胎儿的个体发育是一个特殊并且重要的生理过程，多个器官的生长发育需要大量的能量供应，若在此期间母体营养供应不足会使胎儿的生长发育轨迹发生改变，使其生长受阻或停滞，导致胎儿宫内生长受限(intrauterine growth restriction，IUGR)。IUGR可导致胎儿心脏、肝脏、肺脏等组织器官发育受阻^[1]，其中，IUGR还会引起胎儿肝脏功能障碍或不全^[2]。肝脏作为动物体内重要的代谢器官^[3]，在脂类的消化、吸收、分解、合成及运输等代谢过程中均起重要作用^[4]。脂质是生物体内的一类重要物质，在能量的利用和储存等方面发挥重要的作用，而在生命过程代谢活跃的特殊阶段——胚胎的发育过程中，脂质对胎儿的正常发育尤为重要，为了维持旺盛的生长速率，胎儿需要更多的脂质^[5]。胎儿获取脂质的途径与成年动物一样，即内源性合成与外源性摄取，内源性合成主要通过肝脏等器官自身合成，外源性脂质则通过卵黄囊和胎盘摄取，外源性和内源性脂类代谢途径的交汇点及调节中心就在肝脏^[5]。而绵羊胎盘为结缔组织绒毛膜型，很少或不允许脂肪、甘油和游离脂肪酸(FFA)通过^[6]。经历了IUGR的绵羊胎儿由于先天性缺陷，肝脏的发育和生理功能状况很容易受到外界不良因素刺激的影响发生程序化的改变，先天性或获得性因素造成的脂类代谢紊乱会导致血液及其他组织器官中脂质[主要指总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)]及其代谢产物的质和量的异常^[7]，影响动物出生后生产性能的发挥及生长发育的健康，但针对IUGR绵羊胎儿肝脏脂类代谢的影响还未开展全面深入的研究。为此，本试验旨在研究妊娠后期营养限饲蒙古绵羊对其胎儿肝脏脂类代谢的影响，为深入了解IUGR对胎儿肝脏脂类代谢功能的影响以及出生后羔羊肝脏的健康提供一定的基础理论依据。

选择体重相近、2～3胎次、经同期发情且同期受孕(Medison-SA-600 B超仪分析确定均为单胎)的健康蒙古绵羊24只。基于胎儿生长发育的70％~80％在妊娠期最后2个月完成的事实，试验开始(妊娠90 d)选择6只体重与总体平均体重接近的母羊进行屠宰，其余参照文献^[8]所述按体重随机分为3个饲养水平组(表1)：0.175 MJ/(kg BW^0.75·d)组[限饲1组(RG1组)，n=6]、0.330 MJ/(kg BW^0.75·d)组[限饲2组(RG2组)，n=6)和0.670 MJ/(kg BW^0.75·d)组［自由采食组(CG组)，n=6]。在不同饲养水平下进行饲喂至妊娠140 d，将每组6只母羊进行屠宰。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 营养限饲期各组饲养水平 Table 1 Feeding levels in each group during restriction period 项目 Items RG1组 RG1 group RG2组 RG2 group CG组 C group 日均饲草摄入量 Average daily grass intake/(g/d) 444±8c 853±21b 1 693±30a 日均粗蛋白质摄入量 Average daily crude protein intake/(g/d) 45±1c 86±2b 171±3a 日均代谢能摄入水平 Average daily metabolizable energy intake/[MJ/(kg BW0.75·d)] 0.175 0.330 0.670 组间比较，同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)，相邻字母表示差异显著(P<0.05)，相间字母表示差异极显著(P<0.01)。下表同。 Compared among groups,values in the same row with no or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05),while with adjacent letter superscripts mean significant difference (P<0.05),and with alternate letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01). The same as below.

表1 营养限饲期各组饲养水平 Table 1 Feeding levels in each group during restriction period

试验组采用人工套袋法饲喂，试验开始前，将装有2～3 cm长优质青干草的自制套袋罩在各限制组母羊嘴部供其采食，经过1周的适应期后，维持设定饲养水平饲草供给量不变。试验羊分别于08:30、16:00分2次饲喂；CG组自由采食，为保证CG组充分采食，11:00加喂1次。各组自由饮水；自由舔食盐砖。每天采集饲草、剩草样，然后混合，供营养水平分析^[9]。饲草营养水平见表2。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 营养限饲期饲草及剩草营养水平(风干基础) Table 2 Nutrient levels of fed and left grass during restriction period (air-dry basis) % 营养水平 Nutrients levels 代谢能 ME/ (MJ/kg) 干物质 DM 粗蛋 白质 CP 粗脂肪 EE 中性洗 涤纤维 NDF 酸性洗 涤纤维 ADF 粗灰分 Ash 钙 Ca 磷 P 饲草 Fed grass 8.71 88.42 10.09 4.34 71.98 35.82 4.67 0.57 0.09 剩草 Left grass 92.04 9.27 2.72 71.19 36.60 4.39 0.68 0.08

表2 营养限饲期饲草及剩草营养水平(风干基础) Table 2 Nutrient levels of fed and left grass during restriction period (air-dry basis)

宰前24 h停止饲喂，前15 h停止饮水，测定宰前活重。剥皮沿腹中线开膛，快速取出胎儿称量胎儿体重、肝脏重后，立即用真空抗凝管心脏采血10 mL，离心分离血浆(3 500×g，15 min)，-80 ℃保存待测。

取肝脏组织置于冷冻干燥机(Alpha 1-4lsc，德国Christ)冷冻干燥24 h后所得干物质研成粉末进一步分析粗蛋白质(凯式定氮法)、粗脂肪质量(索式抽提法)^[9]。

取各组胎儿肝脏组织0.5 g左右，于9倍体积的0.85％冷生理盐水匀浆，3 000 r/min离心15 min后，取上清液，采用商业试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定胎儿肝脏甘油三酯(F001-1)、总胆固醇含量(F002-1)，LPL(A067)和HL活性(A067)，严格按照说明书测定各项指标。

胎儿血浆中NEFA(095207，日本积水医疗株式会社)、BHBA(095207，上海景源有限公司)、甘油三酯(F001-1，南京建成生物工程研究所)和总胆固醇含量(F002-1，南京建成生物工程研究所)均采用试剂盒测定，严格按照说明书操作。

所有数据采用SAS 9.0一般线性模型统计分析，Duncan氏法进行多重比较。

由表3可见，妊娠90 d时胎儿肝脏重只有33.07 g，到妊娠140 d时RG1组(P<0.01)、RG2组(P<0.05)胎儿肝脏重显著或极显著低于CG组，且RG1组肝脏重也显著低于RG2组(P<0.05)。RG1组胎儿肝脏的干物质(P<0.01)、粗脂肪(P<0.05)、粗灰分(P<0.05)和水分的质量(P<0.01)均显著或极显著低于RG2组和CG组，粗蛋白质质量也分别显著和极显著低于RG2组(P<0.05)和CG组(P<0.01)。

表3

Table 1

表3(Table 3)

表3 妊娠后期营养限饲对蒙古绵羊胎儿肝脏重和肝脏营养成分的影响 Table 3 Effects of maternal undernutrition during late pregnancy on liver weight and nutrient composition in fetal liver of Mongolia ovine g 项目 Items 妊娠90 d 90 d of gestation 妊娠140 d 140 d of gestation RG1组 RG1 group RG2组 RG2 group CG组 CG group 肝脏重 Liver weight 33.07±4.69 72.17±10.14c 85.29±3.68b 100.30±10.86a 肝脏重/体重 Liver weight/body weight/% 5.88±0.12 2.31±0.09 2.44±0.16 2.52±0.10 干物质 Dry matter 5.86±0.52 15.40±0.88c 18.25±1.14a 20.86±0.73a 粗脂肪 EE 0.68±0.07 1.83±0.16b 2.29±0.15a 2.30±0.10a 粗蛋白质 CP 3.78±0.38 8.81±0.56c 11.05±0.44ab 11.80±0.77a 粗灰分 Ash 0.40±0.04 0.90±0.04b 1.14±0.08a 1.21±0.08a 水分 Moisture 24.91±1.70 56.76±3.29d 67.04±3.57c 82.35±3.73a

表3 妊娠后期营养限饲对蒙古绵羊胎儿肝脏重和肝脏营养成分的影响 Table 3 Effects of maternal undernutrition during late pregnancy on liver weight and nutrient composition in fetal liver of Mongolia ovine

由表4可见，妊娠140 d，RG1组胎儿肝脏中甘油三酯含量极显著低于RG2组和CG组(P<0.01)，RG1组胎儿肝脏中总胆固醇含量显著低于RG2组(P<0.05)和CG组(P<0.01)。RG1组、RG2组LPL活性显著低于CG组(P<0.01)，随着饲养水平的下降，HL活性呈现下降趋势，其中RG1组显著低于CG组(P<0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 妊娠后期营养限饲对蒙古绵羊胎儿肝脏中甘油三酯、总胆固醇含量和脂蛋白酯酶、肝酯酶活性的影响 Table 4 Effects of maternal undernutrition during late pregnancy on the contents of TG and TC and the activities of LPL and HL in fetal liver of Mongolia ovine 项目 Items 妊娠90 d 90 d of gestation 妊娠140 d 140 d of gestation RG1组 RG1 group RG2组 RG2 group CG组 CG group 甘油三酯 TG/(mmol/g) 0.87±0.02 0.91±0.07c 1.30±0.03a 1.29±0.08a 总胆固醇 TC/(mmol/g) 0.43±0.04 0.33±0.02c 0.44±0.03ab 0.50±0.02a 脂蛋白脂酶 LPL/(U/mg) 0.27±0.09 0.25±0.07c 0.35±0.08c 0.87±0.09a 肝酯酶 HL/(U/mg) 0.78±0.03 0.31±0.03b 0.45±0.08ab 0.52±0.06a

表4 妊娠后期营养限饲对蒙古绵羊胎儿肝脏中甘油三酯、总胆固醇含量和脂蛋白酯酶、肝酯酶活性的影响 Table 4 Effects of maternal undernutrition during late pregnancy on the contents of TG and TC and the activities of LPL and HL in fetal liver of Mongolia ovine

由表5可见，妊娠140 d，RG1组胎儿血浆中NEFA(P<0.05)、BHBA含量(P<0.01)显著或极显著高于RG2组、CG组。随着饲养水平的降低，血浆中总胆固醇含量呈现升高趋势，RG1组胎儿显著高于CG组(P<0.05)；但胎儿血浆中甘油三 酯含量下降，且RG1组、RG2组显著低于CG组 (P<0.05)。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 妊娠后期营养限饲对蒙古绵羊胎儿血浆中非酯化脂肪酸、β-羟基丁酸、甘油三酯、总胆固醇含量的影响 Table 5 Effects of maternal undernutrition during late pregnancy on the contents of NEFA,BHBA,TC and TG in fetal plasma of Mongolia ovine 项目 Items 妊娠90 d 90 d of gestation 妊娠140 d 140 d of gestation RG1组 RG1 group RG2组 RG2 group CG组 CG group 非酯化脂肪酸 NEFA/(μEq/L) 71.75±6.42 78.25±8.82a 58.60±5.24b 60.33±3.39b β-羟基丁酸 BHBA/(mmol/L) 0.07±0.01 0.23±0.04a 0.12±0.01c 0.09±0.01c 总胆固醇 TC/(mmol/L) 0.57±0.00 0.59±0.04a 0.49±0.04ab 0.45±0.03b 甘油三酯 TG/(mmol/L) 0.59±0.06 0.44±0.03b 0.48±0.01b 0.63±0.07a

表5 妊娠后期营养限饲对蒙古绵羊胎儿血浆中非酯化脂肪酸、β-羟基丁酸、甘油三酯、总胆固醇含量的影响 Table 5 Effects of maternal undernutrition during late pregnancy on the contents of NEFA,BHBA,TC and TG in fetal plasma of Mongolia ovine

妊娠母体的营养不良、疾病等因素会导致胎儿IUGR，具体对于肝脏器官而言，因营养不良或其他负面因素而导致的IUGR对胎儿肝脏生长发育影响严重^[10,11]。在本试验条件下，妊娠后期不同饲养水平限饲母羊，严重限制了RG1、RG2组胎儿的肝脏重，肝脏干物质、蛋白质、脂肪、水分、灰分等物质沉积能力下降，这与文献^[8]和文献^[12]等报道结果一致，表明胎儿肝脏生长发育受到阻碍。

脂类物质对动物体的生长发育、物质代谢和生理机能非常重要^[2]。尤其对于胎儿来说，脂类在胚胎发育中扮演着非常重要的角色^[13]，其中甘油三酯是脂肪的主要成分，是体内主要能量来源；胆固醇既是细胞生物膜的组成成分，又是类固醇激素、胆汁酸及维生素D的前体，对机体生命活动具有重要意义^[14]。从构成细胞的基础结构，到参与信号事件的重要环节，脂质都不可或缺^[5]。本试验条件下，与GC组相比，RG1组胎儿肝脏中的粗脂肪质量，甘油三酯、总胆固醇含量均显著或极显著降低，表明胎儿对脂肪合成和储存能力降低。母体摄入能量的严重限制已导致其自身体贮大量动员^[15]，RG1组胎儿血浆中升高的NEFA、BHBA和总胆固醇含量表明母体供应的营养不能满足胎儿快速的生长，通过加快自身脂肪的分解速率，大量动员脂类物质以满足自身的营养需要。但大量的BHBA蓄积在体内易使动物产生一系列代谢疾病^[16]，这可能会影响胎儿肝脏的生长发育以及出生后羔羊的健康。

LPL存在于肝外组织毛细血管内皮细胞表面，由肝脏实质细胞合成的HL仅存在肝内皮细胞表面，这2种酶均为水解乳糜微粒(CM)中的甘油三酯，释放脂肪酸，且此2种酶活性的降低可引起高脂血症^[17]。研究表明，幼鼠禁食时，肝细胞内HL mRNA含量不变，但是肝细胞内HL酶活性下降，HL的分泌率也下降^[18]；动物饥饿和禁食会影响LPL活性，大鼠饥饿3 d后LPL活性降低76%，LPL mRNA降低50%，LPL生物合成降低50%^[19]。这些结果与本试验条件中RG1组胎儿肝脏中LPL、HL活性显著或极显著降低一致。IUGR胎儿血浆中NEFA、BHBA等指标的升高可负反馈调节降低肝脏中LPL、HL的活性，以促进胎儿肝脏脂肪的合成。

① 本试验条件下，妊娠后期营养限饲母羊显著影响了胎儿肝脏的生长发育，且肝脏中干物质、蛋白质、脂肪、水分、灰分等物质沉积能力下降。

② 本试验条件下，代谢能为0.175 MJ/(kg BW^0.75·d)时，胎儿肝脏脂肪合成能力受到严重影响，血浆中脂类代谢产物含量升高，LPL和HL活性降低，而代谢能为0.33 MJ/(kg BW^0.75·d)时受影响程度较轻，其肝脏健康状况还在可控制范围内。