2. 黔东南民族职业技术学院, 凯里 556000;
3. 习水富兴牧业有限公司, 习水 564600;
4. 贵州大学新农村发展研究院·中国西部发展能力 研究中心, 贵阳 550025
2. Qiandongnan National Polytechnic, Kaili 556000, China;
3. Fuxing Husbandry Co., Ltd., Xishui County, Xishui 564600, China;
4. Institute of New Rural Development·China Center for Western Development Capacity Research, Guizhou University, Guiyang 550025, China
低血钙症是围产期乳畜频发的营养代谢病之一，可影响机体健康，使生产性能下降。产前饲喂低饲粮阴阳离子差(dietary cation-anion difference,DCAD)饲粮可提高胃肠道钙(Ca)吸收、骨Ca动员、肾Ca重吸收效率，是目前有效防治低血钙症的主要营养调控途径。但骨Ca动员入血耗时长[1]、尿Ca排泄量有限[2]，弱化了二者对维持血液Ca浓度的调节作用。因此，胃肠道Ca吸收被认为是维持血液Ca稳恒的主要途径[3]。
Ca的吸收过程包括3个步骤：1)钙离子(Ca2+)在瞬时受体电位通道香草酸受体6作用下顺浓度梯度经扩散方式入胞；2)Ca2+与钙结合蛋白D9k(CaBP-D9k)结合后，由细胞刷状缘膜顶膜转运至基底膜；3)Ca2+在细胞质膜钙泵和钠钙交换体1的作用下，从基底膜跨膜出胞，进入血液[4]。这个过程均受维生素D受体(VDR)的调控[5]。已知，维生素D的活性形式1,25二羟基维生素D3[1,25-(OH)2VD3]具有激活VDR，提高动物血液Ca浓度的作用[6]。研究表明，维生素D与细胞膜表面受体结合后，以内吞作用方式进入细胞核，再与视黄醇类受体(retinoid X receptor,RXR)、VDR结合形成1,25-(OH)2VD3-VDR-RXR，并作用于维生素D反应原件，促进上皮细胞Ca通道表达，使更多Ca进入细胞内，与CaBP-D9k结合将Ca转运至血液中[7]，为提高血液Ca浓度提供了有益的生理性条件。本课题组前期试验结果表明，低DCAD能提高肠道组织CaBP-D9k、VDR表达水平；提高甲状旁腺激素(PTH)和1,25-(OH)2VD3浓度，降低降钙素(CT)浓度，从而提高血液Ca浓度[8]。
据此，可以推测在低DCAD条件下补饲维生素D可通过提高血液CaBP-D9k和VDR浓度，更好地协同促进Ca吸收，提高血液Ca浓度，防治低血钙症。为验证这一假说，本试验选择个体较小，饲养成本较低，同时与奶牛在解剖生理、代谢类型及DCAD响应等方面[9]具备共同特征的妊娠母羊为试验对象，重点研究在低DCAD条件下添加维生素D对妊娠母羊血浆Ca及其调节因子浓度的变化情况，为丰富防治低血钙症的营养调控措施提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计与饲养管理选取18只体重[(33.6±1.3) kg]、年龄[(2.0±0.1)岁]相近的黔北麻羊妊娠母羊，随机分为3组：对照组、Ⅰ、Ⅱ组，每组6个重复，每个重复1只羊。对照组饲喂基础饲粮，Ⅰ组在对照组的基础上补饲阴离子盐[45 g/d六水合氯化镁(MgCl2·6H2O)]降低DCAD，Ⅱ组在Ⅰ组的基础上再补饲维生素D(2 000 IU/d)。对照组、Ⅰ、Ⅱ组DCAD分别预设为200、-150、-150 mmol/kg(干物质基础)。试验持续40 d，前10 d为预试期，主要用于山羊合群性与健康状况观察及逐步适应试验饲粮，后30 d为正试期。山羊分栏全舍饲，留有足够运动空间。每天09:00、18:00清理饲槽后投喂，自由采食，自由饮水。饲粮组成及营养水平见表1，对照组、Ⅰ、Ⅱ组DCAD实测值分别为212.4、-145.5、-145.5 mmol/kg。
 | 表1 饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of diets (DM basis) |
每天采集饲粮样品，试验结束后混匀制成分析试样，检测常规养分含量。钠(Na)、钾(K)含量采用原子吸收法测定(试剂盒购自北京三雄科技公司)，氯(Cl)含量采用硝酸银滴定法(GB/T 6439—92)测定，硫(S)含量采用硝酸镁法(GB/T 17776—1999)测定。DCAD计算公式为：DCAD(mmol/kg)=Na(%)/0.002 3+K(%)/0.003 9-Cl(%)/0.003 55-S(%)/0.001 6。
1.2.2 尿液pH从正试期开始，用精密pH试纸(pH范围5.4~7.0，5.0~9.0)蘸取尿样与标准模板比对，测定山羊尿液pH变化情况，以此确定低DCAD饲粮是否产生体内酸化效应。
1.2.3 生长性能干物质采食量(DMI)：每天准确称量饲粮饲喂量与剩料量，计算DMI。
平均日增重(ADG)：以正试期第1天晨饲前体重为试羊始重，分别记录正试期第11、21、31天晨饲前体重；以第31天的为末重，计算ADG。
料重比：为DMI/ADG。
1.2.4 血液指标分别在正试期第10、20、30天从颈静脉用真空采血管采血10 mL于血液抗凝管中，4 000 r/min离心15 min，取上清血浆冷冻保存，待试验结束后采用试剂盒法测定Ca、P、PTH、CT、1,25-(OH)2VD3、VDR、CaBP-D9k浓度。其中Ca、P、PTH、CT、1,25-(OH)2VD3检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；VDR、CaBP-D9k检测试剂盒均购自上海蓝基生物有限公司。
1.3 数据统计用SAS 9.4软件中Proc GLM程序对试验数据进行方差分析，平均值多重比较采用Duncan氏法进行。差异显著性水平定为P<0.05。
2 结 果 2.1 尿液pH和生长性能由表2可见，降低DCAD可酸化山羊尿液pH，Ⅰ、Ⅱ组分别较对照组降低12.1%、12.6%(P<0.05)，Ⅰ组与Ⅱ组尿液pH变化不大，差异不显著(P>0.05)。阴离子盐(带苦味)的添加，影响了饲粮在预试期的适口性，Ⅰ、Ⅱ组采食速度和DMI均略有降低；但经过几天的适应，Ⅰ、Ⅱ组DMI逐渐增加；正试期3组山羊DMI基本一致，差异不显著(P>0.05)。低DCAD及补饲维生素D对山羊的ANG、ADG及料重比未产生显著影响(P>0.05)。
| 表2 低DCAD协同维生素D对妊娠母羊生长性能的影响 Table 2 Synergy effects of low DCAD with vitamin D on growth performance of pregnant goats |
由表3可见，对血浆Ca浓度，在10、30 d，Ⅱ组分别高于对照组8.9%(P>0.05)、20.4%(P<0.05)；与对照组相比，Ⅰ、Ⅱ组血浆Ca浓度全期平均值分别提高了5.7%(P>0.05)、11.0%(P<0.05)。血浆P浓度不受饲粮处理的影响(P>0.05)。对血浆PTH浓度，10 d时以Ⅰ组最低，低于对照组41.8%(P<0.05)、Ⅱ组35.7%(P<0.05)；至30 d时，Ⅱ组显著高于对照组16.0%(P<0.05)、Ⅰ组16.5%(P<0.05)；全期平均值，Ⅱ组血浆PTH浓度最高，分别高出对照组8.7%(P>0.05)、Ⅰ组23.1%(P>0.05)。10、20和30 d时，各组血浆1,25-(OH)2VD3浓度差异虽未达显著水平(P>0.05)，但均以Ⅱ组最高；Ⅱ组血浆1,25-(OH)2VD3浓度的全期平均值高于对照组21.5%(P<0.05)、Ⅰ组20.1%(P<0.05)；对照组与 Ⅰ组数值相近(P>0.05)。对血浆CT浓度，10 d时，Ⅱ组分别低于对照组35.1%(P<0.05)、Ⅰ组26.5%(P<0.05)；至20、30 d，Ⅱ组也处于较低水平，差异不显著(P>0.05)；3组血浆CT浓度全期平均值差异不显著(P>0.05)，但以Ⅱ组最低。
| 表3 低DCAD协同维生素D对妊娠母羊血浆Ca及其调节因子浓度的影响Table 3 Table 3 Synergy effects of low DCAD with vitamin D on plasma calcium and its regulatory factor concentrations of pregnant goats |
由表4可见，各时间点，血浆VDR浓度以Ⅱ组最高，Ⅰ组次之，对照组最低，Ⅱ组均显著高于对照组(10、20和30 d分别提高35.3%、52.3%和19.7%)(P<0.05)，Ⅱ组在20 d时显著高于Ⅰ组(提高20.6%)(P<0.05)；从全期平均值来看，与对照组相比，降低DCAD(Ⅰ组)和在此基础上补饲维生素D(Ⅱ组)均能提高血浆VDR浓度(15.4%、34.6%)，并且Ⅱ组显著高于对照组(P<0.05)。对血浆CaBP-D9k浓度，在10、20 d时，Ⅱ组均显著高于其余2组(10 d：26.9%、14.9%；20 d：30.9%、17.1%)(P<0.05)；至30 d时，虽然未表现出差异显著(P>0.05)，但数值上Ⅱ组仍处于较高水平；Ⅰ、Ⅱ组血浆CaBP-D9k浓度全期平均值较对照组提高了5.2%(P>0.05)、19.2%(P<0.05)。
| 表4 低DCAD协同维生素D对妊娠母羊血浆钙调节蛋白浓度的影响Table 4 Synergy effects of low DCAD with vitamin D on plasma calmodulin concentrations of pregnant goats |
本试验结果发现，随DCAD的下降，山羊尿液pH呈显著降低。这是因为饲喂低DCAD饲粮后，动物需通过尿液来排泄氢离子(H+)来维持动肾小球细胞膜电位和体液电中性，使尿液H+逐渐增多，引起pH下降，即强离子差理论[10]。通过添加阴离子盐降低DCAD酸化动物体内环境已得到前人诸多的试验证实。本课题组在贵州黑山羊试验中也得到类似结论[9]。
3.2 低DCAD协同维生素D对山羊生长性能的影响
一般来说，未经处理的阴离子盐具有苦涩味，适口性不好，影响动物采食量，不宜直接添加到奶牛饲粮中。目前已有克服这一缺点的商业化产品。在本试验中，Ⅰ、Ⅱ组山羊预试期也表现出DMI降低的现象，但经过适应后，DMI恢复至正常水平，说明阴离子盐并未长期影响山羊采食。其原因可能是山羊与奶牛的味蕾存在差异；也可能与试验所用山羊处于怀孕阶段，需采食养分补充营养有关。研究指出，维生素D具有改善畜禽生长能力，提高畜禽体增重、采食量和饲料效率的作用[11]。但本试验中在低DCAD条件下补饲维生素D，对山羊生长性能未表现出促进作用，很大程度上可能是因为添加的量较少。
3.3 低DCAD协同维生素D对山羊血浆Ca及其调节因子的影响 3.3.1 血浆Ca、PGoff等[12]研究发现，假性PTH功能减退是低血钙症频发诱因，该疾病与采食高DCAD饲粮引起体内代谢性碱中毒有关。因此，预防低血钙症需要饲喂低DCAD饲粮，诱发体内代谢性酸中毒[13]，即尿液pH随DCAD的降低而降低。这在本试验中也得到了体现。维生素D有助于钙的吸收和骨骼的形成，维生素D摄入不足会影响动物体内的Ca、P平衡[6]。郑家三等[14]研究指出，每天添加1.5 g/头过瘤胃维生素D可提高血液Ca浓度，同时维生素D可调节PTH和CT等激素分泌，促进肠道Ca吸收，达到预防低血钙症的目的。研究发现，低血钙症的发生不仅仅是PTH和1,25-(OH)2VD3分泌不足造成的，1,25-(OH)2VD3产生的相对滞后也会影响动物血液Ca恒稳[15]。据此，Wilkens等[16]报道，在饲喂低DCAD饲粮同时补充1,25-(OH)2VD3对奶牛围产期血液Ca浓度具有很好的稳定作用。上述研究结果与本试验类似。由于血浆中P敏感性比Ca弱，DCAD的降低对使动物尿P的排泄影响不大[17]，导致血浆P浓度变化差异不显著。
3.3.2 血浆PTH、CT、1,25-(OH)2VD3动物体内Ca的调控主要靠PTH、CT、1,25-(OH)2VD3的相互作用来实现[8]。低DCAD饲粮可酸化动物机体内环境，提高PTH和1,25-(OH)2VD3浓度[18]，维持动物血液Ca稳恒。当血液Ca浓度过高时，CT分泌增加，抑制血液Ca浓度。Wilkens等[16]研究结果显示，在低DCAD条件下，维生素D的添加对围产期奶牛血浆中PTH影响不显著，而1,25-(OH)2VD3浓度显著低于低DCAD组。Oehlschlaeger等[19]发现，低DCAD补饲维生素D组的1,25-(OH)2VD3浓度显著高于低DCAD组。上述结果均在本试验中也得到了体现，即低DCAD饲粮条件下补饲维生素D有利于提高血浆Ca浓度。
3.3.3 血浆钙调蛋白Wang等[20]认为，VDR主要分布在小肠上皮细胞，其浓度与肠道Ca吸收的维生素D浓度一致。Xue等[21]发现，调控VDR敲除小鼠Ca代谢的关键因子是肠道VDR和维生素D含量。CaBP-D9k的缺失对小鼠Ca转换的影响比减少外源性Ca摄入量更大[5]。可见，VDR和CaBP-D9k在血浆Ca调节过程中扮演了重要角色。胃肠道Ca吸收过程需要VDR与1,25-(OH)2VD3结合调控CaBP-D9k浓度，进而调节机体血液Ca浓度[22]。莘海亮[8]研究表明，饲喂低DCAD饲粮可提高围产鼠、山羊组织VDR表达水平，进而提高血液Ca浓度。这缘于体内环境酸化可提高酶的活性，进而上调胃肠道上皮细胞刷状缘对Ca2+的摄取能力[23]。1,25-(OH)2VD3是维生素D的活性形式；本试验结果表明，在低DCAD饲粮条件下补饲维生素D后(Ⅱ组)，二者表现出了显著的正向协同效应，使Ⅱ组血液Ca浓度显著高于对照组，也高于仅作降低DCAD的Ⅰ组。这为丰富有效防治动物低血钙症提供了进一步的有益的参考。
4 结 论降低DCAD，可降低体黔北麻羊妊娠母羊内酸碱平衡状态，对山羊生长性能没有影响，但可提高血浆Ca浓度。在此基础上补饲维生素D，可进一步增加血浆Ca浓度并提高与Ca代谢相关的生理因子[1,25-(OH)2VD3、VDR、CaBP-D9k]浓度，有效防治低血钙症。
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