2. 湖南农业大学动物科学 技术学院, 长沙 410128;
3. 中国农业科学院与世界农用林业中心农用林业与可持续畜牧业联合实验室, 北京 100081;
4. 东北农业大学食品安全与营养协调创新中心, 哈尔滨 150030;
5. 中国饲料工业协会, 北京 100125;
6. 北京中地种畜有限公司, 北京 100028;
7. 俄亥俄州立大学 动物科学技术学院, 伍斯特 44691
2. College of Animal Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;
3. CAAS-ICRAF Joint Laboratory on Agroforestry and Sustainable Animal Husbandry, Beijing 100081, China;
4. Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, Northeast Agriculture University, Harbin 150030, China;
5. China Feed Industry Association, Beijing 100125, China;
6. Beijing Sino Farm Ltd., Co., Beijing 100028, China;
7. College of Animal Science and Technology, Ohio State University, Wooster 44691, USA
碳水化合物是反刍动物饲粮重要的组分成分,一般占饲粮的70%~80%,主要营养功能是为瘤胃微生物和宿主动物提供能量以及维持瘤胃的正常发酵和胃肠道的健康。存在于植物细胞壁中的结构性碳水化合物(structural carbohydrate,SC)主要组成部分为能全面体现饲粮纤维含量的中性洗涤纤维(neutral detergent fiber,NDF),而存在于细胞内容物中的非结构性碳水化合物(non-structural carbohydrate,NSC)主要包括含量超过80%的淀粉。因此中性洗涤纤维与淀粉比例(NDF/starch)相比长久以来一直被人们沿用的饲粮精粗比这一笼统指标,可被描述为更为准确的饲粮配方结构和更直接地反映饲粮的易发酵程度。精粗比制约着瘤胃发酵内环境和细菌菌群数量的变化等,但它只是将植物的茎叶和籽实部分加以区分,体现的仅是纤维物质和非纤维物质含量上的差异。NDF包括半纤维素、纤维素、木质素和少量磷酸盐,对增进动物唾液的分泌、刺激反刍及增强瘤胃缓冲力等具有重要意义;淀粉是完全由多个葡萄糖分子互相连接形成的高度聚合体,是易发酵碳水化合物的主要组分,能为动物机体提供重要的能量来源。故NDF/starch的提出对研究反刍动物瘤胃发酵特性具有更加直观的作用。之前有研究者发现,适宜范围的NDF/starch饲粮对维持动物良好的生产性能至关重要[1, 2],但不同NDF/starch饲粮对瘤胃发酵及微生物活动影响的研究报道仍比较少。美国国家研究委员会(NRC)在1989年推荐奶牛对于NDF需要量的最低限为25%,而没有确定NDF需要量的最佳水平。NRC(2001)再度调整饲粮中NDF需要量最低限,指出以玉米为淀粉来源的奶牛饲粮中NDF含量不小于25%(干物质基础),其中以粗料为来源的饲粮不小于19%[3]。而对于淀粉来说,通常认为当饲粮含高精料或玉米青贮时,淀粉含量应不高于45%。不同类型的精料和粗料的NDF含量对动物生理功能效果不一,因此确定最佳NDF/starch的研究目前已受到国内外研究学者的广泛关注。因此,本试验利用体外产气操作简单、费用低和重复性好等优点,采用体外瘤胃发酵结合动态产气实时记录技术,以调整玉米、玉米青贮和燕麦干草含量配制的4种不同NDF/starch全混合日粮(total mixed ration,TMR)为底物,对48 h累积产气量、产气动力学参数和瘤胃发酵特性进行测定,并探讨了饲粮营养水平与产气参数的相关性,旨在筛选NDF/starch适宜范围,以期为配制奶牛饲粮提供理论指导和数据支持。
1 材料与方法 1.1 样品采集与制备从北京中地良种奶牛科技园区采集8种奶牛常用饲料原料,包括粗料(苜蓿干草、燕麦干草、玉米青贮)、能量饲料(玉米、甜菜粕)和蛋白质饲料(豆粕、膨化大豆、全棉籽),烘干粉碎后,过1 mm网筛,标号密封备用。
1.2 试验设计参照NRC(2001)奶牛营养需要,调整玉米、玉米青贮和燕麦干草含量配制的4种不同NDF/starch TMR,其余原料组成不变。4组饲粮NDF/starch分别为0.86(Ⅰ)、1.13(Ⅱ)、1.56(Ⅲ)和2.38(Ⅳ)。4种试验饲粮组成及营养水平见表1。
![]() | 表1 4种试验饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of four experimental diets (DM basis) |
选用3头年龄相近、体况良好、体重[(580±21) kg]相近且装有永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛为试验动物。试验牛采用单栏喂养,每日基础饲粮供给量满足日产奶30 kg营养需要,精粗比为41.2 ∶ 58.8,基础饲粮饲喂为TMR(组成质量分数为羊草3.7%、苜蓿干草28.4%、全株玉米青贮26.7%、玉米22.6%、豆粕11.8%、全棉籽5.1%、磷酸氢钙0.6%、食盐0.5%、预混料0.6%)。试验期间07:30、13:00和19:30共饲喂3次,全天自由采食,自由饮水。
1.4 试验方法 1.4.1 瘤胃液采集利用基础饲粮预饲7 d,第8天晨饲前2 h从试验瘘管牛上下左右不同位点采集瘤胃液,混匀后装于保温瓶迅速带回实验室,然后在39 ℃水浴环境中用4层纱布过滤,并通入CO2。
1.4.2 缓冲液配制参照Menke等[4]的人工唾液方法进行调制。
1.4.3 体外培养称取500 mg试验饲粮样品(每种饲粮设5个平行,1个空白对照),置于150 mL厌氧发酵罐中。接种时迅速向每个罐中加入于39 ℃恒温箱预热的缓冲液50 mL和经4层纱布过滤的新鲜瘤胃液25 mL,并向罐中持续通入CO2 5 s后,立即加上瓶塞。将每个发酵罐与中国农业大学研制的AGRS-Ⅲ型64通路微生物发酵微量产气全自动记录装置与软件系统产气装置(automated trace gas recording system for microbial fermentation,AGRS)[5]的每个传感器相连接,于39 ℃下连续培养48 h。
1.4.4 样品采集与指标测定在体外培养48 h后置于冰水中终止发酵,从发酵罐中收集培养液,立即用pH计(Sartorius,PB-10)测定发酵液的pH。并用10~40 μm孔径,5 cm×10 cm的尼龙袋过滤发酵液分装于4个10 mL离心管中,按与发酵液3 ∶ 1的比例添加25%的偏磷酸溶液混匀固氮,于-20 ℃冷冻保存,尼龙袋内滤过的发酵液固相,用于体外干物质降解率(IVDMD)测定。微生物蛋白(MCP)浓度采用改进过的嘌呤法测定[6, 7];氨态氮(NH3-N)浓度采用靛酚比色法测定[8];挥发性脂肪酸(VFA)浓度采用气相色谱(Agilent 6890N GC system,Agilent,美国)以外标法测定[9]。
1.5 产气动力学模型分析根据AGRS-Ⅲ型64通路微生物发酵微量产气全自动记录装置与软件系统实时记录各发酵瓶的产气时间和对应的累积产气量,参照Groot等[10]指数模型对不同饲粮累积产气量数据进行非线性拟合。得出:
RmaxG=(A×CB×B×TRmaxG-B-1)/
(1+C×B×TRmaxG-B)2;
TRmaxG=C×[(B-1)/(B-1)]1/B。
式中:GPt为t时间点记录到的累积产气量(mL/g,干物质基础);A为发酵时间无限延长时的理论最大产气量(mL/g);B为所形成的产气曲线平滑度;C为达1/2理论产气量最大值的时间(h);RmaxG为最大产气速率(mL/h);TRmaxG为达最大产气速率的时间(h)。
1.6 数据处理试验数据使用Excel 2010进行初步整理,采用SAS 9.2软件的广义线性模型(GLM)和Duncan氏多重比较法进行分析,以P<0.05为差异显著性判断的标准。
2 结果与分析 2.1 不同NDF/starch饲粮的体外发酵产气量和产气动力学参数由表2和图1可知,48 h内,各组产气量变化一致,均呈逐渐升高趋势。6~48 h内,随着饲粮NDF/starch的提高,各时间点产气量呈依次下降趋势,均为Ⅰ组>Ⅱ组>Ⅲ组>Ⅳ组。在6和12 h时,除Ⅲ和Ⅳ组无显著性差异外(P>0.05),其他各组间差异均显著(P<0.05);24~48 h内,各组间产气量差异均显著(P<0.05)。Ⅰ和Ⅱ组发酵48 h IVDMD显著高于Ⅲ和Ⅳ组(P<0.05),且Ⅰ和Ⅱ组之间、Ⅲ和Ⅳ组之间的差异不显著(P>0.05)。各组饲粮发酵前12 h处于快速上升,之后进入缓慢上升阶段。理论最大产气量以Ⅰ组最高,Ⅱ组次之,Ⅲ组再次之,Ⅳ组最低,除Ⅱ和Ⅲ组之间差异不显著(P>0.05)外,其他各组间差异显著(P<0.05)。各组间产气曲线平滑度、达1/2理论最大产气量时间、最大产气速率及达最大产气速率的时间变化趋势为Ⅰ组>Ⅱ组>Ⅲ组>Ⅳ组,但均无显著性差异(P>0.05)。
2.2 不同NDF/starch饲粮对体外瘤胃发酵参数的 影响由表3可知,随着饲粮NDF/starch的提高,pH、乙酸/丙酸、乙酸/总挥发性脂肪酸(TVFA)呈显著或极显著增加(P<0.05或P<0.01),TVFA、丙酸、丁酸浓度及丙酸/TVFA呈显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01),乙酸浓度随NDF/starch的增加而呈增加趋势,但各组间无显著性差异(P>0.05),对于NH3-N和MCP浓度而言,各组间差异不显著(P>0.05)。
2.3 不同NDF/starch饲粮营养水平与体外产气参数的相关性由表4可知,48 h累积产气量和理论最大产气量与淀粉、中性洗涤可溶物(NDS)、中性洗涤可溶物/粗蛋白质(NDS/CP)、非纤维性碳水化合物(NFC)含量呈正相关关系(P<0.01),而与NDF、酸性洗涤纤维(ADF)含量呈负相关关系(P<0.01);产气曲线平滑度与饲粮营养水平无显著相关(P>0.05);达1/2理论最大产气量的时间与NDS、NDS/CP、NFC呈正相关关系(P<0.01),与淀粉含量呈正相关关系(P<0.05),而与NDF(P<0.01)、ADF(P<0.05)呈负相关关系;最大产气速率与饲粮营养水平无显著相关(P>0.05);达最大产气速率的时间与粗蛋白质(CP)含量呈正相关关系(P<0.01),与淀粉、NDS含量呈正相关关系(P<0.05),而与ADF(P<0.01)、NDF含量(P<0.05)呈负相关关系。
![]() | 表2 不同中性洗涤纤维与淀粉比例饲粮的体外发酵产气量和产气动力学参数
Table 2 GP and GP kinetic parameters of diets with different NDF/starch during in vitro fermentation
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![]() | 图1 体外发酵产气量动态变化
Fig. 1 Dynamic change of GP during in vitro fermentation |
3 讨 论 3.1 不同NDF/starch饲粮对体外发酵产气量的影响
体外培养产气量是评定饲料可发酵程度的重要指标,它与饲料中有机物的降解程度存在高度相关性,即饲料的可发酵性越强,瘤胃中微生物的活性越高,产气量越大,反之则越少。本试验中,随着饲粮NDF/starch的提高,IVDMD呈依次下降趋势,6~48 h累积产气量也逐渐下降。刘利平等[11]研究了不同比例玉米、稻草、银合欢组合对山羊体外瘤胃产气的影响,结果表明随着精料水平和玉米比例的提高,12~96 h累积产气量呈增加趋势,与本试验4组饲粮随玉米比重的增加即淀粉比例的提高产气量逐渐增加研究一致。郑文思等[12]研究指出饲粮NDF水平的降低与体外发酵总产气量、CH4、CO2产量存在极显著的正相关关系,与本研究结果吻合。本试验结果显示,饲粮的可发酵程度随着饲粮starch比例的提高而提高,为Ⅰ组>Ⅱ组> Ⅲ组>Ⅳ组,这主要是因为易发酵的碳水化合物含量随之增加,促进了瘤胃微生物自身繁殖及微生物对发酵所需能量的利用。理论最大产气量是根据48 h累积产气量计算出来的,它们呈正比例关系,所以理论最大产气量也是随NDF/starch增加依次降低,各组间差异显著。产气曲线平滑度、达1/2理论最大产气量的时间、最大产气速率及达最大产气速率的时间各组间差异均不显著。
3.2 不同NDF/starch饲粮对瘤胃发酵参数的影响pH是衡量瘤胃发酵状况的关键指标。本试验中发酵液pH均维持在6.77~6.90,各组的pH均在文献报道的范围(5.7~7.5)内,处于正常生理范围之间,适合瘤胃纤维分解菌的生长[13]。反刍动物瘤胃内纤维分解菌、淀粉分解菌的主要发酵底物分别为纤维素、淀粉,粗料中的纤维素和半纤维素比淀粉等非结构性碳水化合物更难分解,产生的挥发性脂肪酸减少,故pH得到提高[14]。另外,Yang等[15]研究指出,瘤胃pH主要受饲粮精粗比和营养水平影响,与淀粉消化存在高度相关性。因此,综合以上研究,本试验结果显示随着NDF/starch的上升,瘤胃液pH逐渐增加,主要是由于饲粮玉米比例的下降及粗料水平的增加。
![]() | 表3 不同中性洗涤纤维与淀粉比例饲粮对体外瘤胃发酵参数的影响
Table 3 Effects of different NDF/starch diets on in vitro rumen fermentation parameters
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![]() | 表4 不同中性洗涤纤维与淀粉比例饲粮营养水平与体外产气参数的相关性
Table 4 Correlation between nutrient levels of different NDF/starch diets and in vitro GP parameters
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NH3-N是动物瘤胃内含氮物质及内源氮分解的终产物,同时又是微生物合成MCP的主要原料。Ortega等[16]认为瘤胃微生物所需NH3-N的最佳浓度在6.3~27.5 mg/dL。本试验中NH3-N浓度为9.30~13.40 mg/dL,但各组间均无显著差异,说明NH3-N浓度适合微生物生长和MCP合成,并且不受NDF/starch的影响。与本试验研究一致,张建勋等[17]对南江黄羊瘤胃体外发酵特性研究发现,精粗比对NH3-N浓度影响不显著。张爱忠等[18]研究不同精粗比饲粮条件下绒山羊瘤胃内环境和发酵指标动态变化时,也得到与本试验类似的结论。而华金玲等[19]研究发现NH3-N浓度随着精料水平的增加而增加,与本试验研究结果不吻合。NH3-N浓度取决于饲料蛋白质的降解性、瘤胃壁吸收、食糜排空速度和瘤胃微生物对其利用程度。本试验由于是体外发酵,所以NH3-N浓度并不会收到瘤胃壁吸收和食糜排空速度的影响,因此各组NH3-N浓度没有差异可能的原因是瘤胃内微生物的数量会随饲粮starch比例的提高而增加,较多的NH3-N被细菌利用,使各组饲粮的NH3-N浓度差异不显著。MCP浓度受饲粮CP含量、瘤胃易发酵来源及碳水化合物降解的同步性影响,本试验中各组饲粮MCP浓度无显著性差异,推断与4组饲粮的蛋白质水平相近有关。
瘤胃碳水化合物发酵的主要产物是乙酸、丙酸和丁酸等挥发性脂肪酸,占TVFA的95%左右,其中乙酸占TVFA的70%~75%[20]。它们是反刍动物重要的能量来源及合成乳脂和乳糖的主要前体物质。高粗料饲粮中纤维含量高,纤维分解菌占优势,乙酸比例提高;高精料饲粮中淀粉含量高,有利于淀粉分解菌和瘤胃原虫的生长繁殖,表现为丙酸和丁酸比例升高[21, 22]。杨红建等[23]研究表明TVFA产量与饲粮可发酵纤维素和可发酵淀粉比率呈负相关。王仁杰[24]对不同精粗比饲粮中添加异位酸时体外发酵特性研究表明,未添加异位酸时,随精粗比从30 ∶ 70上升到70 ∶ 30,乙酸/TVFA显著下降,而丙酸/TVFA显著升高。本试验研究结果与上述研究结果一致。
3.3 不同NDF/starch饲粮养分与瘤胃产气量及发酵参数的相关性饲料类型与瘤胃发酵之间紧密相连。阳伏林等[25]认为,底物发酵时的主要产气来源物质是碳水化合物及CP,而饲料NSC/CP对体外发酵产气特性有决定性作用,并指出48 h的产气量和理论最大产气量与底物的CP、NDS含量存在正相关关系,而与NDF、ADF含量及NDS/CP呈负相关关系。Khazaal等[26]研究希腊灌木对体外产气的影响发现,不同培养时间的产气量CP呈不显著的正相关关系。汤少勋等[27]对豆科和蓼科组合牧草的研究发现,48 h累积产气量与ADF、NDS含量及NDS/CP呈显著正相关关系,而与CP、NDF及HC的含量呈显著负相关关系。崔占鸿等[28]对青海高原燕麦(Arrhenatherum elatius)青干草与藏嵩草、金露梅、珠芽蓼等天然牧草组合时体外产气特性研究表明,48 h累积产气量及理论最大产气量与NDS含量呈极显著正相关关系,与CP呈不显著的正相关关系,与NDF、HC含量呈极显著负相关关系;产气速率与NDS含量呈不显著正相关关系,而与HC含量呈极显著负相关关系。本研究中,48 h累积产气量、理论最大产气量与淀粉、NDS、NFC含量及NDS/CP均呈极显著正相关关系,与CP含量呈不显著正相关关系,分别与NDF、ADF含量均呈极显著负相关关系,与HC含量呈不显著负相关关系;最大产气速率与NDF、ADF、HC、淀粉、NDS含量及NDS/CP呈不显著正相关关系,而与CP、NFC含量呈不显著负相关关系。这与以上有的研究结果一致,有的则不完全相同。因此,饲粮营养物质供给是否平衡,会极大程度上影响瘤胃微生物的活力和生长繁殖,继续深入研究不同地域、畜种、粗料和精料的配合比例及其产生机理至关重要。
4 结 论体外产气法测定饲粮NDF/starch在0.86~1.13之间对体外瘤胃发酵特性较好。
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