鱼类的体色，尤其观赏鱼的体色，是决定其市场价值的重要指标。血鹦鹉鱼是红头丽体鱼[Vieja synspila(Hubbs,1935)]♀×橘色双冠丽鱼[(Amphilophus citrinellus(Günther,1864)] 的杂交子代，是观赏界十分成功的属间杂交种之一，从问世至今一直深受广大消费者的喜爱。其嘴呈心形，与双亲体形差异较大，比双亲更具观赏价值，在观赏鱼养殖生产中，常利用完全褪黑的血鹦鹉鱼进行扬色，从而改善鱼体的色泽和纯度，大幅度提高其市场价值。因为鱼类自身不能从头合成类胡萝卜素^[1]，必须通过外界摄食含一定类胡萝卜素的着色饲料以达到增色目的^[2]。虾青素(astaxanthin,AST)是观赏鱼增色饲料中最常见的增红着色剂^[3]，它具有着色、增强免疫、强抗氧化性作用，可提高动物成活率、促进生长发育，在水产养殖中具有重要的作用。然而虾青素价格昂贵，每千克纯虾青素的国际市场价高达2 500美元^[4]，导致增色饲料价格居高不下，而且目前鱼类对于虾青素的消化利用率较低，因此，如何提高虾青素的消化利用率，节约虾青素用量是解决这一问题的关键。影响鱼类着色效果的因素有很多，如鱼类的种类、年龄、体重和生理生长阶段等自身因素，以及光照、水温、投饲率等外部因素都会影响类胡萝卜素的吸收和利用^[5]，虾青素被吸收、沉积和代谢转化的效率决定其对鱼体的着色程度。由于类胡萝卜素被吸收后经过一系列复杂的变化后，通过与血浆中脂蛋白结合方式进入血液中^[6]，并通过相应的载体运输到靶组织^[7]；此外，虾青素化学性质不稳定，具有强抗氧化作用^[8]，本身极易被氧化。因此，本试验目的一方面是通过虾青素的脂质代谢途径，增加其被吸收和沉积的效率，如饲料中添加脂质代谢调节剂；另一方面是防止其沉积过程中的类胡萝卜素被氧化代谢掉，在饲料中添加一定量的抗氧化剂等，以提高虾青素的利用率。目前着色饲料增效相关报道尚不多见，如添加适量脂肪^[9]、维生素^[10]和牛磺胆酸钠^[11]等可有效提高类胡萝卜素的利用率。但这些方法也存在不足，如脂肪添加易导致饲料腐败、维生素易被氧化、牛磺胆酸钠不易于分离提取等，因此寻求一种绿色安全环保的着色饲料增效剂将是最佳选择。苜蓿皂苷(alfalfa saponin)是从苜蓿中提取的一种具有独特生物学性质的活性物质，其结构为五环三萜烯类化合物，苜蓿皂苷能清除自由基^[12]、具备药用价值^[13]， 还有促进脂质代谢^[14]和抗氧化^[15]的作用，在动物生产中取得了良好的应用效果^{[16, 17]}。李小慧等^[2]、张晓红等^[18]的研究结果表明饲料中虾青素的含量为500 mg/kg时，血鹦鹉鱼着色效果最好，目前市场上普遍使用的商品虾青素的添加量为500 mg/kg。因此，本研究拟添加不同水平的苜蓿皂苷和定量300 mg/kg的虾青素饲喂血鹦鹉鱼，以确定苜蓿皂苷作为血鹦鹉鱼对虾青素着色增效添加剂的效果和最适添加量，节约饲料成本，为观赏鱼着色研究提供一定的科学依据。

试验对象为630尾平均体重为(10.63±0.30) g血鹦鹉鱼，取自中国水产科学研究院珠江水产研究所观赏鱼基地，鱼体褪黑率均超过95%，试验用基础饲料为稚鱼0号配合饲料，购于广东泰峰膨化饲料有限公司，并加一定比例的脂肪，使脂肪含量达到8.6%，基础饲料营养水平为：粗蛋白质≥44%，粗脂肪≥4.6%，粗纤维≤4%，粗灰分≤18%，总磷0.8%～3.0%，钙1.0%～4.0%，赖氨酸≥2.3%，含硫氨基酸≥1.1%，水分≤12%，食盐0.3%～3.0%。添加剂虾青素购于德国巴斯夫，纯度为10%。苜蓿皂苷产品由河北宝恩生物技术有限公司提供，产品中苜蓿皂苷含量为20%。

将试验鱼随机分成7组，每组3个重复(水族缸)，共21个水族缸，每个缸30尾鱼。7个组分别为饲喂基础饲料的空白对照组(BD组)，饲喂基础饲料并添加300 mg/kg虾青素的虾青素对照组(AST3组)，饲喂基础饲料并添加300 mg/kg虾青素及800、1 200、1 600、2 000或2 400 mg/kg苜蓿皂苷的试验组(分别为ASS8、ASS12、ASS16、ASS20、ASS24组)。养殖用的水族缸不间断充气，水温(27±1) ℃，每周换曝气水3次，每次换水量为全部水量的1/3。每天09:00和16:00各饲喂1次，每次投喂量为鱼体重的3%。

类胡萝卜素含量测定取样时间为15、30、45和60 d，共取样4次，每次分别取约0.05 g鳞片、皮肤和尾鳍提取类胡萝卜素，鳞片和皮肤取至鱼体侧线两侧。类胡萝卜素的提取和测定参考Boonyaratpalin等^[19]的方法。类胡萝卜素含量的计算公式如下：

式中：S为类胡萝卜素含量(mg/kg)；A为吸光度值；K为常数(10 000)；V为提取液体积(mL)；E为吸光系数(2 500)；G为样品重量(g)。

使用CR-400型色彩色差计(柯尼卡-美能达，日本)测定各组鱼体表的红度(a^*)值，色差计使用前用白板校准。每缸随机选取6尾鱼，每组共取18尾鱼进行测定，测定部位为尾鳍和背部，背部为鱼体背鳍下方及侧线上方之间的区域。

采用SPSS 21.0软件分别对血鹦鹉鱼的生长、类胡萝卜素含量和红度值进行显著性分析。使用单因素方差分析(one-way ANOVE)进行分析，差异显著者进行LSD多重比较，显著性水平为P＜0.05，结果用平均值±标准误(mean±SE)表示。各时期，鱼体中类胡萝卜素含量用SigmaPlot 11.0作图。

整个试验周期，所有的血鹦鹉鱼均正常生长，未出现病变，未发生死亡，所有饲料均能相对均衡的被鱼摄食。由表1可知，投喂试验饲料60 d以后，各组鱼体重约比初期增加1倍，且苜蓿皂苷添加水平为1 200、2 000、2 400 mg/kg的组体重增加显著高于虾青素对照组和空白对照组(P＜0.05)。 苜蓿皂苷添加水平达到1 200 mg/kg后，鱼体特定生长率显著高于虾青素对照组和空白对照组(P＜0.05)，且以2 000和2 400 mg/kg苜蓿皂苷组鱼体的表现较佳，同时具有较佳的末体长。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同添加水平苜蓿皂苷对血鹦鹉鱼生长和死亡率的影响 Table 1 Effects of different supplemental levels of alfalfa saponin on growth and mortality of blood parrot fish 组别Groups 初体重 Initial body weight/g 末体重 Final body weight/g 体重增加 Body weight gain/g 特定生长率 SGR/(%/d) 初体长 Initial body length/cm 末体长 Final body length/cm BD 10.63±0.30 20.15±0.10a 9.52±0.15a 1.07±0.02a 3.92±0.06 5.82±0.07a AST3 10.63±0.30 20.83±0.14ab 10.20±0.19ab 1.12±0.05a 3.92±0.06 5.96±0.06ab ASS8 10.63±0.30 21.62±1.72abc 11.00±1.56abc 1.17±0.11ab 3.92±0.06 6.10±0.08bc ASS12 10.63±0.30 23.49±0.50bcd 12.86±0.33cd 1.32±0.01bc 3.92±0.06 6.08±0.08abc ASS16 10.63±0.30 23.20±1.31bcd 12.57±1.16bcd 1.30±0.07bc 3.92±0.06 6.21±0.06bc ASS20 10.63±0.30 25.20±0.60d 14.57±0.46d 1.44±0.02c 3.92±0.06 6.24±0.18c ASS24 10.63±0.30 23.96±0.47cd 13.33±0.35cd 1.35±0.02c 3.92±0.06 6.23±0.03c 同列数据肩标不同小写字母表示差异显著 (P＜0.05)。下表同。 Values in the same column with different small letter superscripts indicated significant difference (P＜0.05). The same as below.

表1 不同添加水平苜蓿皂苷对血鹦鹉鱼生长和死亡率的影响 Table 1 Effects of different supplemental levels of alfalfa saponin on growth and mortality of blood parrot fish

在虾青素投喂量相同的情况下，鱼体鳞片、尾鳍和皮肤中类胡萝卜素含量随着饲料中苜蓿皂苷添加水平的增加基本呈先增加后降低趋势(图1、图2和图3)。60 d时，当苜蓿皂苷添加水平达到1 200 mg/kg后，鱼体鳞片、尾鳍和皮肤中类胡萝卜素含量均显著高于虾青素对照组和空白对照组(P＜0.05)，当苜蓿皂苷添加水平为2 000 mg/kg时，鱼体鳞片、尾鳍和皮肤中类胡萝卜素含量分别达到最大值(表2)。试验开始时鱼体鳞片、尾鳍和皮肤中类胡萝卜素含量分别为85.41、121.29和10.88 mg/kg，试验结束后2 000 mg/kg苜蓿皂苷组鱼体鳞片、尾鳍和皮肤中类胡萝卜素含量分别为151.67、288.14和59.90 mg/kg，分别增加了1.78、2.38和4.95倍(表2)。

试验60 d后，鱼体尾鳍和背部红度值如表3所示。尾鳍红度值随着苜蓿皂苷添加水平的增加先增加后降低，苜蓿皂苷添加水平为1 600 mg/kg时，尾鳍红度值为34.13，达到最大；苜蓿皂苷添加水平达到1 200 mg/kg后，尾鳍红度值显著高于虾青素对照组和空白对照组(P＜0.05)。背部红度值也随着苜蓿皂苷含量增加先增加后降低，苜蓿皂苷添加水平为2 000 mg/kg时，背部红度值为12.80，达到最大值；苜蓿皂苷添加水平达到1 200 mg/kg后，尾鳍红度值显著高于虾青素对照组和空白对照组(P＜0.05)。

图1(Figure 1)

Fig. 1

图1 不同添加水平苜蓿皂苷对血鹦鹉鱼鳞片中类胡萝卜素含量的影响 Fig. 1 Effects of different supplemental levels of alfalfa saponin on carotenoid content in scales of blood parrot fish

图2(Figure 2)

Fig. 2

图2 不同添加水平苜蓿皂苷对血鹦鹉鱼尾鳍中 类胡萝卜素含量的影响 Fig. 2 Effects of different supplemental levels of alfalfa saponin on carotenoid content in caudal fin of blood parrot fish

图3(Figure 3)

Fig. 3

图3 不同添加水平苜蓿皂苷对血鹦鹉鱼 皮肤中类胡萝卜素含量的影响 Fig. 3 Effects of different supplemental levels of alfalfa saponin on carotenoid content in skin of blood parrot fish

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 饲喂60 d后不同添加水平苜蓿皂苷对血鹦鹉鱼体内类胡萝卜素含量的影响 Table 2 Effects of different supplemental levels of alfalfa saponin on carotenoid content in body of blood parrot fish after feeding 60 days mg/kg 组别 Groups 鳞片初值 Initial value of scales 鳞片末值 Final value of scales 尾鳍初值 Initial value of caudal fin 尾鳍末值 Final value of caudal fin 皮肤初值 Initial value of skin 皮肤末值 Final value of skin BD 85.41±3.00 86.67±0.71a 121.29±13.52 143.00±0.07a 10.88±0.88 12.82±0.32a AST3 85.41±3.00 139.19±0.24b 121.29±13.52 305.33±0.43b 10.88±0.88 39.05±0.68b ASS8 85.41±3.00 161.22±11.43bc 121.29±13.52 325.94±18.92bc 10.88±0.88 46.11±1.06b ASS12 85.41±3.00 193.35±9.44cd 121.29±13.52 370.42±10.95cd 10.88±0.88 55.25±4.96c ASS16 85.41±3.00 219.66±9.23de 121.29±13.52 409.22±25.09d 10.88±0.88 59.47±1.94cd ASS20 85.41±3.00 237.08±15.19e 121.29±13.52 409.43±13.10d 10.88±0.88 64.78±3.07d ASS24 85.41±3.00 234.68±16.05e 121.29±13.52 402.99±16.23d 10.88±0.88 63.54±2.96d

表2 饲喂60 d后不同添加水平苜蓿皂苷对血鹦鹉鱼体内类胡萝卜素含量的影响 Table 2 Effects of different supplemental levels of alfalfa saponin on carotenoid content in body of blood parrot fish after feeding 60 days

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 不同添加水平苜蓿皂苷对血鹦鹉鱼尾鳍和背部红度值的影响 Table 3 Effects of different supplemental levels of alfalfa saponin on a* value on caudal fin and dorsa of blood parrot fish 组别 Groups 背部初值Initial value of dorsa 背部末值 Final value of dorsa 尾鳍初值 Initial value of caudal fin 尾鳍末值 Final value of caudal fin BD 5.37±1.13 5.49±0.61a 19.43±1.05 18.71±0.52a AST3 5.37±1.13 8.72±0.25b 19.43±1.05 27.58±0.66b ASS8 5.37±1.13 9.08±0.43bc 19.43±1.05 28.78±0.72b ASS12 5.37±1.13 10.35±0.43cd 19.43±1.05 31.59±0.79c ASS16 5.37±1.13 11.21±0.58d 19.43±1.05 34.13±0.29d ASS20 5.37±1.13 12.80±0.25e 19.43±1.05 33.30±1.27cd ASS24 5.37±1.13 12.73±0.37e 19.43±1.05 32.57±0.53c

表3 不同添加水平苜蓿皂苷对血鹦鹉鱼尾鳍和背部红度值的影响 Table 3 Effects of different supplemental levels of alfalfa saponin on a* value on caudal fin and dorsa of blood parrot fish

本试验结果表明，在添加了300 mg/kg虾青素的饲料中添加不同水平的苜蓿皂苷可提高血鹦鹉鱼的生长，苜蓿皂苷添加水平为2 000 mg/kg时，血鹦鹉鱼的末体重、末体长及特定生长率均达到最大值，超过2 000 mg/kg后，各生长指标有所降低，但差异不显著。苜蓿皂苷对血鹦鹉鱼生长的影响尚未见报道，但是有研究苜蓿粉对金鱼生长影响的报道，结果表明饲料中苜蓿粉含量达到25%以后会降低金鱼的生长^[20]；15‰的苜蓿皂苷含量时对断奶仔猪的生长有促进作用^[21]；对于苜蓿皂苷含量超过1%的苜蓿，鹅更喜欢低苜蓿皂苷含量的苜蓿^[22]。上述研究表明一定添加量的苜蓿皂苷能够促进动物生长，但是超过某一值后，对动物生长的促进作用有所减弱。本试验中，苜蓿皂苷添加水平为2 000 mg/kg时，对血鹦鹉鱼各生长指标具最佳的促进作用，与上述研究结果有所不同。这与不同物种对苜蓿皂苷的吸收利用率不同有关，且苜蓿皂苷的加工程序不同、饲料其他成分不同等都会影响到动物对苜蓿皂苷的吸收利用；另外，本试验中同时还添加了300 mg/kg的虾青素，可能会影响苜蓿皂苷对生长的促进作用。整个试验过程中，各组均未见鱼体死亡现象，说明本试验饲料中苜蓿皂苷添加水平不影响血鹦鹉鱼的健康，是一种绿色安全的血鹦鹉鱼着色饲料增效剂。

脂肪、蛋白质、维生素等因素都可影响鱼体对饲料中类胡萝卜素的吸收。提高饲料脂肪水平可以显著提高大西洋鲑(Salmo salar)肌肉中色素含量^[23]；与较低蛋白质水平相比，投喂蛋白质水平为36.20%的饲料使红草金鱼鳍条和皮肤的色素吸光光度值达到最大^[24]；维生素E和类胡萝卜素能够协同吸收^[25]，同时一定量的维生素E可以提高β-胡萝卜素向血浆转运的能力^[26]。但高脂肪饲料容易腐败，高维生素易被氧化，高蛋白质饲料会增加饲料的成本。本研究在相同虾青素添加量的饲料中添加800～2 400 mg/kg的苜蓿皂苷，结果表明随着苜蓿皂苷添加水平的增加，血鹦鹉鱼体内类胡萝卜素含量也逐渐增加，苜蓿皂苷添加水平达到1 200 mg/kg后，血鹦鹉鱼体内类胡萝卜素含量与虾青素对照组和空白对照组出现显著性差异，达到2 000 mg/kg时，体内类胡萝卜素含量达到最大值，随后不再随着苜蓿皂苷添加水平的增加而增加。本试验结果说明在添加了300 mg/kg虾青素的饲料中添加苜蓿皂苷能促进血鹦鹉鱼对虾青素的吸收，且在苜蓿皂苷添加水平达到2 000 mg/kg时吸收效果最好，这与血鹦鹉鱼的生长结果相一致。与脂肪、蛋白质及维生素相比，苜蓿皂苷不仅可以提高动物体的抗氧化指标^[21]，调节动物体的脂质代谢，还可以提高动物体的免疫力^[27]。因此，苜蓿皂苷的添加一方面可以在一定程度上减少虾青素在吸收过程中的氧化损失，另一方面苜蓿皂苷具有脂质代谢调节的功能，而虾青素的吸收又受到脂质代谢的影响，因此推测苜蓿皂苷能够增大虾青素与脂蛋白的接触面积，增强虾青素的转运和沉积。

试验过程中，血鹦鹉鱼不同组织间类胡萝卜素含量始终不同，增加量也不同，且一直是尾鳍>鳞片>皮肤，试验结束后，饲料中苜蓿皂苷添加水平为2 000 mg/kg时，尾鳍、鳞片和皮肤中类胡萝卜素增加量分别是288.14、151.67和59.90 mg/kg。这表明虾青素在消化过程中主要沉积在尾鳍和鳞片中，皮肤中沉积较少。在幼鲑的研究中也发现了投喂叶黄素后类胡萝卜素在各个部位沉积不同，主要在肌肉沉积，其次是皮肤、肝脏和性腺^[28]。类胡萝卜素被吸收后，与血浆中脂蛋白结合后进入血液中^[6]，然后再通过相应的载体运输到靶组织，鱼体内不同部位所含脂蛋白载体的数量不一样，从而鱼体内的不同部位类胡萝卜素沉积量有所差异。

本试验中，在添加了300 mg/kg虾青素的饲料中添加不同水平的苜蓿皂苷，苜蓿皂苷添加水平达到1 200 mg/kg后，尾鳍和背部的红度值相对于虾青素对照组和空白对照组显著增加，这与试验中测定的血鹦鹉鱼体内类胡萝卜素含量的结果一致。大西洋鲑鱼肌肉的红度值与皮肤和肌肉中沉积的虾青素有关系^[29]。花罗汉[Amphilophus citrinellus (Günther,1864)]×青金虎[Cichlasoma trimaculatum (Günther,1867)]的研究中发现投喂鲜虾组的鱼体类胡萝卜素含量比其他组显著增高，鱼体红度值也是显著高于其他各组^[30]，对虹鳟(Oncorhynchus mykiss)的研究也是类似结果^[31]。这些研究结果与本试验的结果一致，说明红度值与鱼体内类胡萝卜含量有正相关关系。皮肤红度值的增加直接归因于酯化了的虾青素在皮肤中沉积的增多^[32]，因此色差计测定的红度值可以在一定程度上反映血鹦鹉鱼对虾青素的吸收利用率。本试验中，在添加了300 mg/kg虾青素的饲料中苜蓿皂苷添加水平达到1 200 mg/kg后，鱼体背部和尾鳍的红度值与虾青素对照组和空白对照组出现显著差异，并分别在苜蓿皂苷添加水平为1 600和2 000 mg/kg时达到最大值，这与本试验中测定鳞片、尾鳍和皮肤中的类胡萝卜素含量的测定结果有所差异。虽然红度值能在一定程度上反映血鹦鹉鱼对虾青素的吸收利用率，但是本试验中测定的类胡萝卜素是总类胡萝卜素，其红度值仅表现的是身体表面的红度值，两者本身有一定的差异。

在含有虾青素的饲料中添加苜蓿皂苷能促进血鹦鹉鱼的生长和对虾青素的吸收；综合特定生长率结果，在添加了300 mg/kg虾青素的饲料中苜蓿皂苷的最适添加水平为2 000 mg/kg。