饲料养分在动物体内主要依靠消化酶的水解而被消化，而消化酶的水解能力又由其活性决定，因此，探讨消化液中主要消化酶的活性与饲粮养分消化率间的相关性，对了解饲粮养分消化的影响因素有重要意义。目前，人们对消化酶活性与饲粮养分消化之间关系的认识不一致。从育种和比较营养学的角度看，胰腺或肠液中消化酶的活性越高表明动物的消化能力越强^{[1, 2]}，因而消化酶的活性与饲粮养分消化率呈正相关关系。而从营养生理学的角度看，成年动物分泌进入消化道的消化酶相对于饲粮底物是过量的^{[3, 4]}，那么消化酶 的活性与饲粮养分消化率间无显著相关性，或当 饲粮因素引起消化酶的过量分泌又会导致内源性损失的增加^{[5, 6]}，消化酶的活性与饲粮养分消化率间甚至会呈负相关关系。为了进一步阐明生长猪在饲喂典型饲粮条件下空肠消化液中主要消化酶的活性是否是影响养分消化的关键因素，探讨肠液中消化酶的活性与饲粮养分消化率间的相关性是解释这一问题的主要手段。为此，本试验在2种典型饲粮条件下，以试验猪为观测单元，首先分析同一条件下猪空肠液中主要消化酶的活性(自变量，X)与饲粮养分消化率(因变量，Y)的变异程度，然后再分析两者之间的相关关系，为饲粮养分消化影响因素的研究提供参考。

选择体重(25.8±1.4) kg的大×长二元杂交去势公猪8头，在代谢笼中单笼饲养。适应1周后在空肠前段，离幽门后170 cm的肠段上安装T型瘘管，术后待意识清醒并可自由行走后转入代谢笼中饲养，护理2周后开始试验^[7]。代谢室卫生管理按动物营养学国家重点实验室常规程序进行。

根据NRC(2012)生长猪营养需要量推荐值，配制玉米-豆粕型饲粮和玉米-玉米干酒糟及其可溶物(DDGS)-米糠粕型饲粮，其组成及营养水平参见表1。试验期间每天08:00和16:00拌湿饲喂饲粮，自由饮水。每期试验包括预试期5 d，日采食量按照418.6 kJ/kg BW^0.75进行投喂。正试期8 d，按照预饲期饲喂量的90%提前1 d一次性分装全部饲粮，并同步采集饲粮样品储存于-20 ℃中。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 试验饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) % 项目 Items 玉米-豆粕型饲粮 Corn-soybean meal diet 玉米-玉米DDGS-米糠型饲粮 Corn-corn DDGS-rice bran diet 原料 Ingredients 玉米 Corn 61.09 50.40 豆粕 Soybean meal 28.72 17.99 麦麸 Wheat bran 3.00 玉米干酒糟及其可溶物 Corn DDGS 17.10 米糠粕 Rice bran meal 8.00 豆油 Soybean oil 3.29 2.51 石粉 Limestone 0.80 1.02 磷酸氢钙 CaHPO4 0.87 0.61 食盐 NaCl 0.30 0.30 L-赖氨酸 L-Lys 0.09 0.24 蛋氨酸 Met 0.04 色氨酸 Trp 0.03 硅藻土 Celite 0.80 0.80 预混料 Premix 1.00 1.00 合计 Total 100.00 100.00 营养水平 Nutrient levels 实测值 Measured values 干物质 DM 92.33 91.49 总能 GE/(kJ/g) 17.67 17.59 消化能 DE/(kJ/g) 15.33 14.59 粗蛋白质 CP 19.84 19.75 粗纤维 CF 3.36 5.32 粗脂肪 EE 6.57 7.10 盐酸不溶灰分 Hydrochloric acid insoluble ash 0.96 1.03 计算值 Calculated values 钙 Calcium 0.60 0.60 总磷 Total phosphorus 0.60 0.60 总赖氨酸 Total Lys 1.00 1.00 总蛋氨酸 Total Met 0.30 0.30 总色氨酸 Total Trp 0.21 0.21 总苏氨酸 Total Thr 0.68 0.67 预混料为每千克饲粮提供Premix provided the following per kg of diets：VA 8 250 IU，VD3 825 IU，VE 40 IU，VK3 4 mg，VB1 1.0 mg，VB2 5 mg，VB6 2 mg，VB12 25 μg，泛酸 pantothenic acid 15.0 mg，烟酸 nicotinic acid 35.0 mg，叶酸 folic acid 2 mg，生物素 biotin 4 mg，氯化胆碱 choline chloride 600 mg，Cu (as copper sulfate) 50.0 mg，Fe (as ferrous sulfate) 80.0 mg，Zn (as zine sulfate) 100.0 mg，Mn (as manganese sulfate) 25.0 mg，Se (as sodium selenite) 0.15 mg，I (as potassium iodide) 0.5 mg。

表1 试验饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis)

为了尽可能多地获得饲喂2种饲粮条件下猪空肠液中消化酶活性与饲粮养分消化率的重复观测数据，采用2×2完全交叉设计，将8头生长猪随机分为2组，每组4头，在60～100日龄和100～140日龄各进行2期试验，每期试验交叉饲喂2种试验饲粮。根据交叉设计的原理，统计分析得出在猪每个生长阶段内，试验期对饲粮养分消化率及空肠液中4种消化酶的活性影响均不显著(P>0.05)，因此，将交叉设计试验中每期每种饲粮获得的4个观测重复数累计，形成每种饲粮8个重复观测数据；t检验进一步分析表明，生长猪日龄对空肠液中消化酶活性和饲粮养分消化率的影响也不显著(P>0.05)，因此，在相关性分析中去除生长阶段这一因素，形成每种饲粮16个重复观测数据。

在每期试验第6天的09:00至第11天的09:00，准确收集每头猪每日排粪量并混合均匀，65 ℃烘干后回潮24 h，根据四分法取样并储存于-20 ℃中；每期试验的第11和13天的09:00—10:00和17:00—18:00通过自制的带有低温冷存功能的自封袋从瘘管处连续收集空肠食糜样品，每个时间点收集完成后将每头猪的肠液样品分开混匀，并立即于4 ℃、2 800 r/min离心10 min，待离心结束后取上清液混匀分装于1.5 mL离心管中，-20 ℃下储存待测。

饲粮与粪样中的干物质含量参照GB/T 6435—2006的方法测定；总能值参照ISO 9831：1998的方法，使用Parr 6400全自动绝热式氧弹计测定；粗蛋白质含量参照GB/T 6432—1994方法，使用KDY-9820凯氏定氮仪测定；盐酸不溶灰分含量参照GB/T 23743—2009的灼烧处理法测定。

进行消化酶活性测定时，先将肠液样品于冷水浴解冻后充分混合，并以去离子水稀释至所需浓度。其中淀粉酶活性(U/mL)的测定参考Dahlqvist^[8]的方法，测定原理为：可溶性淀粉经淀粉酶作用后的还原物质与3，5-二硝基水杨酸可形成有颜色的络合物，在530 nm下，络合物颜色的深浅与还原物质的量呈线性关系；胰蛋白酶活性(U/mL)的测定参考Wirnt^[9]的方法，测定原理为：对-甲苯磺酸-L-精氨酸乙酯经胰蛋白酶水解成的对-甲苯磺酸-L-精氨酸在247 nm下吸光度值的变化与酶促反应起始速度具有一定的相关性；糜蛋白酶活性(U/mL)的测定参考Wirnt^[10]的方法，测定原理为：苯甲酰-L-酪氨酸乙酯经糜蛋白酶水解成的苯甲酰-L-酪氨酸在256 nm下吸光度值的变化与酶促反应起始速度具有一定的相关性。脂肪酶活性(U/mL)采用DiaSys试剂盒以酶比色法进行测定(YZB/GER 1970-2012)；肠液中总蛋白含量(μg/mL)采用Thermo总蛋白试剂盒以BCA法进行测定(Pierce,Rockford,IL,美国)。

采用SAS 9.2的MEANS模块计算自变量——空肠液中淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶的活性及因变量——饲粮干物质、粗蛋白质和总能消化率的平均值、变异系数和极差，以考察自变量与因变量的变异范围。采用成组法t检验对2种饲粮条件下的消化酶活性进行差异性检验。而2种饲粮养分消化率的差异因在原料组成及营养水平设置上相差较大，不具有可比性，因此，不进行差异显著性统计检验。根据Kim等^[11]研究猪个体的排空时间与其对应的养分消化率间相关性的统计原理，本试验在考察同一饲粮条件下猪个体内小肠液中消化酶的活性与其对应的饲粮养分消化率的关系上，采用CORR模块分析猪空肠液中消化酶活性与饲粮养分消化率间的简单相关关系。采用Cancorr模块分析猪空肠液中4种消化酶活性与饲粮养分(干物质、粗蛋白质、总能)消化率间的典型相关关系。酸不溶灰分法测定饲粮养分消化率的计算参考王钰明等^[12]的研究结果。

由表2可知，在饲喂玉米-豆粕型饲粮条件下，16头次试验猪空肠液中淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶的活性平均值分别为195.64、62.93、7.52和4.69 U/mL，组内变异系数分别为25.50%、20.80%、20.29%和32.19%，组内极差分别为145.15、43.05、5.10和6.32 U/mL；在饲喂玉米-玉米DDGS-米糠粕型饲粮条件下，16头次试验猪空肠液中淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶的活性平均值分别为181.53、61.33、7.20和5.08 U/mL，组内变异系数分别为18.84%、22.43%、13.59%和28.02%，组内极差分别为115.68、49.62、3.34和5.07 U/mL。由于2种饲粮条件下4种消化酶的活性组内变异都较大，因此饲粮组间的差异不显著(P>0.05)。在饲喂玉米-豆粕型饲粮条件下，16头次试验猪对饲粮中干物质、粗蛋白质和总能消化率分别为87.22%、88.35%和87.41%，组内变异系数均在1.44%以内，组内极差分别为3.11%、4.17%和4.99%。在玉米-玉米DDGS-米糠粕型饲粮条件下，16头次试验猪对饲粮的干物质、粗蛋白质和总能消化率分别为81.99%、83.39%和82.72%，组内变异系数均在1.35%以内，组内极差分别为1.98%、3.82%和1.00%。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 生长猪空肠液中消化酶的活性及饲粮养分消化率 Table 2 Digestive enzyme activity of jejunal fluid and nutrient digestibility of diets in pigs 项目Items 玉米-豆粕型饲粮 Corn-soybean meal diet 玉米-玉米DDGS-米糠粕型饲粮 Corn-corn DDGS-rice bran diet 平均值 Mean 变异系数 CV/% 极差 Range 平均值 Mean 变异系数 CV/% 极差 Range 消化酶活性 Enzyme activity/(U/mL) 淀粉酶 Amylase 195.64 25.50 145.15 181.53 18.84 115.68 胰蛋白酶 Trypsin 62.93 20.80 43.05 61.33 22.43 49.62 糜蛋白酶 Chymotrypsin 7.52 20.29 5.10 7.20 13.59 3.34 脂肪酶 Lipase 4.69 32.19 6.32 5.08 28.02 5.07 养分表观消化率 Apparent digestibility of nutrients/% 干物质 DM 87.22 0.84 3.11 81.99 0.72 1.98 粗蛋白质 CP 88.35 1.44 4.17 83.39 1.35 3.82 总能 GE 87.41 1.20 4.99 82.72 0.37 1.00

表2 生长猪空肠液中消化酶的活性及饲粮养分消化率 Table 2 Digestive enzyme activity of jejunal fluid and nutrient digestibility of diets in pigs

由表3可知，在饲喂玉米-豆粕型饲粮条件下，猪空肠液中淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性与饲粮干物质、粗蛋白质和总能的消化率均无显著相关性(|r|≤0.31；P>0.05)，脂肪酶的活性与上述养分的消化率呈显著正相关(|r|≥0.56；P<0.05)；饲喂玉米-玉米DDGS-米糠粕型饲粮条件下，猪空肠液中胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性与饲粮干物质、粗蛋白质和总能的消化率均无显著相关性(|r|≤0.24；P>0.05)，淀粉酶的活性与饲粮干物质消化率呈正相关趋势(r=0.51；P<0.10)，而与其他养分的消化率无显著相关性(|r|≤0.18；P>0.05)；脂肪酶活性与干物质消化率呈显著负相关(r=-0.51；P<0.05)，而与其他养分的消化率无显著相关性(|r|≤0.32；P>0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 生长猪空肠液中消化酶的活性与饲粮养分消化率的简单相关分析 Table 3 The correlation between digestive enzyme activity of jejunal fluid and nutrient digestibility of diets in pigs 项目Items 玉米-豆粕型饲粮 Corn-soybean meal diet 玉米-玉米DDGS-米糠粕型饲粮 Corn-corn DDGS-rice bran diet 干物质 DM 粗蛋白质 CP 总能 GE 干物质 DM 粗蛋白质 CP 总能 GE 淀粉酶 Amylase -0.06 0.02 0.27 0.51* 0.18 -0.08 胰蛋白酶 Trypsin -0.18 0.08 -0.29 -0.19 -0.15 -0.21 糜蛋白酶 Chymotrypsin -0.10 -0.31 0.18 0.11 -0.24 -0.06 脂肪酶 Lipase 0.63* * 0.59* * 0.56* * -0.51* * -0.25 -0.32 *:P<0.10;* *:P<0.05.

表3 生长猪空肠液中消化酶的活性与饲粮养分消化率的简单相关分析 Table 3 The correlation between digestive enzyme activity of jejunal fluid and nutrient digestibility of diets in pigs

以猪空肠液中4种消化酶的活性作为1组自变量，以干物质、粗蛋白质和总能的消化率作为1组因变量，对2组变量进行典型相关分析。由表4可知，在饲喂玉米-豆粕型饲粮和玉米-玉米DDGS-米糠粕型饲粮条件下，均未有典型变量的相关性达到显著水平(P>0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 生长猪空肠液中消化酶的活性与饲粮养分消化率的典型相关分析 Table 4 The canonical correlation between digestive enzyme activity of jejunal fluid and nutrient digestibility of diets in pigs 项目Items 玉米-豆粕型饲粮 Corn-soybean meal diet 玉米-玉米DDGS-米糠粕型饲粮 Corn-corn DDGS-rice bran diet1) 系数 Coefficient2) 相关系数 Correlation coefficient3) 系数 Coefficient2) 相关系数 Correlation coefficient3) 消化酶活性 Enzyme activity (X) 淀粉酶 Amylase -0.144 5 -0.149 0 0.809 7 0.720 3 胰蛋白酶 Trypsin -0.072 6 -0.235 1 -0.657 9 -0.619 8 糜蛋白酶 Chymotrypsin -0.888 6 -0.266 8 -0.227 1 -0.512 3 脂肪酶 Lipase 1.113 3 0.650 6 0.150 8 -0.711 9 养分消化率 Digestibility of nutrient (Y) 干物质 DM 0.714 4 0.957 0 0.684 4 0.698 6 粗蛋白质 CP 0.387 2 0.885 7 0.687 1 0.727 6 总能 GE -0.053 7 0.495 9 0.057 2 0.383 5 典型相关系数 Canonical correlation 0.928 8 0.784 4 P值 P-value 0.179 5 0.704 5 贡献率 Proportion/% 84.39 69.15 1)玉米-豆粕型饲粮和玉米-玉米DDGS-米糠粕型饲粮均无典型相关变量,因此此处仅列出第1对典型变量。The first canonical variable is listed because of there is no significant canonical variables in corn-soybean meal diet and corn-corn DDGS-rice bran diet. 2)系数为原始数据的典型变量系数。Coefficient of canonical variable. 3)相关系数是指典型变量与原始变量间的相关系数。Correlation coefficient between the canonical variable and original variable.

表4 生长猪空肠液中消化酶的活性与饲粮养分消化率的典型相关分析 Table 4 The canonical correlation between digestive enzyme activity of jejunal fluid and nutrient digestibility of diets in pigs

空肠液中的消化酶主要来源于胃和胰腺分泌的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶及少量肠腺分泌的肠肽酶、二糖酶等^[13]，其中淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶的活性是研究消化液中酶活性的主要检测指标^{[14, 15]}。在动物的肠液中，上述4种消化酶的活性受品种、生长阶段和饲粮养分等诸多因素的影响。Aumaitre等^[16]的研究指出生长猪在60日龄后体内各消化器官逐渐发育成熟，消化道内消化酶活性趋于稳定。本试验的前期结果也表明，不同饲粮条件下2个生长阶段消化酶活性和养分消化率差异均不显著，因此每个饲粮条件下不同生长阶段的数据可以合并形成更多重复。Mourot等^[17]测定20头猪胰腺中淀粉酶、糜蛋白酶和脂肪酶比活的结果表明个体间变异系数分别为20.49%、12.20%和17.10%。胡光源等^[7]的试验结果表明，生长猪空肠液中淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶的活性组内重复的变异系数分别为23.30%、13.27%、13.70%和14.13%，由于组内变异较大，饲粮的蛋白质来源与水平都未引起肠液中上述4种消化酶活性的显著性变异，这表明生长猪空肠液中的消化酶活性对饲粮的蛋白质来源与水平具有较强的适应性。本研究中，猪空肠液中4种主要消化酶活性的组内(个体间)变异系数都在20%以上，2种饲粮组间未引起消化酶活性的显著性差异。综合上述结果可以推断，在正常的饲粮营养水平范围内，生长猪个体间消化酶的活性具有较大的差异，并且这一差异可能大大高于饲粮因素引起的消化酶活性的变异。

根据国家标准《畜禽饲料有效性与安全性评价 全收粪法测定猪饲料表观消化能技术规程》(GB/T 26438—2010)^[18]的规定，用于测定饲粮表观消化能的试验猪体重应在30～70 kg，这表明在该体重范围内试验猪测定的养分消化率的数据是稳定的，也就是说试验猪生理条件的差异并未增加饲粮养分消化率测定结果的固有变异。Paredes等^[19]的研究结果也表明，同日龄、同品种体重分别为30和18.8 kg的2组生长猪在消化道的长度、消化器官的质量(或相对体重的比例)等生理指标上尽管有显著差异，但是，在饲粮干物质、粗蛋白质及总能的消化率上均无显著差异。由上述结果可以推断，在规范化测定条件下，试验猪个体间在饲粮养分消化率测定的变异上是稳定的。McCarthy等^[20]的试验结果也表明，采用盐酸不溶灰分法测定生长猪对小麦-豆粕型饲粮的总能和氮的消化率时，试验猪个体差异引起的变异系数分别为1.80%和2.29%。本研究中，2种饲粮干物质、粗蛋白质及总能的消化率的组内(动物个体间)变异系数均在1.5%以内，并且符合国家标准方法(GB/T 26438—2010)^[18]中相对偏差不超过5%的测定精度要求。这表明，尽管试验猪个体在生理上(消化酶活性、体重等)存在差异，但个体间饲粮养分消化率的差异较小。

动物体内分泌的消化酶受饲粮摄入量、饲粮营养成分等营养因素的影响^{[3, 21, 22]}，胰腺、食糜或肠液中消化酶的活性不仅存在采样的日内、日间变异，且动物个体间的差异也较大^[23]，本试验对试验猪采用多日、日内多次重复采样，因此消化酶活性的变异主要来自动物个体间的变异。从本试验结果看，生长猪(30～70 kg)个体间空肠液中4种主要消化酶活性的变异系数均在20%以上，其对饲粮养分消化率的变异系数均在1.5%以内，属于生物学法允许的误差范围，这表明消化酶活性相对于饲粮底物可能是过量的^[24]。相关分析进一步显示，饲喂2种饲粮条件下，猪空肠液中淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性与饲粮养分消化率均无显著相关性，表明这3种消化酶对饲粮底物是过量的，足够将正常饲喂条件下不同营养水平的饲粮充分消化。而脂肪酶活性与饲粮养分消化率虽然呈中低度相关，但在2种饲粮中表现的结果不一致，表明在这4种消化酶中脂肪酶可能对饲粮养分消化率的变异有一定的贡献。但从典型相关分析的结果看，4种消化酶的活性与饲粮干物质、粗蛋白质及总能的消化率在总体上并无相关性，表明脂肪酶对饲粮养分消化率变异的贡献有限。

① 饲喂2种饲粮条件下，生长猪个体间4种消化酶活性的变异系数均在20%以上，而饲粮干物质、粗蛋白质和总能的消化率的变异系数均在1.5%以内。

② 猪空肠液中淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性与饲粮养分消化率无显著相关性，而脂肪酶活性与饲粮养分消化率有一定的相关性，但对养分消化率变异的贡献有限。