蛋壳质量是禽蛋品质的重要性状指标之一，蛋壳品质的好坏直接影响到禽蛋的收集、分级、包装、运输等。据统计，因蛋壳质量问题造成的鸡蛋损失率高达10%～15%^[1]。我国每年因蛋壳破损造成的经济损失在5亿元左右^[2]。不同遗传种质资源的蛋鸡产蛋蛋壳性状有所差异，饲粮营养因素也是影响蛋鸡产蛋蛋壳质量的重要影响因素之一。通过营养手段来调控蛋壳品质的研究主要集中在饲粮钙、磷含量及不同配比上^[3]。但随着蛋壳在蛋鸡体内形成机制及主要影响因素的深入研究，发现除饲粮钙、磷等营养元素的供应外，锌、锰等微量元素是蛋壳形成过程中多种酶的组分，对蛋壳的形成及质量具有重要调控作用^[4]。相关研究已证实饲粮额外添加适宜锌、锰等微量元素可以有效的改善蛋壳质量，但微量元素多以无机化合物的形式添加，蛋鸡，尤其是产蛋后期对其吸收、利用率低，导致其随粪便大量排出，造成环境污染^[5]。然而，氨基酸等有机物螯合的微量元素具有易吸收、利用率高等优点，可以替代无机化合微量元素^[6]。因此，本试验研究饲粮添加不同水平有机锌、锰对产蛋中后期海兰褐蛋鸡蛋壳品质的影响，为有机替代无机微量元素在蛋鸡生产上提供资料参考。

试验于江苏宜兴某规模化蛋鸡养殖场，选择600只65周龄海兰褐商品蛋鸡，随机分成5组，每组6个重复，每个重复20只鸡。采用层叠式笼养，每笼3只鸡，每日喂料3次，自由采食和饮水。采用白炽灯补足每日光照16 h，自动控温、通风。试验于2015年3月16日至4月21日进行，预试期1周，正试期4周。

试验基础饲粮以玉米、豆粕、菜籽粕等为主要原料，参考NRC(1994)蛋鸡营养需要确定饲粮营养水平，基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) % 原料 Ingredients 含量 Content 营养水平 Nutrient levels3) 含量 Content 玉米 Corn 64.00 代谢能 ME/(MJ/kg) 12.03 豆粕 Soybean meal 22.00 粗蛋白质 CP 18.97 菜籽粕 Rapeseed meal 3.00 粗纤维 CF 3.34 石粉 Limestone 8.20 钙Ca 4.13 磷酸氢钙 CaHPO4 1.40 有效磷 AP 0.45 食盐 NaCl 0.35 蛋氨酸 Met 0.39 预混料 Premix1) 1.00 赖氨酸 Lys 0.87 锌和锰 Zn and Mn2) 0.05 合计 Total 100.00 1)预混料为每千克饲粮提供Premix provided the following per kilogram of the diet: Fe 6 500 mg,Cu 500 mg,Se 12 mg,Co 58 mg,I 35 mg,VA 7 500 IU,VB1 2.5 mg,VB2 4.3 mg,VB6 4.7 mg,VB12 0.01 mg,VD3 2 530 IU,VE 17 IU,VK 22.1 mg,泛酸钙 calcium pantothenate 5.1 mg,烟酸 nicotinic acid 20 mg,叶酸folic acid 1 mg,生物素 biotin 0.2 mg,胆碱 choline 500 mg。 2)各组饲粮锌和锰添加水平见表2。Supplemental levels of Zn and Mn in each group diet were shown in Table 2. 3)代谢能为计算值，其余为测定值。ME was a calculated value,while the others were measured values.

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis)

对照组以无机微量元素硫酸锌(含锌35%)及硫酸锰(含锰31.8%)添加；试验组以有机微量元素羟基蛋氨酸锌(含锌16.9%)及羟基蛋氨酸锰(含锰13.8%)添加，设置4组，并且保证添加无机微量元素的对照组与添加低水平有机微量元素组锌、锰添加水平相同。各组饲粮锌和锰添加水平见表2。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 各组饲粮锌和锰添加水平 Table 2 Supplemental levels of Zn and Mn in each group diet mg/kg 组别 Groups 添加水平 Supplemental levels 锌 Zn 锰 Mn 对照 Control 6.00 3.00 1 6.00 3.00 2 11.00 8.00 3 16.00 13.00 4 21.00 18.00

表2 各组饲粮锌和锰添加水平 Table 2 Supplemental levels of Zn and Mn in each group diet

正试期间，于每日08：00时，记录产蛋数和破蛋数；试验结束后，每个重复取20枚蛋，测定蛋壳强度、蛋壳厚度等蛋壳品质指标，并将测定的蛋壳保留，用于蛋壳微观结构观察及蛋壳元素组成分析；试验结束后，每个重复采集10只鸡全血，装入含纤维蛋白酶促凝剂采血管，随即4 ℃，3 000 r/min离心5 min，分离获得血清，-80 ℃保存，用于血清碳酸酐酶(CA)活性及钙、磷含量测定。

根据每日产蛋数及破蛋数记录，以周次为时间范围，计算正试期每周破蛋率变化情况，具体计算公式如下：

破蛋率(%)=(各重复破蛋数/各重复总产蛋数)×100。

采用蛋壳厚度测定仪(Model P-1，Ozaki MFG，日本)测定收集鸡蛋样品横径与纵径交界处蛋壳厚度；采用英国TSS蛋品质测定系统QC-SPA蛋壳强度测定仪测定蛋壳强度。

蛋壳的超微结构用扫描电子显微镜观察。将用于蛋壳厚度测量的蛋壳部位用清水冲洗，使蛋壳内外表面无污染物黏附，并保留壳膜，60 ℃烘干。将待测蛋壳送至扬州大学测试中心，利用德国BALTEC-SCD500型离子溅射刻蚀仪镀金，XL30-ESEM(Philips)型环境扫描电子显微镜扫描，观察蛋壳外表面裂纹及断面情况。

将血清样品送至扬州市疾病预防控制中心，利用全自动血液生化分析仪(日立7000)比色法测定血清钙和磷含量；血清碳酸酐酶活性通过购买上海岚派生物CA-Elisa Kit(REF：DRE60061)测定。

试验数据经Excel 2013整理后利用Dixon检验对试验数据作取舍，采用SPSS 13.0软件中单因素方差分析模块进行方差分析，利用Polynomial考察趋势变化，并用Duncan氏法进行多重比较。P<0.05表示差异显著。

由表3可知，破蛋率、蛋壳强度随有机微量元素添加水平呈线性变化(P<0.05)。相比对照组，添加不同水平有机微量元素锌、锰的试验组在破蛋率、蛋壳强度及蛋壳厚度方面均出现了显著差异(P<0.05)。其中，破蛋率方面，组2显著低于对照组(P<0.05)，其他试验组破蛋率在数值上低于对照组，但未见显著差异(P>0.05)；蛋壳强度方面，试验组均显著高于对照组(P<0.05)，但各试验组间均未出现显著差异(P>0.05)；蛋壳厚度方面，组2显著高于对照组及组3(P<0.05)，其余组间则未见显著差异(P>0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 饲粮添加有机锌、锰对蛋壳品质的影响 Table 3 Effects of diet supplemented with organic trace minerals Zn and Mn on eggshell quality 项目Items 组别 Groups SEM P值 P-value 对照Control 1 2 3 4 线性 Liner 二次 Quadratic 破蛋率 Broken rate/% 0.96a 0.89ab 0.81b 0.91ab 0.87ab 0.054 0.043 0.144 蛋壳强度Eggshell strength/(kg/cm2) 3.21b 3.57a 3.60a 3.56a 3.60a 0.152 0.004 0.861 蛋壳厚度Eggshell thickness/mm 0.366b 0.373ab 0.376a 0.366b 0.372ab 0.004 0.121 0.535 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。 Values in the same row with different small letter superscripts differ significantly(P<0.05). The same as below.

表3 饲粮添加有机锌、锰对蛋壳品质的影响 Table 3 Effects of diet supplemented with organic trace minerals Zn and Mn on eggshell quality

由图1可知，不同有机微量元素添加水平对蛋壳表面微观结构有显著的影响。在500倍的视野下可以清楚地观察到，对照组蛋壳表面裂纹较多，且以气孔为中心向外呈发散状。相对于对照组，各试验组蛋壳表面裂纹相对较少，蛋壳晶体结合紧密。其中以组2裂纹最少，其次为组4、组3和组1。进一步地，在2 000倍视野下可观察到单位面积视野中对照组可见裂纹单一，裂纹沟壑深且宽广。组1和组3可见裂纹稍多，密集程度降低，裂纹裂面窄，沟壑浅，且以组3较好。组2和组4视野可见裂纹相比其他组更细，未见明显沟壑，其中组2较好。

图1(Figure 1)

Fig. 1

图1 蛋壳表面超微结构(上500×，下2 000×) Fig. 1 The ultra-microstructure of eggshell surface (above 500×，below 2 000×)

由图2可知，各组蛋壳断面构造存在差异。对照组断面平整性差，晶体层和栅栏层结构的致密程度明显低于各试验组，乳突层结构错乱且与蛋壳内表面纤维层连接不紧密，有一定空隙；4个试验组中，乳突层排列整齐度由高到低依次为组2、组4、组3和组1；组3晶体层和栅栏层结构的整齐度及致密度明显好于组1；另外，组2和组4断面整齐，晶体层和栅栏层结构致密，质地均一，与蛋壳内表面纤维层连接紧密，为各组中效果最好。

图2(Figure 2)

Fig. 2

图2 蛋壳断面超微结构(250×) Fig. 2 The ultra-microstructure of eggshell cross section (250×)

由表4可知，血清碳酸酐酶活性和血清钙含量与有机锌、锰添加水平存在二次关系(P<0.05)，血清磷含量则与有机锌、锰添加水平未见线性或二次关系(P>0.05)。3个指标在各组间均出现了显著差异(P<0.05)。组2和组4血清碳酸酐酶活 性显著高于对照组及其他试验组(P<0.05)，其余组间碳酸酐酶活性无显著差异(P>0.05)。血清钙含量以组2最高，组4次之，对照组最低，且组2显著高于其余各组(P<0.05)。血清磷含量以组4最高，显著高于组2(P<0.05)，其他组间则无显著差异(P>0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 饲粮添加有机锌、锰对蛋鸡血液生化指标的影响 Table 4 Effects of diet supplemented with organic trace minerals Zn and Mn on blood biochemical indexes of laying hens 项目Items 组别 Groups SEM P值 P-value 对照Control 1 2 3 4 线性 Liner 二次 Quadratic 碳酸酐酶 CA/(ng/mL) 75.00b 62.89b 139.01a 60.75b 141.32a 10.55 0.327 0.000 钙 Ca/(mmol/L) 4.15c 4.21c 5.47a 4.40c 4.85b 0.08 0.001 0.001 磷 P/(mmol/L) 2.42ab 2.40ab 2.32b 2.45ab 2.53a 0.02 0.631 0.419

表4 饲粮添加有机锌、锰对蛋鸡血液生化指标的影响 Table 4 Effects of diet supplemented with organic trace minerals Zn and Mn on blood biochemical indexes of laying hens

微量元素锌、锰等是多种酶的组分，参与蛋鸡机体生长代谢，并对蛋壳的形成过程有重要影响^[4]。集约化商品蛋鸡养殖中蛋鸡生产强度大，基础代谢旺盛，而基础饲粮中锌、锰含量低，因此饲粮中需要额外添加，以补充基础饲粮中的不足。Moreng等^[7]通过向饲粮添加不同剂量的蛋氨酸锌，研究其对蛋鸡蛋壳品质及生产性能的影响，结果表明饲粮添加锌可以显著提高蛋壳强度、蛋壳重量及蛋壳厚度。本试验中，有机锌、锰添加的试验组相比无机锌、锰添加的对照组破蛋率降低，蛋壳厚度和强度均不同程度提高，且试验组蛋壳强度均显著高于对照组，与上述研究结果有着一致性。另外，破蛋率和蛋壳厚度方面组2分别显著低于和高于对照组，说明有机锌、锰添加水平分别为11.00和8.00 mg/kg时效果最佳。本研究也与薛颖等^[5]研究不同有机和无机复合微量元素对蛋鸡蛋壳品质影响发现有机锌、锰添加水平为17.00和10.00 mg/kg时可以显著提高蛋壳强度的结果相一致。但孙秋娟等^[8]研究饲粮添加羟基蛋氨酸螯合锌、锰对蛋鸡蛋壳品质的影响却发现，相对于以无机化合物形式添加的锌、锰，有机锌、锰的添加并没有显著地提高蛋壳厚度及强度。这可能与其锌、锰添加水平及使用蛋鸡周龄有关。其试验中有机和无机锌、锰的添加水平均为30.00 mg/kg，添加水平明显高于本试验添加水平，足够满足蛋鸡生产需要，造成效果无显著差异。此外，其试验选择的产蛋中期蛋鸡，对锌、锰等微量元素的吸收利用效率要优于本试验中选用的产蛋中后期蛋鸡，造成使用效果差异不显著。

一般认为，蛋壳强度与蛋壳厚度呈正相关^[9]。而章世元等^[10]在蛋壳厚度差异不显著情况下，统计蛋壳强度变化却发现，即使蛋壳厚度不存在显著差异，但蛋壳强度仍存在显著性差异，认为这可能与蛋壳超微结构不同有关。本试验中除组2显著高于对照组外其余各组蛋壳厚度组间均无显著差异，但蛋壳强度却显著高于对照组，一定程度上可佐证以上研究的正确性。Bain等^[11]同样认为蛋壳强度不能通过简单的厚度测量来定义，而与蛋壳的致密度密切相关；具体地，蛋壳强度和蛋比重愈大，蛋壳致密度愈高，耐撞击能力愈强，破蛋率愈低。扫描电镜下观察到的蛋壳断面超微结构可直观反映蛋壳致密程度，本试验中各有机锌、锰添加组相比对照组断面整齐致密，其中组2和组4各层次结构最为致密，与其强度较高相符。Bain等^[11]已证实乳突层有效厚度与蛋壳强度存在显著的负相关。本试验中对照组乳突层延展厚度和乳突间隙都较大，组1和组3次之，组2和组4最小，与以上研究结论相一致。另外，同类研究表明微量元素锰可以改变蛋壳晶体沉积的形态，并通过影响蛋壳结晶的质地，影响蛋壳的机械性能^[12]。本试验中，饲粮添加有机锌、锰使得蛋壳内晶体排列更加紧密，晶体较小且分布均匀，阻止了表面裂缝的延伸，其中组2表面裂纹最细最少，而对照组裂纹最多，裂纹沟壑深且宽广。因此，饲粮添加锌可通过改善蛋壳的微观结构，提高蛋壳的机械性能，改善蛋壳品质。

有关蛋壳在蛋鸡体内形成过程研究，发现对蛋壳厚度及强度起关键作用的矿物元素主要包括钙、锌、锰3种^[13]。蛋壳钙化过程中依赖碳酸酐酶催化水和二氧化碳形成碳酸氢根离子，其中锌是该酶的重要组分，锌的缺乏会严重影响到该酶的合成量和活性^[14]。本试验研究发现组2和组4血清碳酸酐酶活性显著高于其他各组，相对应的其蛋壳强度数值上也相对较大。然而，添加有机锌、锰的组1与组3血清碳酸酐酶活性虽与对照组相比未见显著差异，但数值上却小于对照组，而其蛋壳强度却显著高于对照组，这可能与各组血清碳酸酐酶活性差异有关^[15]。另外，本试验测定了血清钙、磷含量，发现组2和组4钙和磷含量均相对较高，且比例更接近2 ∶ 1，说明组2和组4有机锌、锰的添加有效地维持了血清钙磷平衡，有利于蛋鸡的吸收及向蛋壳中的转运沉积。

在产蛋中后期海兰褐蛋鸡每千克饲粮中添加有机微量元素锌11.00 mg、锰8.00 mg能够显著地降低鸡蛋的破蛋率，增加蛋壳厚度，改善蛋壳微观结构、提高蛋壳质量。