.03 0.02 达1/2理论最大产气量时间 Time of reaching 1/2 of theological maximum GP/h 4.64b 6.90a 4.01b 0.45 0.01 最大产气速率 Maximum GP rate/(mL/h) 57.98 44.19 40.35 4.80 0.14 达最大产气速率的时间 Time of reaching maximum GP rate/h 0.39ab 0.10b 0.62a 0.09 0.04     同行数据肩标不同小字母表示差异显著(P＜0.05),相同或无小写字母表示差异不显著(P＞0.05)。下表同。     In the same row,values with different small letter superscripts mean significant difference (P＜0.05),while with the same or no small letter superscripts mean no significant difference (P＞0.05). The same as below.

表2 不同饲粮对体外产气参数的影响 Table 2 Effects of different diets on gas production parameters in vitro

图 1(Figure 1)

Fig. 1

图1 不同饲粮对体外累积产气量的影响 Fig. 1 Effects of different diets on accumulated GP in vitro

由表3可见，3组间pH，氨氮、MCP、总挥发性脂肪酸(TVFA)、各VFA浓度，乙酸/丙酸均无显著差异(P＞0.05)，CSA组MCP浓度有高于CSB组的趋势(P=0.06)。

由表4可见，理论最大产气量、48 h累积产气量与饲粮NDF、ADF含量和NDS/CP呈显著或极显著负相关(P＜0.05或P＜0.01)，与NDS、CP呈显著或极显著正相关(P＜0.05或P＜0.01)。

饲粮干物质降解率是影响奶牛干物质采食量的重要因素，干物质降解率低则饲粮在瘤胃中降解率低，食糜在瘤胃停留时间长，干物质采食量会由此受到影响。Zhu等^[11]和Wang等^[12]用玉米秸秆代替苜蓿对干物质采食量没有影响，但降低了有机物(OM)的降解率及非纤维性碳水化合物(NFC)的含量。本试验CSA组用玉米秸秆代替苜蓿、玉米青贮降低了干物质降解率可能与OM降解率和NFC含量低于MF组有关。玉米秸秆本身木质素含量高，其粗灰分与ADF含量低于苜蓿、玉米青贮，虽然精粗混合后较单一饲料合理，但仍然可能拉低饲粮干物质降解率。CSB组体外干物质降解率低于CSA组也是同理，因豆粕的消化率高于棉籽粕、菜籽粕^[13]，所以CSB组杂粕代替豆粕降低了体外干物质降解率可能与杂粕本身消化率低于豆粕有关。产气量综合反映了饲粮本身的降解特性和微生物生长的情况，产气量越大则饲粮可发酵营养水平越高，微生物活性越强。从相关性分析来看，48 h累积产气量与NDF、ADF和NDF/CP呈显著或极显著负相关，这与汤少勋等^[14]、崔占鸿等^[15]研究牧草间组合效应理论最大产气量、48 h累积产气量与饲粮NDF、半纤维素含量呈负相关一致。有研究表明，NDF/CP适宜值在 2.4~3.4之间，此时饲粮组合呈正组合效应^[16]。MF、CSA和CSB组NDF/CP分别为2.64、3.36和3.78，MF组与CSA组的NDF/CP在正组合范围内，与CSB组在正组合范围外，这可能是CSB组48 h累积产气量低于CSA、MF组，CSA组与MF组无显著差异的重要原因。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 不同饲粮对体外瘤胃发酵参数的影响 Table 3 Effects of different diets on rumen fermentation parameters in vitro 项目 Items 组别 Groups SEM P值 P-value MF CSA CSB pH 6.85 6.84 6.84 0.02 0.96 氨氮 NH3-N/(mg/dL) 38.13 37.81 36.48 0.61 0.54 微生物蛋白 MCP/(mg/mL) 1.30 1.29 1.10 0.04 0.06 总挥发性脂肪酸 TVFA/(mmol/L) 56.15 53.13 65.01 2.70 0.18 乙酸 Acetate/(mmol/L) 32.37 30.91 37.55 1.53 0.18 丙酸 Propionate/(mmol/L) 13.89 13.02 16.28 0.69 0.13 异丁酸 Isobutyrate/(mmol/L) 0.71 0.64 0.79 0.04 0.32 丁酸 Butyrate/(mmol/L) 6.72 6.23 7.60 0.33 0.24 异戊酸 Isovalerate/(mmol/L) 1.48 1.38 1.65 0.07 0.32 戊酸 Valerate/(mmol/L) 0.98 0.95 1.14 0.05 0.26 乙酸/丙酸 Acetate/propionate 2.33 2.38 2.31 0.02 0.16

表3 不同饲粮对体外瘤胃发酵参数的影响 Table 3 Effects of different diets on rumen fermentation parameters in vitro

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 饲粮营养成分与体外产气参数的相关性分析 Table 4 Coefficients between dietary nutrient levels and gas production parameters in vitro 项目 Items 中性洗涤纤维 NDF 酸性洗涤纤维 ADF 粗蛋白质 CP 中性洗涤纤维/粗蛋白质 NDF/CP 中性洗涤可溶物 NDS 48 h累积产气量 GP48 h -0.93** -0.96** 0.92** -0.94** 0.93** 理论最大产气量 Theological maximum GP -0.87* -0.93** 0.86* -0.89** 0.87* 产气曲线的平滑度 Smoothness of GP curve 0.21 0.31 -0.20 0.23 -0.21 达1/2理论最大产气量时间 Time of reaching 1/2 of theological maximum GP -0.04 -0.18 0.02 -0.08 0.04 最大产气速率 Maximum GP rate -0.61 -0.60 0.61 -0.61 0.61 达最大产气速率的时间 Time of reaching maximum GP rate 0.16 0.24 -0.15 0.18 -0.16     *为显著相关(P＜0.05)，* *为极显著相关(P＜0.01)。     * meant significant correlation (P＜0.05),and * * meant significant correlation (P＜0.01).

表4 饲粮营养成分与体外产气参数的相关性分析 Table 4 Coefficients between dietary nutrient levels and gas production parameters in vitro

瘤胃微生物对pH的变化十分敏感，如瘤胃液pH长期低于6.4，瘤胃微生物生长、繁殖以及发酵底物的降解和利用将会受到影响^[17]。因此，瘤胃液pH对瘤胃发酵是否正常起决定性作用。本试验瘤胃液pH的范围是6.84~6.85，均在瘤胃可接受范围(5.4~7.0)内，各组间差异不显著。这说明玉米秸秆代替玉米青贮和苜蓿对瘤胃液pH无影响，有足够的缓冲能力，有利于瘤胃微生物的生长与发酵，这与朱雯等^[18]、阳伏林等^[19]的研究一致。

氨氮浓度的变化体现了发酵底物含氮物质的降解及瘤胃微生物对氮的利用效率，而对于体外发酵降解的氨氮一部分会溶解在发酵瓶中，另一部分用来维持微生物生命活动及MCP合成，但氨氮浓度过高或过低都不利于微生物的生长与繁殖。Murphy等^[20]研究表明微生物发酵的最适氨氮浓度为6.3~27.5 mg/dL。本试验氨氮浓度范围为36.48~38.13 mg/dL，各组间差异均不显著，说明各组含氮底物的降解率远大于微生物利用率，发酵瓶内蛋白质含量充足，本试验中玉米秸秆及杂粕的使用对发酵液氨氮浓度无影响。发酵液MCP浓度趋势为MF组>CSA组>CSB组，即微生物对氮的利用率MF组有好于CSA组，CSA组有好于CSB组的趋势。有研究表明，在氮源提供充足的情况下，MCP的合成主要受碳水化合物降解时所提供能量的影响^[21]。可能由于本试验CSA组玉米秸秆的NFC含量低，可供瘤胃微生物发酵底物少，致使其发酵所提供的能量低于MF组，从而有降低了MCP合成；张力莉等^[22]研究表明，棉酚添加量在0.025 mg/kg以上时就会对MCP的合成有影响。由于CSB组中杂粕含有单宁、硫葡萄糖苷、棉酚等抗营养因子，可能进一步限制了微生物的活力和对氮的利用，致使MCP合成低于CSA组。单宁能与蛋白质形成不易消化的复合物而致使蛋白质的利用率低，单宁含量过高时还会影响纤维素、脂肪、淀粉等其他营养物质的消化，饲粮的降解与利用均会受到影响^[23]。所以在使用杂粕作为蛋白质来源时应考虑其最适添加量以及尽量使用经过脱毒处理的饲料原料。

反刍动物瘤胃发酵所产生的VFA包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸、戊酸，是能量代谢的主要能量来源，而乙酸、丙酸和丁酸占主要能源物质的80%^[24]。乙酸是乳脂合成的主要前体物质，丙酸则是乳糖合成主要前提物质。本试验中各组间TVFA、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸、戊酸浓度均差异不显著。Merchen等^[25]研究表明，饲粮粗饲料水平改变了VFA的组成，对瘤胃液TVFA浓度没有影响，与本试验研究部分一致。TVFA、乙酸、丙酸浓度很大程度受饲粮精粗比的影响^[26]，可能该试验的饲粮组成仅用低质粗饲料改变了优质粗饲料，杂粕代替豆粕与大豆，没有改变精粗比，NDF与粗蛋白质组成也差异不大，所以对瘤胃的发酵模式没有造成影响。但即使在同一精粗比条件下，粗饲料的品质对TVFA浓度与VFA组成也会存在影响的趋势^[27]，与本试验结果不一致，可能与各组间存在适宜的NDF/NSC有关。

① 玉米秸秆代替玉米青贮、苜蓿降低了饲粮干物质降解率。

② 杂粕代替豆粕降低了体外发酵48 h累积产气量及体外干物质降解率，而对其他瘤胃的发酵指标没有显著影响。