异丁酸对犊牛瘤胃及小肠黏膜基因表达的影响

引用本文

梁艳, 刘强, 王聪, 张延利, 裴彩霞, 王永新, 郭刚, 霍文婕, 张拴林, 石彩叶, 刘建新. 异丁酸对犊牛瘤胃及小肠黏膜基因表达的影响[J]. 动物营养学报, 2015, 27(8): 2483-2492. 复制到剪切板

LIANG Yan, LIU Qiang, WANG Cong, ZHANG Yanli, PEI Caixia, WANG Yongxin, GUO Gang, HUO Wenjie, ZHANG Shuanlin, SHI Caiye, LIU Jianxin. Effects of Isobutyrate on Gene Expressions of Ruminal and Small Intestinal Mucosa of Calves[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2015, 27(8): 2483-2492. 复制到剪切板

异丁酸对犊牛瘤胃及小肠黏膜基因表达的影响

梁艳¹, 刘强¹ , 王聪¹, 张延利¹, 裴彩霞¹, 王永新¹, 郭刚¹, 霍文婕¹, 张拴林¹, 石彩叶¹, 刘建新²

1. 山西农业大学动物科技学院, 太谷 030801;
2. 浙江大学动物科学学院, 杭州 310058

收稿日期：2015-3-23

基金项目：国家自然科学基金项目(31272471);山西省高校"131"领军人才项目(2013);山西农业大学学术带头人项目(2012)

作者简介：梁艳(1990—),女,山西孝义人,硕士研究生,从事反刍动物营养与饲料科学研究。E-mail:609219663@qq.com

通讯作者：刘强,教授,硕士生导师,E-mail:liuqiangabc@163.com

摘要：本试验旨在研究饲粮补充异丁酸对断奶前后犊牛瘤胃及小肠发育相关基因表达的影响。选取平均体重(40.0±0.2) kg、发育正常、30日龄的中国荷斯坦公犊牛36头,随机分为4组,对照组饲喂基础饲粮,试验组分别在基础饲粮的基础上添加异丁酸3、6和9 g/d。分别于45、60(断奶)、90日龄每组屠宰3头并采集瘤胃及小肠黏膜组织样品,通过实时荧光定量PCR技术检测生长激素受体(GHR)、胰岛素受体(INSR)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶1(HMGCS1)和钠-葡萄糖共转运载体1(SGLT1)的mRNA表达量。结果表明:犊牛体重和GHR、INSR、HMGCS1 mRNA的表达量均随着犊牛日龄的增长而出现显著增长(P＜0.05),而SGLT1 mRNA的表达量在断奶前后随着日龄的增长先下降后增长,变化显著(P＜0.05)。45和60日龄时,犊牛体重在9 g/d异丁酸组显著高于对照组(P＜0.05),但与6 g/d异丁酸组差异不显著(P>0.05)。各日龄6和9 g/d异丁酸组瘤胃和小肠各部位GHR、INSR、HMGCS1 mRNA的表达量均高于对照组,且这2组之间差异不显著(P>0.05)。添加异丁酸对45日龄和90日龄犊牛小肠各部位SGLT1 mRNA的表达量没有显著影响(P>0.05);60日龄6和9 g/d异丁酸组十二指肠SGLT1 mRNA表达量显著高于对照组和3 g/d异丁酸组(P＜0.05),9 g/d异丁酸组空肠近端、空肠远端和回肠SGLT1 mRNA表达量显著高于对照组(P＜0.05),但与6 g/d异丁酸组差异不显著(P>0.05)。综合以上结果,饲粮中补充异丁酸能够促进犊牛生长和瘤胃及小肠黏膜的发育,本试验条件下其适宜添加量为6 g/d。

关键词：异丁酸犊牛瘤胃黏膜小肠黏膜基因表达

Effects of Isobutyrate on Gene Expressions of Ruminal and Small Intestinal Mucosa of Calves

LIANG Yan¹, LIU Qiang¹ , WANG Cong¹, ZHANG Yanli¹, PEI Caixia¹, WANG Yongxin¹, GUO Gang¹, HUO Wenjie¹, ZHANG Shuanlin¹, SHI Caiye¹, LIU Jianxin²

1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China;
2. College of Animal Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China

Abstract: This study was conducted to examine the effects of dietary isobutyrate supplementation on gene expressions related to rumen and small intestine development of pre-weaning and post-weaning calves. Thirty-six 30-day-old Chinese Hostein dairy calves with similar body weight [(40.0±0.2) kg] were divided into four groups at random. Isobutyrate was added to a basal diet with 0 (control), 3, 6 and 9 g/d, respectively. Three calves from each group were slaughtered at the age of 45, 60 (weaning age) and 90 days, samples of ruminal and small intestinal mucosa were collected to detect the mRNA expression levels of growth hormone receptor (GHR), insulin receptor (INSR), 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 1 (HMGCS1) and sodium-glucose cotransporter 1 (SGLT1) by the real-time quantitative PCR. The results showed that body weight and mRNA expression levels of GHR, INSR and HMGCS1 increased significantly with age (P＜0.05), but SGLT1 mRNA expression level firstly decreased then increased before and after weaning, and the changes were significant (P＜0.05). At the age of 45 and 60 days, body weight in 9 g/d isobutyrate group was significantly higher than that in control group (P＜0.05), but was not significant different from that in 6 g/d isobutyrate group (P>0.05). At all days of age and all parts of rumen and small intestine, the mRNA expression levels of GHR, INSR and HMGCS1 in 6 and 9 g/d isobutyrate groups were higher than those in control group, and there were no significant differences between the two groups (P>0.05). At all parts of small intestine, the supplementation of isobutyrate did not affect the mRNA expression level of SGLT1 of 45-day-old and 90-day-old calves (P>0.05). At the age of 60 days, mRNA expression level of SGLT1 of duodenum in 6 and 9 g/d isobutyrate groups was significantly higher than that in control group and 3 g/d isobutyrate group, while mRNA expression level of SGLT1 of proximal jejunum, distal jejunum and ileum in 9 g/d isobutyrate group was significantly higher than that in control group (P＜0.05), but had no significant difference with that in 6 g/d isobutyrate group (P>0.05). The results indicate that the growth of calves and the development of ruminal and small intestinal mucosa can be promoted by the supplementation of isobutyrate, the optimal dose of isobutyrate is 6 g/d under conditions in the present study.

Key words: isobutyrate calves ruminal mucosa samll intestinal mucosa gene expression

犊牛断奶前后阶段是从以哺乳为主逐渐过渡到完全采食饲料获得营养的时期。促进其胃肠发育及尽快地建立和完善强大的消化功能可以保证培育目标的顺利实现。研究异丁酸对犊牛瘤胃及小肠发育的影响旨在为调控犊牛生长发育探索更有效的途径。异丁酸是瘤胃内纤维分解菌的生长因子^[1]，当瘤胃内异丁酸含量较低时就会限制微生物的生长，进一步影响营养物质消化，而瘤胃微生物及其发酵产物是刺激瘤胃生长发育的根本原因^{[2, 3]}。研究证实，瘤胃发酵产物在体内条件下能够促进瘤胃黏膜发育，但在体外试验中却没发挥作用^[4]，这说明瘤胃发酵产物对瘤胃上皮的发育并非直接产生促进作用，可能是通过某些激素的调节机制实现的。丁酸可通过刺激胰岛素(insulin,INS)的分泌而促进瘤胃上皮细胞的有丝分裂，INS和胰岛素样生长因子-Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)刺激瘤胃上皮细胞增殖的速率分别为75％和96％^[5]。灌注短链挥发性脂肪酸(short chain volatile fatty acid,SCVFA)的羔羊瘤胃上皮细胞对葡萄糖的利用减少，但乙酰乙酸的产量却显著提高^[6]。瘤胃黏膜生酮作用主要依赖其线粒体内相关酶的作用，如乙酰辅酶A乙酰基转移酶1(acetyl CoA acetyl transferase 1,ACAT-1)和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶1(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 1,HMGCS1)。小肠对葡萄糖的吸收需要特殊载体，主要是钠-葡萄糖共转运载体1(sodium-glucose cotransporter 1,SGLT1)和葡萄糖转运载体2(glucose transporter 2,GLUT2)。研究表明，SCVFA可通过上调回肠GLUT2与胰高血糖素的基因表达，促进肠上皮细胞分裂增殖^[7]。还有研究证实犊牛饲粮补充丁酸钠^[8]以及真胃灌注淀粉和酪蛋白^[9]没有显著改变犊牛小肠组织SGLT1 mRNA及其蛋白的表达，但小肠不同部位SGLT1蛋白的表达有差异。研究发现异戊酸可调控瘤胃发酵从而使瘤胃挥发性脂肪酸增多，尤其是乙酸和丁酸^[10]。此前的研究表明，饲粮补充异丁酸能够改善泌乳奶牛瘤胃发酵、养分代谢、泌乳性能和血液指标^[11]以及肉牛瘤胃发酵、增重性能和血液指标^{[12, 13]}，但其对犊牛瘤胃及小肠黏膜的发育调节机制还未见报道。因此，本试验开展异丁酸对断奶前后犊牛瘤胃和小肠黏膜生长轴基因以及瘤胃黏膜发育的生酮作用酶基因、小肠吸收葡萄糖功能基因影响的研究，探讨犊牛瘤胃和小肠黏膜发育及成熟的分子机制，从根本上了解异丁酸的调控机制，为断奶前后的犊牛通过营养调控加快建立正常胃肠消化吸收机能，提高生长性能提供依据。

1 材料与方法 1.1 试验设计

选用发育正常、平均体重(40.0±0.2) kg的30日龄荷斯坦哺乳公犊牛36头，随机分为4组，每组9头。试验开始时采用电子秤逐一称重。对照组饲喂基础饲粮，试验组分别在基础饲粮中添加异丁酸3、6和9 g/d，分别在45、60(断奶)、90日龄各组随机抽取3头，空腹称重后进行屠宰。

1.2 试验饲粮及饲养管理

试验犊牛单独饲养，统一管理。每日于07:00、12:00和18:00饲喂3次，断奶前每次饲喂2 kg奶，自由饮水，异丁酸混合于奶中饲喂。断奶后的犊牛以苜蓿干草和犊牛精料(精粗比40 ∶ 60)为基础饲粮，每日07:00、12:00和18:00饲喂，日喂量2 kg，先精后粗，自由饮水，异丁酸在饲喂前混合于精料中饲喂。犊牛精料组成及营养水平见表1，其中粗蛋白质(CP)、粗脂肪(EE)、钙(Ca)和磷(P)含量采用实验室常规方法测定^[14]，净能依据《奶牛饲养标准》(NY/T 34—2004)^[15]计算。

表1 犊牛精料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the concentrate for calves (DM basis)

1.3 屠宰及样品采集

屠宰时采用颈静脉放血，屠宰后，打开腹腔，立即结扎贲门瓣、直肠远段，将犊牛胃肠道取出，小心剥离并在各胃室和肠段连接处进行结扎、剪断。

1.3.1 瘤胃组织采样

将犊牛各胃室分离，除去内容物，用生理盐水冲洗干净，用载玻片分别在背囊、前背盲囊、后背盲囊、前腹盲囊、后腹盲囊5处剥离黏膜，取黏膜2 g左右放入塑料袋中，于液氮中速冻后，-70 ℃冷冻保存备用。

1.3.2 小肠组织采样

除去肠系膜与小肠外部脂肪，分离小肠各肠段，剪开，经生理盐水漂洗后用载玻片分别刮取十二指肠近端(5 cm处)、空肠近端1/4处、空肠远端1/4处及回肠末端(靠近盲肠20 cm处)的黏膜，分别取各段黏膜2 g左右放入塑料袋中，于液氮中速冻后，-70 ℃冷冻保存备用。

1.4 瘤胃及小肠黏膜基因表达测定

利用实时荧光定量PCR技术测定瘤胃和小肠黏膜生长激素受体(GHR)、胰岛素受体(INSR)，瘤胃黏膜HMGCS1和小肠黏膜SGLT1的mRNA表达量。

1.4.1 总RNA的提取及反转录

按Invitrogen公司总RNA提取操作步骤分别提取犊牛瘤胃及小肠黏膜组织中的总RNA，并用核酸蛋白测定仪ND-1000测定总RNA的纯度和浓度。反转录按PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time试剂盒说明书进行。反转录反应体系为10 μL：5×Prime RT Master Mix 2.0 μL，总RNA 500 ng，RNase Free dH₂O加至总体积10 μL。将得到的产物cDNA放到4 ℃冰箱保存备用。

1.4.2 设计引物

根据NCBI公布的相应基因序列，利用Primer premier 5.0软件设计引物，以18S rRNA为内参基因，由华大基因有限公司合成引物。引物序列及参数见表2。

表2 引物序列及参数 Table 2 Parameter sequences and parameters

1.4.3 实时荧光定量PCR

根据SYBR PrimeScript^TM RT-PCR Kit试剂盒说明书进行操作。反应体系为 20 μL：SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ(2×)10 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，cDNA 2.0 μL，ddH₂O 6.0 μL。

1.5 数据处理与分析

实时荧光定量PCR结果利用MX3000P软件导出。根据标准曲线以及荧光曲线的循环阈值(CT)计算定量结果。通过2^-ΔΔCT法获得目的mRNA的相对表达量。△CT=CT_目的基因-CT_内参基因，△△CT=△CT_试验组-△CT_对照组,mRNA的相对表达量=2^-ΔΔCT。试验数据用SPSS 17.0统计软件中的ANOVA程序进行方差分析和Duncan氏法多重比较，结果采用“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析 2.1 异丁酸对犊牛体重的影响

由表3可知，犊牛体重随日龄的增加而显著增长(P＜0.05)。45和60日龄时，犊牛体重在9 g/d异丁酸组显著高于0 g/d异丁酸组(对照组)(P＜0.05)，但与其他2组差异不显著(P>0.05)。90日龄时，9 g/d异丁酸组的犊牛体重显著高于其他3组(P＜0.05)。

表3 异丁酸对犊牛体重的影响 Table 3 Effects of isobutyrate on body weight of calves

2.2 异丁酸对犊牛瘤胃和小肠黏膜GHR mRNA表达量的影响

由表4可知，犊牛瘤胃及小肠黏膜组织各部位的GHR mRNA的表达量均随着日龄增加而出现显著增长(P＜0.05)。空肠近端在60、90日龄添加异丁酸后对其GHR mRNA表达量影响不显著(P>0.05)。45日龄时，补充异丁酸6和9 g/d的瘤胃背囊、瘤胃后背盲囊、瘤胃前腹盲囊、瘤胃后腹盲囊、十二指肠、回肠GHR mRNA表达量显著高于对照组(P＜0.05)。60日龄时，6和9 g/d异丁酸组瘤胃各部位和回肠的GHR mRNA表达量显著高于对照组和3 g/d异丁酸组(P＜0.05)。90日龄时，各组间瘤胃背囊、空肠近端和空肠远端的GHR mRNA表达量无显著差异(P>0.05)，而其他部位GHR mRNA的表达量在6和9 g/d异丁酸组显著高于对照组(P＜0.05)。

表4 异丁酸对犊牛瘤胃和小肠黏膜生长激素受体mRNA表达量的影响 Table 4 Effects of isobutyrate on GHR mRNA expression level of ruminal and small intestinal mucosa of calves

项目 Items	日龄 Days of age	异丁酸 Isobutyrate/(g/d)
项目 Items	日龄 Days of age	0	3	6	9
瘤胃背囊 Dorsal sac of rumen	45	0.181±0.004^bC	0.193±0.010^abC	0.201±0.009^aC	0.208±0.015^aC
	60	0.348±0.005^cB	0.420±0.021^bB	0.592±0.001^aB	0.496±0.013^aB
	90	0.578±0.008^aA	0.613±0.015^aA	0.642±0.021^aA	0.651±0.011^aA
瘤胃前背盲囊 Anterior dorsal blind sac of rumen	45	0.659±0.003^aC	0.676±0.032^aC	0.694±0.027^aC	0.703±0.038^aC
	60	0.823±0.025^bB	0.867±0.027^bB	1.313±0.042^aB	1.306±0.052^aB
	90	1.332±0.031^bA	1.409±0.019^aA	1.458±0.028^aA	1.473±0.038^aA
瘤胃后背盲囊 Posterior dorsal blind sac of rumen	45	0.596±0.025^bC	0.624±0.017^abC	0.642±0.029^aC	0.647±0.027^aC
	60	0.659±0.005^bB	0.673±0.026^bB	1.018±0.038^aB	1.085±0.020^aB
	90	1.168±0.012^bA	1.232±0.039^abA	1.354±0.018^aA	1.374±0.031^aA
瘤胃前腹盲囊 Anterior ventral blind sac of rumen	45	0.454±0.016^bC	0.472±0.016^abC	0.536±0.021^aC	0.554±0.032^aC
	60	0.507±0.006^cB	0.556±0.012^bB	0.650±0.005^aB	0.621±0.020^aB
	90	0.720±0.023^cA	0.749±0.018^bA	0.795±0.036^aA	0.806±0.041^aA
瘤胃后腹盲囊 Posterior ventral blind sac of rumen	45	0.637±0.015^bB	0.651±0.059^abC	0.698±0.028^aC	0.703±0.035^aC
	60	0.687±0.066^bB	0.772±0.103^bB	1.237±0.037^aB	1.139±0.024^aB
	90	1.326±0.071^bA	1.432±0.087^abA	1.498±0.061^aA	1.521±0.053^aA
十二指肠 Duodenum	45	2.419±0.118^bC	2.513±0.089^abC	2.621±0.075^aC	2.637±0.056^aC
	60	2.879±0.028^bB	2.967±0.134^abB	3.231±0.091^aB	3.170±0.045^aB
	90	3.305±0.034^bA	3.452±0.115^abA	3.531±0.099^aA	3.545±0.087^aA
空肠近端 Proximal jejunum	45	1.157±0.329^aC	1.203±0.089^aB	1.256±0.102^aB	1.262±0.036^aB
	60	1.470±0.001^aB	1.526±0.148^aA	1.544±0.021^aA	1.433±0.007^aA
	90	1.668±0.016^aA	1.702±0.025^aA	1.763±0.036^aA	1.795±0.113^aA
空肠远端 Distal jejunum	45	0.421±0.007^aC	0.442±0.012^aC	0.506±0.038^aC	0.517±0.019^aC
	60	0.604±0.003^aB	0.645±0.094^aB	0.709±0.029^aB	0.726±0.005^aB
	90	0.810±0.009^aA	0.842±0.017^aA	0.883±0.085^aA	0.879±0.071^aA
回肠 Ileum	45	1.799±0.095^bC	1.887±0.051^abC	1.968±0.064^aC	1.974±0.028^aC
	60	2.056±0.067^cB	2.203±0.031^bB	2.356±0.011^aB	2.445±0.031^aB
	90	2.616±0.074^bA	2.738±0.069^abA	2.867±0.036^aA	2.897±0.054^aA

表4 异丁酸对犊牛瘤胃和小肠黏膜生长激素受体mRNA表达量的影响 Table 4 Effects of isobutyrate on GHR mRNA expression level of ruminal and small intestinal mucosa of calves

2.3 异丁酸对犊牛瘤胃和小肠黏膜INSR mRNA表达量的影响

由表5可知，犊牛瘤胃和小肠黏膜INSR mRNA表达量随日龄增长而出现显著增加(P＜0.05)。45日龄时，6和9 g/d异丁酸组瘤胃各部位和空肠近端、空肠远端INSR mRNA的表达量显著高于对照组(P＜0.05)。60日龄时，除回肠组织外，6 g/d异丁酸组瘤胃各部位和小肠其余各部位INSR mRNA表达量均显著高于对照组(P＜0.05)。90日龄时，INSR mRNA表达量与45日龄时一致。

表5 异丁酸对犊牛瘤胃和小肠黏膜胰岛素受体mRNA表达量的影响 Table 5 Table 5 Effects of isobutyrate on INSR mRNA expression level of ruminal and small intestinal mucosa of calves

项目 Items	日龄 Days of age	异丁酸 Isobutyrate/(g/d)
项目 Items	日龄 Days of age	0	3	6	9
瘤胃背囊 Dorsal sac of rumen	45	0.137±0.009^cC	0.162±0.019^bC	0.183±0.021^aC	0.198±0.024^aC
	60	0.327±0.025^cB	0.438±0.022^bB	0.540±0.017^aB	0.562±0.034^aB
	90	0.645±0.038^bA	0.698±0.028^bA	0.768±0.043^aA	0.794±0.041^aA
瘤胃前背盲囊 Anterior dorsal blind sac of rumen	45	0.403±0.012^bC	0.465±0.028^abC	0.514±0.035^aC	0.554±0.029^aC
	60	0.815±0.019^bB	0.906±0.032^abB	0.956±0.049^aB	0.968±0.008^aB
	90	0.984±0.041^bA	1.036±0.087^abA	1.256±0.065^aA	1.312±0.073^aA
瘤胃后背盲囊 Posterior dorsal blind sac of rumen	45	0.350±0.011^bC	0.379±0.023^abC	0.402±0.019^aC	0.428±0.024^aC
	60	0.636±0.033^cB	0.685±0.015^bcB	0.718±0.009^bB	0.810±0.011^aB
	90	0.912±0.042^bA	0.995±0.043^abA	1.231±0.085^aA	1.304±0.056^aA
瘤胃前腹盲囊 Anterior ventral blind sac of rumen	45	0.345±0.015^bC	0.396±0.037^abC	0.461±0.029^aC	0.476±0.024^aC
	60	0.542±0.011^cB	0.654±0.021^bB	0.712±0.012^aB	0.739±0.013^aB
	90	0.816±0.035^bA	0.903±0.017^abA	0.967±0.046^aA	0.985±0.052^aA
瘤胃后腹盲囊 Posterior ventral blind sac of rumen	45	0.434±0.031^bC	0.461±0.032^bC	0.513±0.047^aC	0.534±0.018^aC
	60	0.624±0.007^bB	0.644±0.029^bB	0.749±0.011^aB	0.767±0.021^aB
	90	0.856±0.013^bA	0.906±0.047^abA	0.964±0.039^aA	0.972±0.051^aA
十二指肠 Duodenum	45	0.428±0.009^bC	0.468±0.013^bC	0.501±0.038^abC	0.534±0.027^aC
	60	0.821±0.014^cB	0.939±0.017^bB	1.010±0.032^aB	0.969±0.006^abB
	90	1.132±0.059^aA	1.256±0.068^aA	1.378±0.087^aA	1.397±0.057^aA
空肠近端 Proximal jejunum	45	0.449±0.028^bC	0.485±0.021^bC	0.521±0.039^aC	0.534±0.035^aC
	60	0.939±0.003^bB	1.028±0.052^abB	1.110±0.036^aB	1.126±0.003^aB
	90	1.264±0.051^bA	1.343±0.069^abA	1.431±0.058^aA	1.439±0.072^aA
空肠远端 Distal jejunum	45	0.706±0.026^bC	0.735±0.041^abC	0.784±0.027^aC	0.791±0.032^aC
	60	0.867±0.012^bB	0.913±0.003^abB	1.027±0.039^aB	0.922±0.087^abB
	90	1.131±0.054^bA	1.256±0.079^abA	1.334±0.061^aA	1.351±0.091^aA
回肠 Ileum	45	0.823±0.008^aC	0.856±0.023^aC	0.936±0.047^aC	0.942±0.034^aC
	60	0.904±0.001^aB	1.066±0.249^aB	1.178±0.053^aB	1.108±0.016^aB
	90	1.228±0.102^aA	1.301±0.056^aA	1.369±0.079^aA	1.372±0.098^aA

2.4 异丁酸对犊牛瘤胃黏膜HMGCS1 mRNA表达量的影响

由表6可知，瘤胃各部位组织黏膜HMGCS1 mRNA表达量随着日龄增加而出现显著提高(P＜0.05)。45日龄时，瘤胃各部位的HMGCS1 mRNA表达量在各组间差异不显著(P>0.05)。60和90日龄时，除前腹盲囊外，瘤胃各部位黏膜HMGCS1 mRNA表达量在6和9 g/d异丁酸组间差异不显著(P>0.05)，但显著高于对照组和3 g/d异丁酸组(P＜0.05)。

表6 异丁酸对犊牛瘤胃黏膜3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶1 mRNA表达量的影响 Table 6 Effects of isobutyrate on HMGCS1 mRNA expression level of ruminal mucosa of calves

2.5 异丁酸对犊牛小肠黏膜SGLT1 mRNA表达量的影响

由表7可知，犊牛小肠黏膜SGLT1 mRNA表达量在断奶前随日龄的增长而显著下降(P＜0.05)，从断奶后到90日龄，其表达量随日龄增长而显著增长(P＜0.05)，90日龄，SGLT1 mRNA表达量与45日龄比较差异不显著(P>0.05)。45和90日龄时添加不同水平的异丁酸对小肠黏膜各部分SGLT1 mRNA表达量影响不显著(P>0.05)。60日龄时，6和9 g/d异丁酸组十二指肠SGLT1 mRNA表达量显著高于对照组和3 g/d异丁酸组(P＜0.05)；空肠近端、空肠远端和回肠的SGLT1 mRNA表达量9 g/d异丁酸组显著高于对照组(P＜0.05)，但与6 g/d异丁酸组差异不显著(P>0.05)。

3 讨论 3.1 异丁酸对犊牛体重的影响

体重是犊牛生长的重要指标之一，在30～90日龄阶段，犊牛体重明显增长。本试验研究发现，饲粮中补充异丁酸后，犊牛体重均高于对照组，且在45~90日龄阶段，9 g/d异丁酸组的犊牛体重显著高于对照组，说明异丁酸有促进犊牛生长的作用。

表7 异丁酸对犊牛小肠黏膜钠-葡萄糖共转运载体1 mRNA表达量的影响 Table 7 Effects of isobutyrate on SGLT1 mRNA expression level of small intestinal mucosa of calves

3.2 异丁酸对犊牛瘤胃及小肠黏膜GHR mRNA表达量的影响

生长激素(GH)是调控动物生长发育的核心激素，其发挥生理作用的首先是与靶细胞膜表面的GHR结合，由GHR介导将信号传入细胞产生一系列生理效应。本试验中从试验开始，犊牛瘤胃及小肠黏膜组织各部位的GHR mRNA的表达量随着日龄的增加而显著增长。添加异丁酸6和9 g/d与对照组相比，增加了犊牛瘤胃及小肠黏膜GHR mRNA的表达量，说明促进了瘤胃和小肠的生长发育。生长激素能调节体内的物质代谢，刺激蛋白质的合成和脂肪代谢、葡萄糖运输等^[16]。Liu等^[10]在牛饲粮中补充异丁酸发现牛血浆葡萄糖和生长激素浓度随着异丁酸补充量的增加呈线性增长。Hamamdzic^[17]的试验也印证了这一结果。张斌等^[18]在奶牛饲粮中添加异丁酸钠发现血液中葡萄糖和生长激素的浓度随着异丁酸钠添加量的增加呈线性增加。本试验结果也表明饲粮添加异丁酸后提高了GHR mRNA的表达量，从而能增加生长激素的分泌量，刺激瘤胃和小肠组织快速发育。

3.3 异丁酸对犊牛瘤胃及小肠黏膜INSR mRNA表达量的影响

INS在促进细胞增殖、分化以及蛋白质、脂肪、糖原的合成代谢中具有重要作用，还可与IGF-Ⅱ等其他因子联合促进多种细胞的生长，因而INS和IGF-Ⅱ在动物机体中发挥着重要作用。INS受体(INSR)参与INS和IGF-Ⅱ的信号传导，调节动物的新陈代谢活动^[19]。研究发现，INSR基因在新生犊牛中枢神经系统和外周组织中都有表达^[20]。本试验中，犊牛不同生理时期瘤胃及小肠黏膜组织各部位的INSR mRNA的表达量随着日龄的增加而出现显著增长。Matsunaga等^[21]对绵羊瘤胃灌注挥发性脂肪酸(VFA)发现血浆中INS浓度显著升高。本试验中，饲粮添加6和9 g/d异丁酸后，INSR mRNA表达量均显著高于对照组，尤其是空肠远端组织黏膜。显然，异丁酸使瘤胃及小肠黏膜组织的INSR mRNA的表达量增加，一定程度上加快了该部位细胞的增殖分化速度，促进新陈代谢，刺激瘤胃和小肠的生长发育。

3.4 异丁酸对犊牛瘤胃黏膜HMGCS1 mRNA表达量的影响

断奶前后犊牛机体组织必须从依赖乳中的葡萄糖提供能量转变为依赖瘤胃生酮作用来提供能量。瘤胃生酮过程主要依赖于线粒体内限速酶的作用，如ACAT-1和HMGCS1。研究表明，羔羊瘤胃黏膜组织ACAT-1和HMGCS1的mRNA表达量随日龄增加而增加^[22]。本试验中犊牛瘤胃黏膜HMGCS1 mRNA表达量也随犊牛日龄增加而增加。断奶前后6和9 g/d的异丁酸组较对照组提高了HMGCS1 mRNA的表达量，说明犊牛饲粮补充异丁酸增强了瘤胃的生酮作用。这是因为异丁酸促进瘤胃发酵提高了瘤胃内短链脂肪酸的浓度，使生酮作用限速酶HMGCS1 mRNA的表达量大幅增加，从而使瘤胃生酮作用增强。

3.5 异丁酸对犊牛小肠黏膜SGLT1 mRNA表达量的影响

哺乳动物机体通过SGLT1激活蛋白激酶C(PKC)依赖性通路调节GLUT2对葡萄糖的转运^[23]。SGLT1的数量决定小肠转运葡萄糖的效率，而SGLT1 mRNA表达量则体现了SGLT1转录水平的变化。空肠被认为是葡萄糖吸收的主要部位。本试验中SGLT1 mRNA表达量在小肠不同部位呈现空间特异性，空肠远端最高，其次是回肠，十二指肠最低。Rodriguez等^[24]研究发现回肠中多数SGLT1不如十二指肠和空肠中的活性高。本试验中断奶前后犊牛小肠黏膜SGLT1 mRNA的表达还具有时间特异性。60日龄时，各组SGLT1 mRNA表达量显著下降，这可能与断奶前后犊牛机体组织从依赖乳中的葡萄糖转变为依赖瘤胃生酮作用提供能量的适应过程有关。而90日龄时SGLT1 mRNA的表达量显著升高，这是由于断奶后随着日龄的增长犊牛瘤胃和小肠发育趋向成熟，肝脏可以利用瘤胃发酵产生的丙酸经过葡萄糖异生作用形成葡萄糖，使机体葡萄糖浓度在正常情况下趋于稳定。丙酸被认为是反刍动物体内糖异生的主要底物，有研究发现添加异丁酸后丙酸在瘤胃内的产量减少了^[25]，说明随着异丁酸钠添加量的增加葡萄糖异生作用加强了，使非纤维性碳水化合物的消化转移到了小肠，便于吸收更多的葡萄糖。饲粮添加异丁酸后SGLT1 mRNA的表达量较对照组增加，这说明饲粮补充异丁酸能够降低犊牛断奶时的应激，且通过加强小肠黏膜吸收葡萄糖的能力从而促进小肠黏膜的发育。

4 结论

饲粮添加异丁酸可增加断奶前后(45~90日龄)犊牛体重，并提高其瘤胃和小肠黏膜GHR、INSR mRNA、瘤胃HMGCS1 mRNA及小肠SGLT1 mRNA表达量，促进瘤胃及小肠黏膜的发育，且在本试验条件下添加量为6 g/d比较适宜。

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动物营养学报 2015, Vol. 27 Issue (8): 2483-2492	PDF (1120KB)