犊牛瘤胃发育及功能的完善对犊牛的健康和生产性能有重要的作用^[1]。在瘤胃发酵中适当补充挥发性脂肪酸(VFA)对瘤胃发酵有至关重要的影响，不仅为上皮组织和肌肉收缩提供能量，而且直接影响薄壁细胞的增殖和分化。研究表明丁酸、乙酸和丙酸在一定程度上对瘤胃发酵有化学刺激作用^{[2, 3]}。与丁酸和丙酸一样，支链挥发性脂肪酸(BCVFA)包括异丁酸、异戊酸和2-甲基丁酸都是瘤胃发酵的产物。体外试验发现补充BCVFA能够增强纤维素的发酵^[4]和干物质的消化。体内试验研究结果显示BCVFA可以改善瘤胃发育^{[5, 6, 7]}、瘤胃微生物酶的活力^{[8, 9]}、纤维分解菌的数量^[10]与养分的消化^[11]。同时，近年来人们对纤维分解酶研究增多，通过体外^[12]、半体外^[13]和体内试验^[14]得知添加纤维分解酶通过提高纤维素的分解率，进而改善饲料效率、泌乳期奶牛的产奶量^[15]和肉牛的平均日增重^[14]。据了解，关于犊牛饲粮中同时添加纤维分解酶与异丁酸对犊牛瘤胃发酵的研究较少。因此，本试验旨在研究纤维分解酶、异丁酸及其混合物对断奶前后犊牛瘤胃发酵指标、酶活力和纤维分解菌数量的影响，为进一步研究犊牛断奶前后胃肠道发育奠定理论基础。

选取30日龄体重[(48.5±0.3) kg]近似、发育正常和体况良好的荷斯坦哺乳公犊36头，随机分为4组，每组9头。对照组饲喂基础饲粮，纤维分解酶组(FE组)、异丁酸组(IB组)和复配组(IBFE组)分别在基础饲粮中添加1.83 g/d纤维分解酶(山东思诺拜特生物科技有限公司，包含滤纸酶酶活力160 U和木聚糖酶酶活力4 000 U)、6 g/d异丁酸(99%)和1.83 g/d纤维分解酶与6 g/d异丁酸的混合物。犊牛于60日龄断奶，断奶后以苜蓿和混合精料(精粗比40 ∶ 60)为基础饲粮。分别于断奶前15天(45日龄)和断奶后30天(90日龄)从各组随机抽取4头，晨饲前进行采样。

断奶前的犊牛采取单栏饲养，每日07:00、12:00和18:00饲喂，每次饲喂2 kg奶，纤维分解酶与异丁酸添加于奶中饲喂，自由饮水。断奶后的犊牛以苜蓿干草和犊牛料(熟玉米65%，发酵豆粕32%，矿维3%)为基础饲粮，每日07:00、12:00和:18:00饲喂精料1.0 kg，苜蓿干草1.5 kg，先精后粗，纤维分解酶与异丁酸添加于精料中饲喂，自由饮水。奶、犊牛料和苜蓿干草的营养水平见表1。

表 1

Table 1

表 1(Table 1)

表 1 奶、犊牛料和苜蓿干草的营养水平(风干基础) Table 1 Nutrient levels of milk,concentrate of calves and alfalfa hay (air-dry basis) % 项目 Items1) 奶 Milk2) 犊牛料 Concentrate of calves3) 苜蓿干草 Dried alfalfa hay 干物质 Dry matter 12.86 94.32 91.21 代谢能 ME/(MJ/kg) — 13.90 9.10 粗蛋白质 Crude protein 3.15 19.41 17.53 中性洗涤纤维 Neutral detergent fibre — 25.01 52.84 酸性洗涤纤维 Acid detergent fibre — 13.49 39.86 钙 Calcium — 0.71 1.35 磷 Phosphorus — 0.68 0.31 1)代谢能根据NRC(2001)制定，为计算值，其余为实测值。ME was calculated according to NRC (2001)， and was a calculated value,while the and others were measured values. 2)“—”表示未测定。‘—’meant undetected. 3)每千克犊牛料含 One kg of diet for calves contained the following：Fe 100 mg，Mn 60 mg，Cu 16 mg，Zn 60 mg，Co 0.2 mg，I 0.6 mg，Se 0.6 mg，VA 10 000 IU，VD 2 000 IU，VE 75 IU。

表 1 奶、犊牛料和苜蓿干草的营养水平(风干基础) Table 1 Nutrient levels of milk,concentrate of calves and alfalfa hay (air-dry basis)

分别从45和90日龄各组随机抽取4头犊牛，于晨饲前利用负压装置及胃管采集瘤胃液^[16]，4层纱布过滤，-20 ℃保存。

取瘤胃液解冻，用PHS-2C型酸度计测定瘤胃液pH，用靛酚比色法^[17]测定NH₃-N浓度。采用气相色谱仪测定VFA浓度，取瘤胃液5 mL，加入1 mL 25%偏磷酸溶液，混合均匀，冰水浴30 min，10 000×g离心10 min，取上清液，用GC-102-AF气相色谱仪测定VFA浓度，色谱柱为φ4(外)×2 m玻璃柱，固定相PEG-20M，涂布浓度为3%，载体为Chromsorb WAW DMCS；色谱柱温160 ℃，气化室温度200 ℃；空气压力0.12 MPa，氢气压力0.06 MPa，氮气压力0.08 MPa；氮气(载气)流速30 mL/min，氢气流速60 mL/min，空气流速360 mL/min；灵敏度10^-10，衰减16；进样量1 μL。采用外标法定量分析测定VFA的浓度。

瘤胃液滤纸酶、羧甲基纤维素酶、木聚糖、纤维二糖酶、淀粉酶和蛋白酶的活力按照Agarwal等^[18]的方法进行测定。滤纸酶活力定义为1 g酶水解反应中每分钟生成1 μmol葡萄糖的酶量。羧甲基纤维素酶活力定义为一定条件下每分钟从1 g羧甲基纤维素钠中降解1 μmol还原糖所需的酶量。木聚糖酶活力定义为一定条件下每分钟催化分解1 g木聚糖产生1 μmol木糖所需的酶量。纤维二糖酶活力定义为1 g酶水解反应中每分钟生成1 μmol还原糖所需的酶量。淀粉酶活力定义为每分钟水解1 mL淀粉生成1 μmol还原糖所需的酶量。蛋白酶活力定义为1 mL液体酶一定条件下每分钟水解酪素产生1 μg酪氨酸所需的酶量。

采用珠磨-溴化十六烷三甲基铵(CTAB)法提取瘤胃微生物DNA^[19]，由BeckmanDU-7500分光光度计在260 nm下测定DNA浓度。在GenBank上查找产琥珀酸丝状杆菌(F. succinogenes)、黄色瘤胃球菌(R. flavefaciens)、白色瘤胃球菌(R. albus)和溶纤维丁酸弧菌(B. fibrisolvens)的16S rDNA序列，利用Primer Premier 5.0 软件设计引物，交由北京六合华大基因科技股份 有限公司合成，引物序列信息见表2。采用Chromo 4^TM型荧光定量PCR仪进行定量分析。PCR反应体系20 μL：10 μL SYBR Premix Taq^TM Ⅱ，0.8 μL PCR Forward Primer，0.8 μL PCR Reverse Primer，0.4 μL ROX Reference Dye(50×)，2.0 μL DNA模板，6.0 μL dH₂O。反应条件：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；60 ℃，34 s；95 ℃，45个循环，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s。随后以0.1 ℃/s变化速度从65 ℃升至95 ℃，每隔3 s记录1次荧光值，获得循环阈值(CT)。

表 2

Table 2

表 2(Table 2)

表 2 引物序列信息 Table 2 Primer sequence information 纤维分解菌 Cellulolytic bacteria 产物大小 Product size/bp 引物序列 Sequence of primer (5′—3′) 退火温度 Annealing temperature/℃ 白色瘤胃球菌 R. albus 176 F：CCCTAAAAGCAGTCTTAGTTCG R：CCTCCTTGCGGTTAGAACA 60 黄色瘤胃球菌 R. flavefaciens 173 F：ATTGTCCCAGTTCAGATTGC R：GGCGTCCTCATTGCTGTTAG 60 产琥珀酸丝状杆菌 F. succinogenes 204 F：GGCGGGATTGAATGTACCTTGAGA R：TCCGCCTGCCCCTGAACTATC 60 溶纤维丁酸弧菌 B. fibrisolvens 136 F：TAACATGAGAGTTTGATCCTGGCTC R：CGTTACTCACCCGTCCGC 60

表 2 引物序列信息 Table 2 Primer sequence information

试验数据采用SPSS 17.0统计软件中的ANOVA程序进行方差分析和Duncan氏法多重比较。

由表3可知，与对照组相比，45和90日龄IB及IBFE组瘤胃液pH和NH₃-N浓度及丙酸/总挥发性脂肪酸均显著降低(P＜0.05)，试验组TVFA、乙酸、丙酸浓度及乙酸/总挥发性脂肪酸均显著提高(P<0.05)。IBFE较其他组显著降低了NH₃-N浓度(P<0.05)，显著提高了TVFA、乙酸、异丁酸浓度及乙酸/丙酸(P<0.05)。45日龄犊牛瘤胃液pH及丙酸/总挥发性脂肪酸显著高于90日龄(P<0.05)，而瘤胃液TVFA、乙酸、丙酸浓度，乙酸/总挥发性脂肪酸，乙酸/丙酸及NH₃-N浓度均显著低于90日龄(P<0.05)。

表 3

Table 3

表 3(Table 3)

表 3 纤维分解酶和异丁酸对犊牛瘤胃发酵指标的影响 Table 3 Effects of fibrolytic enzymes and isobutyrate on ruminal fermentation indices in calves 项目 Items 组别 Groups 标准误SEM P值 P-value 对照 Control FE IB IBFE pH 45日龄 45 days of age 7.42aA 7.15bA 6.81cA 6.51dA 0.078 0.021 90日龄 90 days of age 6.94aB 6.76aB 6.40bB 6.36bB 0.109 0.033 总挥发性脂肪酸 TVFA/(mmol/L) 45日龄 45 days of age 79.51cB 90.04bB 91.32bB 102.66aB 2.746 0.001 90日龄 90 days of age 99.81dA 114.56cA 138.77bA 156.76aA 6.616 0.001 乙酸 Acetate/(mmol/L) 45日龄 45 days of age 43.32cB 49.19bB 52.08bB 60.92aB 1.919 0.001 90日龄 90 days of age 63.35dA 73.88cA 95.92bA 106.35aA 5.164 0.002 丙酸 Propionate/(mmol/L) 45日龄 45 days of age 21.66bB 24.43aB 23.01aB 25.10aB 0.455 0.001 90日龄 90 days of age 25.14cA 28.37bA 29.31bA 34.90aA 1.067 0.039 丁酸 Butyrate/(mmol/L) 45日龄 45 days of age 10.30b 11.46ab 11.27ab 11.71a 0.221 0.001 90日龄 90 days of age 8.35c 8.46c 9.25b 10.71a 0.296 0.001 异丁酸 Isobutyrate/(mmol/L) 45日龄 45 days of age 1.42b 1.45b 1.53b 1.73a 0.039 0.037 90日龄 90 days of age 0.93c 1.00b 1.28a 1.31a 0.051 0.041 其他挥发性脂肪酸 Other VFAs/(mmol/L) 45日龄 45 days of age 2.81bA 3.51aA 4.42aA 3.19aA 0.022 0.013 90日龄 90 days of age 2.04cB 2.83bB 3.02aB 3.47aB 0.016 0.028 乙酸/总挥发性脂肪酸 Acetate/TVFA 45日龄 45 days of age 0.545cB 0.546cB 0.570bB 0.593aB 0.007 0.025 90日龄 90 days of age 0.635dA 0.645cA 0.691aA 0.678bA 0.009 0.031 丙酸/总挥发性脂肪酸 Propionate/TVFA 45日龄 45 days of age 0.272aA 0.271aA 0.252bA 0.245bA 0.005 0.032 90日龄 90 days of age 0.252aB 0.247bB 0.211cB 0.223bcB 0.006 0.029 乙酸/丙酸 Acetate/propionate 45日龄 45 days of age 2.00bB 2.01bB 2.36aB 2.42aB 0.060 0.046 90日龄 90 days of age 2.52bA 2.60bA 3.27aA 3.05aA 0.006 0.024 氨态氮 NH3-N/(μg/mL) 45日龄 45 days of age 24.36aB 20.64bB 19.74bB 11.50cB 1.435 0.021 90日龄 90 days of age 35.38aA 34.87abA 33.18bA 28.83cA 0.795 0.011 其他酸包含戊酸和异戊酸。同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，同列数据肩标不同大写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。 Other VFAs contained valerate and isovalerate. In the same row,values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05)； in the same column,values with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表 3 纤维分解酶和异丁酸对犊牛瘤胃发酵指标的影响 Table 3 Effects of fibrolytic enzymes and isobutyrate on ruminal fermentation indices in calves

由表4可知，与对照组相比，45和90日龄FE、IB及IBFE 3组均显著增加犊牛瘤胃液羧甲基纤维素酶、滤纸酶、纤维二糖酶及木聚糖酶的活力(P<0.05)，IBFE较其他组增幅最大。45日龄犊牛瘤胃液羧甲基纤维素酶、滤纸酶酶、纤维二糖酶、蛋白酶、淀粉酶及木聚糖酶的活力显著低于90日龄(P<0.05)；对照组与FE组断奶前犊牛瘤胃液果胶酶活力显著高于断奶后(P<0.05)。

表 4

Table 4

表 4(Table 4)

表 4 纤维分解酶和异丁酸对犊牛瘤胃液纤维分解酶活力的影响 Table 4 Effects of fibrolytic enzymes and isobutyrate on ruminal fluid fibrolytic enzyme activities in calves 项目 Items 组别 Groups 标准误 SEM P值 P-value 对照 Control FE IB IBFE 羧甲基纤维素酶 CMCase/[μmol/(g·min)] 45日龄 45 days of age 0.027bB 0.035aB 0.036aB 0.038aB 0.001 0.016 90日龄 90 days of age 0.076cA 0.101bA 0.100bA 0.126aA 0.007 0.003 滤纸酶 Filter paper enzyme/[μmol/(g·min)] 45日龄 45 days of age 0.027bB 0.038aB 0.041aB 0.042aB 0.002 0.001 90日龄 90 days of age 0.062cA 0.118bA 0.130aA 0.131aA 0.009 0.001 纤维二糖酶 Cellobiase/[μmol/(g·min)] 45日龄 45 days of age 0.028bB 0.035aB 0.036aB 0.040aB 0.001 0.030 90日龄 90 days of age 0.067bA 0.089aA 0.097aA 0.102aA 0.005 0.014 木聚糖酶 Xylanase/[μmol/(g·min)] 45日龄 45 days of age 0.054cB 0.120bB 0.126bB 0.136aB 0.010 0.001 90日龄 90 days of age 0.147cA 0.162bA 0.160bA 0.179aA 0.004 0.001 蛋白酶 Protease/[μg/(mL·min)] 45日龄 45 days of age 2.176B 2.372B 2.075B 2.271B 0.141 0.001 90日龄 90 days of age 4.729A 4.796A 4.922A 5.018A 0.069 0.003 淀粉酶 Amylase/[g/(mL·min)] 45日龄 45 days of age 0.037B 0.041B 0.045B 0.047B 0.002 0.001 90日龄 90 days of age 0.063A 0.071A 0.076A 0.077A 0.003 0.001 果胶酶 Pectase/[μmol/(g·min)] 45日龄 45 days of age 0.221A 0.237A 0.239B 0.237B 0.003 0.008 90日龄 90 days of age 0.207cB 0.230bB 0.244bA 0.274aA 0.006 0.014

表 4 纤维分解酶和异丁酸对犊牛瘤胃液纤维分解酶活力的影响 Table 4 Effects of fibrolytic enzymes and isobutyrate on ruminal fluid fibrolytic enzyme activities in calves

由表5可知，与对照组相比，45和90日龄FE、IB及IBFE 3组均显著提高了犊牛瘤胃液产琥珀酸丝状杆菌、白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌及溶纤维丁酸弧菌的量(P<0.05)，IBFE组增幅最大。45日龄犊牛瘤胃白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌的量显著低于90日龄(P<0.05)。

表 5

Table 5

表 5(Table 5)

表 5 纤维分解酶和异丁酸对犊牛瘤胃液纤维分解菌量的影响 Table 5 Effects of fibrolytic enzymes and isobutyrate on the amount of ruminal cellulolytic bacteria in calves 项目 Items 组别 Groups 标准误 SEM P值 P-value 对照 Control FE IB IBFE 45日龄 45 days of age 0.228c 0.278b 0.273bB 0.339aB 0.016 0.033 90日龄 90 days of age 0.229c 0.295b 0.301bA 0.371aA 0.015 0.002 白色瘤胃球菌 Ruminococcus albus 45日龄 45 days of age 0.046bB 0.070aB 0.080aB 0.084aB 0.004 0.001 90日龄 90 days of age 0.142cA 0.164bA 0.170bA 0.185aA 0.016 0.035 黄色瘤胃球菌 Ruminococcus flavefaciens 45日龄 45 days of age 0.055bB 0.067aB 0.065aB 0.079aB 0.004 0.047 90日龄 90 days of age 0.120cA 0.145bA 0.169bA 0.210aA 0.012 0.039 溶纤维丁酸弧菌 Butyrivibrio fibrisolvens 45日龄 45 days of age 0.200c 0.266b 0.257b 0.320a 0.011 0.001 90日龄 90 days of age 0.220c 0.261b 0.259b 0.320a 0.009 0.001

表 5 纤维分解酶和异丁酸对犊牛瘤胃液纤维分解菌量的影响 Table 5 Effects of fibrolytic enzymes and isobutyrate on the amount of ruminal cellulolytic bacteria in calves

犊牛饲料中添加异丁酸和纤维分解酶有效改善了瘤胃发酵，具体表现为乙酸/丙酸和TVFA浓度的增加。乙酸/丙酸的增加主要是由于在犊牛饲粮中添加纤维分解酶与异丁酸后乙酸/总挥发性脂肪酸迅速增加且乙酸/丙酸未增加或增加缓慢导致的。研究发现，饲料中添加纤维分解酶能够改善瘤胃发酵，增加TVFA和乙酸浓度，乙酸/丙酸也有所增长^[10]。犊牛饲料中添加异丁酸增加瘤胃液乙酸的产量，这与早期饲喂试验的研究结果一致^[20]。IB组瘤胃液pH和NH₃-N浓度降低，TVFA浓度增加，这与Liu等^[11]的研究结果一致，研究表明随着异丁酸添加量的增加TVFA浓度呈直线上升趋势。丁酸是刺激瘤胃发酵的主要影响因素^{[2, 3]}，试验中添加纤维分解酶刺激丁酸的产生进而刺激瘤胃的发育并刺激纤维分解菌的产生。纤维分解菌中的氮主要来源于NH₃-N^[21]，FE、IB及IBFE 3组瘤胃液NH₃-N浓度降低表明有更多的氮转变为微生物蛋白。体内外发酵试验表明随纤维素酶的增加NH₃-N浓度减少，微生物蛋白质的合成增加^{[7, 11]}。

在犊牛饲料中添加FE、IB及IBFE增强了羧甲基纤维素酶、纤维二糖酶、木聚糖酶和果胶酶的活力，同时微生物活力也有所增强。羧甲基纤维素酶、纤维二糖酶、木聚糖酶和果胶酶的活力的增强可归结于纤维分解酶添加后VFA浓度的增加。Liu等^[9]研究发现在犊牛饲料中添加异戊酸导致羧甲基纤维素酶与木聚糖酶活力呈直线增长。添加纤维分解酶^[22]或异丁酸^[8]改善了瘤胃消化率与中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、半纤维素和纤维素的消化率，刺激了羧甲基纤维素酶、纤维二糖酶和木聚糖酶的产生，进而提高了酶的活力。IB组瘤胃液淀粉酶和蛋白酶的活力与对照组相比没有显著差异，这与Liu等^[9]人的研究结果一致。FE与IBFE组瘤胃液淀粉酶和蛋白酶的活力与对照组相比也没有显著差异。断奶前犊牛果胶酶活力高于断奶后的原因有待进一步研究验证。

饲养试验中FE、IB及IBFE组瘤胃液中产琥珀酸珀丝状杆菌、白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌和溶纤维丁酸弧菌的量增加，有研究表明添加纤维素酶后产琥珀酸丝状杆菌数量增加^[10]。Liu等^[9]研究发现随着肉牛饲料中异位酸添加量的增加瘤胃主要纤维分解菌呈直线增长。添加异丁酸或纤维分解菌提高了瘤胃干物质的消化率^[22]，IBFE组的主要纤维分解菌量比IB组和FE组高，可能是异丁酸与纤维分解酶复合使用效果更好。断奶后主要纤维分解菌数量高于断奶后，这可能是由于断奶前后饲喂物质的不同导致的^[23]，增加饲料纤维含量能够增加瘤胃液纤维分解菌与半纤维分解菌的活力^[24]。然而，Nsereko等^[25]研究指出在泌乳奶牛饲料中添加纤维分解酶增加了瘤胃内分解纤维素和半纤维素的细菌量，但是对纤维分解菌的量没有影响。Colombatto等^[26]研究表明酶的增加会引起总活菌数的增加，但是对纤维分解菌数量没有影响。Mao等^[10]研究发现添加纤维素酶对白色瘤胃液球菌和黄色瘤胃球菌的数量没有影响。这些研究结果不一致可能是因为添加酶的种类、动物的饲喂方式、酶的添加方法以及动物的生产水平不同导致的^[27]。

① 在断奶前后犊牛饲粮中添加FE、IB及IBFE能够增加瘤胃液的TVFA浓度并能转换瘤胃的发酵模式产生较多的乙酸。

② 瘤胃液NH₃-N浓度随着FE、IB及IBFE的添加而降低。

③ 随着添加FE、IB及IBFE的添加瘤胃液微生物酶活力也得到增强。

④ FE、IB及IBFE的添加有效改善了瘤胃发酵和微生物酶活力，提高了纤维分解菌的量。

⑤ 添加FE、IB能够刺激瘤胃纤维分解菌，同时IB与FE在促进瘤胃液纤维分解菌增殖方面有协同作用。