大豆黄酮(daidzein，DA)属异黄酮类植物雌激素，广泛存在于豆类、牧草、谷物等天然植物中。其化学结构与17-β雌二醇类似，生物测定它的雌激素活性占17-β雌二醇的10^-3~10^-2倍^[1]。近年来大豆黄酮在人医临床保健、动物饲料添加剂方面越来越受到重视，研究发现，它具有抗氧化、抗癌、降低胆固醇、提高机体免疫力等生物学功能^{[2, 3, 4]}。在家禽上的研究结果表明，大豆黄酮对家禽的生产性能有很好的调节作用，添加5~10 mg/kg大豆黄酮可以提高蛋鸡、蛋鸭、鹌鹑的产蛋率，降低料蛋比，增加平均蛋重等^{[5, 6, 7]}。但关于其长期高剂量添加是否具有副作用的安全性问题目前尚未见报道。国内外肿瘤学研究结果表明，白介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等多种细胞因子对肿瘤的发生、发展、转移以及疗效观察都具有极为重要的意义。因此，本试验旨在通过研究饲粮中添加高剂量大豆黄酮对产蛋鸡卵巢组织形态、IL-1β阳性细胞数及IL-1β和TNF-α mRNA表达的影响，科学评价大豆黄酮对卵巢增生癌变的安全性，从而为大豆黄酮的科学使用提供参考。

选取体重、产蛋率相近的56周龄海兰褐蛋鸡640只，随机分为4组，即Ⅰ组(对照组)、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组，每组8个重复，每个重复20只。对照组饲喂基础饲粮(基础饲粮组成及营养水平见表1)，试验组饲喂在基础饲粮中分别添加10(最高推荐有效量)、50(5倍最高推荐有效量)、100 mg/kg(10倍最高推荐有效量)大豆黄酮的试验饲粮。预试期3周，饲喂基础饲粮，试验期12周，试验期从59~70周龄。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % 原料 Ingredients 含量 Content 营养水平 Nutrient levels 含量 Content 玉米 Corn 62.70 代谢能 ME/(MJ/kg) 11.09 豆粕 Soybean meal 26.30 粗蛋白质 CP 16.61 石粉 Limestone 8.50 钙 Ca 3.50 DL-蛋氨酸 DL-Met 0.10 有效磷 AP 0.35 磷酸氢钙 CaHPO4 1.00 蛋氨酸 Met 0.35 氯化胆碱 Choline chloride (50%) 0.10 赖氨酸 Lys 0.85 食盐 NaCl 0.30 预混料 Premix 1.00 合计 Total 100.00   预混料为每千克饲粮提供 The premix provides the following per kg of the diet：VA 7 715 IU，VD3 2 755 IU，VE 8.8 IU，VK 2.2 mg，VB12 0.01 mg，VB2 4.41 mg，VB3 5.51 mg，VB 0.55 mg，烟酸 nicotinic acid 19.8 mg，叶酸 folic acid 0.28 mg，Mn 50 mg，Fe 25 mg，Cu 2.5 mg，Zn 50 mg，I 1.0 mg，Se 0.15 mg。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

大豆黄酮(4,7-二羟基异黄酮>97.5%)，白色粉末，四川广汉生化制品有限公司惠赠。试验动物为56周龄海兰褐蛋鸡。

试验鸡采用3层阶梯式笼养，每天定时饲喂2次(08：00和15：00)，自由采食、饮水。各组饲养管理条件保持完全相同，参考美国海兰公司推荐饲养方法饲养管理。

试验结束时，每个重复选取1只鸡翅静脉采血3 mL，3 500 r/min离心10 min，取上清测大豆黄酮、雌马酚含量。采完血的鸡屠宰，在无菌环境下取卵巢部分组织样放于mRNA固定液中，-70 ℃保存；取剩余卵巢基部组织样保存于10%福尔马林溶液中，用于组织形态观察和免疫组织化学技术检测。

采用Agilent 1200-6460 QQQ液质联用仪测定血清中大豆黄酮和雌马酚含量，方法参照Lin等^[8]。

采用石蜡切片法，苏木精-伊红(HE)染色。组织样品经：取样→冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→展片→HE染色→封片的石蜡切片制作程序。在光学显微镜20×镜下观察组织形态。

采用兔抗鸡IL-1β多克隆抗体(英国Abcam公司)对组织切片进行免疫组织化学研究，同时设置阴性对照组。

载玻片处理：载玻片经过充分冲洗、泡酸3 d以上，以去离子水充分冲洗，超净台里通风晾干，在多聚赖氨酸溶液里浸泡10 min，取出晾干过夜，用于贴片做免疫组织化学检测；抗原修复：贴好并烘干24 h以上的切片经过脱蜡复水等步骤，用0.1%胰酶消化5~10 min，磷酸缓冲液(PBS)洗3次，擦干组织周围；封闭：抗原修复完成之后，以5%小牛血清封闭37 ℃、20 min，以此封闭非特异性结合位点；一抗孵育：封闭之后的切片经PBS清洗3次，滴加1 ∶ 100稀释的抗IL-1β多克隆抗体，37 ℃孵育1 h；生物素标记抗体孵育：经过3次PBS冲洗，滴加工作浓度的生物素标记的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(武汉博士德生物工程有限公司)，于37 ℃孵育1 h；显色：滴加新鲜配制的二氨基联苯胺(DAB)显色液，于37 ℃避光作用10 min后流水冲洗终止显色；观察：苏木素复染，酒精脱水，封片，显微镜观察。

计数高倍视野下(10×40)阳性细胞颗粒数，计数高倍视野下阳性累积分。选择合适的相关视野，在高倍镜下计数各级阳性颗粒数[染色强度依次为(±)、(++)、(+++)，记为1、2、3分]，以各级赋值与阳性细胞颗粒数乘积的和作为该视野的阳性累积分，每组3张片子，每份标本阅读5个视野，最后计算平均值。

卵巢基部组织中IL-1β阳性细胞计数判定标准见图1。

图 1(Figure 1)

Fig. 1

A、B:阳性细胞1、2、3级判定标准；C:阴性对照。 图1 IL-1β阳性细胞计数判定标准 Fig. 1 Criteria for positive cell count of IL-1β

卵巢总RNA提取按TRNzol-A+总RNA提取试剂的说明书进行。RNA样品经1.4%琼脂糖-甲醛变性凝胶电泳和紫外分光光度计检测，保证 RNA样品质量可靠，计算样品总RNA浓度。取 2 μg总RNA，cDNA第1链的合成按照反转录试剂盒的使用说明书进行，用内参基因(β-actin)检测cDNA合成质量以及是否有基因组DNA污染。RT产物保存在-20 ℃用于PCR检测。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 引物序列 Table 2 Primer sequences 基因 Genes 引物序列 Primer sequences 登录号 Accession No. 内参基因 β-actin F: 5’-TGAGAGTAGCCCCTGAGGAGCAC-3’ R: 5’-TAACACCATCACCAGAGTCCATCAC-3’ 白介素-1β IL-1β F: 5’-GGGCATCAAGGGCTACAA-3’ R: 5’-CTGTCCAGGCGGTAGAAGAT-3’ NM_204524.1 肿瘤坏死因子-α TNF-α F: 5’-CACAGAATGTAAGCCCTGTCC-3’ R: 5’-TGGAGTTCTGCGATCCTGCATT-3’ BAC55966

表2 引物序列 Table 2 Primer sequences

所用荧光定量PCR采用SYBR Green Ⅰ法，将每个待测样品RT产物取等体积混合，用混合样(cDNA mix)进行反应条件的优化，包括目的基因和内参基因引物设计和合成、最佳退火温度、引物浓度、模板浓度等，确定好最佳反应条件。20 μL反应体系中上下游引物浓度0.2 μmol/L，退火温度60 ℃、20 s。将上述经测序验证后正确的含胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)基因的标准质粒，做10n(n=5~10)梯度稀释。将梯度稀释的标准品和待测样品同时进行定量PCR，每次反应均设阴性对照，每个样品设置3个重复。根据标准品构建的标准曲线(标准曲线由系统软件自动分析获得)计算出待测样品目的基因的拷贝数，然后进行绝对定量分析。

数据经Excel 2003整理后，用SPSS 16.0统计软件进行分析，单因素方差分析(one-way ANOVA)检验组间差异显著性，再进行LSD多重比较。P＜0.05表示差异显著。

由表3可知，大豆黄酮对产蛋鸡血清大豆黄酮和雌马酚含量均没有显著影响(P>0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 高剂量大豆黄酮对产蛋鸡血清大豆黄酮和雌马酚含量的影响 Table 3 Effects of high-dose daidzein on serum daidzein and equol content of laying hens mg/L 项目 Items 大豆黄酮 Daidzein/(mg/kg) SEM P值 P-value 0 10 50 100 大豆黄酮 Daidzein 0.012 0.016 0.020 0.013 0.003 0.646 雌马酚 Equol 0.016 0.037 0.029 0.025 0.003 0.117

表3 高剂量大豆黄酮对产蛋鸡血清大豆黄酮和雌马酚含量的影响 Table 3 Effects of high-dose daidzein on serum daidzein and equol content of laying hens

由表4可知，大豆黄酮对产蛋鸡卵巢相对重量没有显著影响(P>0.05)。

由图2可知，各组均表现为卵巢组织层次分明、结构完整，间质细胞结构正常，在间质细胞间有不同发育阶段的生长卵泡。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 高剂量大豆黄酮对产蛋鸡卵巢相对重量的影响 Table 4 Effects of high-dose daidzein on the relative weight of ovary of laying hens mg/L 项目 Items 大豆黄酮 Daidzein/(mg/kg) SEM P值 P-value 0 10 50 100 卵巢相对重量 Relative weight of ovary 2.577 2.119 2.242 2.222 0.104 0.436

表4 高剂量大豆黄酮对产蛋鸡卵巢相对重量的影响 Table 4 Effects of high-dose daidzein on the relative weight of ovary of laying hens

图 2(Figure 2)

Fig. 2

图2 高剂量大豆黄酮对产蛋鸡蛋鸡卵巢组织形态的影响 Fig. 2 Effects of high-dose daidzein on ovary tissue morphological of laying hens (20×)

由表5可知，大豆黄酮对IL-1β阳性细胞数无显著影响(P>0.05)。

由表6可知，各组中IL-1β和TNF-α mRNA表达均差异不显著(P>0.05)。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 高剂量大豆黄酮对产蛋鸡卵巢IL-1β阳性细胞数的影响 Table 5 Effects of high-dose daidzein on the ovary positive cell count of IL-1βof laying hens 项目 Items 大豆黄酮 Daidzein/(mg/kg) SEM P值 P-value 0 10 50 100 I白介素-1β阳性细胞数 Positive cell count of IL-1β 73.73 73.27 73.93 73.47 0.266 0.866

表5 高剂量大豆黄酮对产蛋鸡卵巢IL-1β阳性细胞数的影响 Table 5 Effects of high-dose daidzein on the ovary positive cell count of IL-1βof laying hens

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 高剂量大豆黄酮对卵巢IL-1β、TNF-αmRNA表达的影响 Table 6 Effects of high-dose daidzein on mRNA expression of IL-1β and TNF-αin ovary 项目 Items 大豆黄酮 Daidzein/(mg/kg) SEM P值 P-value 0 10 50 100 白介素-1β IL-1β 1.113 1.073 0.873 1.117 0.085 0.664 肿瘤坏死因子-α TNF-α 1.046 1.204 1.195 1.102 0.067 0.830

表6 高剂量大豆黄酮对卵巢IL-1β、TNF-αmRNA表达的影响 Table 6 Effects of high-dose daidzein on mRNA expression of IL-1β and TNF-αin ovary

本研究选取了产蛋后期蛋鸡作为研究对象，主要因为此时其本身体内激素水平呈下降趋势，而大豆黄酮是一种类雌激素类物质，恰好可以补充动物体内激素水平，促使动物相关机能不降低或不迅速降低，更好的发挥生产性能。在本试验研究前，本课题组开展了大豆黄酮对蛋鸡生产性能、蛋品质、体内和产品沉积等影响的一系列研究，发现大豆黄酮显著影响了蛋鸡死亡率、平均产蛋率、产蛋量和料蛋比，其中平均产蛋率、产蛋量和料蛋比均与大豆黄酮添加量呈显著二次曲线关系，表明高剂量大豆黄酮会负反馈调节生产性能；也显著影响了3个与钙代谢相关的蛋品质指标(蛋壳厚度、蛋壳比例和蛋壳强度)^{[10, 11]}。

在本试验研究中未发现大豆黄酮对卵巢重量、组织结构、细胞增殖和增殖因子表达等产生显著影响，这表明饲喂高剂量大豆黄酮对产蛋鸡卵巢组织没有影响。之前大部分在人和老鼠上的研究也发现大豆黄酮未对子宫内膜、乳房及卵巢等繁殖组织有影响^{[12, 13, 14]}，这与本研究结果一致。而仅Unfer等^[15]在妇女上研究发现大豆黄酮增加了子宫重，但是在文中未分析血清大豆黄酮含量、体重等一些其他影响因子影响，从而增加了大豆黄酮影响的不确定性。Petrakis等^[16]和Hargreaves等^[17]报道了大豆黄酮对乳房组织有影响，但也缺乏有效定量判断，比如没有报道乳腺增生情况，也没有说清重复效应或乳房炎情况。

IL-1β是一种主要由血液中单核细胞、巨噬细胞及其他多种类型细胞合成分泌的重要细胞因子，通过与靶细胞表面的受体结合调节其功能。白介素-1(IL-1)系统包括5个成员，即2个配体α、β，2个受体Ⅰ型受体、Ⅱ型受体以及1个受体拮抗剂^[18]。其中IL-1β与生殖活动关系最为密切。IL-1β对下丘脑-垂体-卵巢轴有明显的抑制作用。Karal等^[19]报道，0.1 nmol/L的IL-1β即可显著抑制离体大鼠下丘脑视前区内侧基底核释放促黄体生成素释放激素的能力。Petroff等^[20]发现，卵巢中存在完整的IL-1系统，其在卵泡发育、排卵和黄体功能调节等方面具有重要作用。TNF-α是一种多功能的细胞因子。在机体中，不同部位的巨噬细胞、末梢血单核细胞经刺激后均具有产生TNF-α的能力。近年来发现它与生殖功能密切相关。研究表明，卵巢能产生有生物活性的TNF-α。在鼠的卵巢中证明有TNF-α mRNA表达，定位于颗粒细胞和卵母细胞中^[21]。TNF-α可刺激卵泡膜细胞的有丝分裂活动，影响颗粒细胞和泡膜细胞类固醇激素的合成，并在卵巢原细胞、卵母细胞、卵泡细胞的闭锁和黄体退化中发挥重要作用^{[22, 23]}。与Hsieh等^[24]、Ju等^[25]、Allred等^[26]在体外或哺乳动物上得到的结果相比，高剂量大豆黄酮雌激素增生作用不明显。这个不同可能与许多因子相关，比如剂量、服用方式、饲粮原料配方、机体自身雌激素水平等。

细胞培养和模式动物试验表明采食大豆黄酮可能存在抗雌激素作用，以及对繁殖组织有潜在促进癌变的副作用。然而，雌激素效应发挥的有效剂量在过去的50年的研究中也未有定论^[27]。在本试验中，我们以产蛋鸡为试验动物去评价高剂量大豆黄酮对繁殖组织增生癌变的影响，但未观察到任何作用。借鉴于人类，意味着人长期服用高剂量雌激素类物质不会对其卵巢组织产生明显影响，不会增加患卵巢癌的风险。

在产蛋高峰后期蛋鸡饲粮中添加适量大豆黄酮可以改善生产性能和蛋品质，但不会促进蛋鸡卵巢组织增生癌变，是安全的。