方格星虫，俗名“沙虫”，是一种广泛分布于我国沿海滩涂地带的高级海产品，其中以广西北部湾海区资源最为丰富，由于其对生长环境十分敏感，一旦环境污染则不能成活，因此常作为一种环境标志生物。方格星虫营养价值丰富，同时还具有多种药理作用，被美誉为“海洋中的冬虫夏草”^{[1, 2]}。目前，广西北部湾地区的方格星虫主要以半人工养殖为主，即将人工养殖苗种投放在自然海滩上长成成虫，养殖周期为1.5~2.0年。此种养殖方式较为粗放，年产量也越来越不能满足方格星虫的市场需求，因此探寻方格星虫规模化养殖方式已成为方格星虫产业化的关键问题。

在实现规模化养殖的过程中，方格星虫的高效环保饲料研制是关键的一步，广西海洋研究所自2009年来一直致力于相关方面的研究，目前已得到方格星虫饲料配方中三大营养物质以及微量元素铁的相关数据^{[3, 4, 5, 6, 7, 8]}，并继续在饲料其他微量元素含量等方面进行深入研究。锰是生物必需微量元素之一，它不仅主动参与氧化还原过程，还与生物的组织呼吸、骨骼生长以及一些内分泌活动息息相关。生物体内有锰参与构造的金属酶并不多，但是它却是很多酶的激活剂。因此，本试验开展了饲料微量元素锰含量对方格星虫生长、体成分、体腔液中锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)活性以及锰在稚虫体内分布特点的研究，为方格星虫高效环保饲料中锰的最适含量提供理论基础。

试验所用的方格星虫取自广西海洋研究所海水增养殖基地，为同批人工孵化苗种，自然状态下体长在1.25~1.83 cm之间，每条平均体重为(17.11±0.12) mg。制作饲料之前，分别对各原料进行蛋白质、脂肪以及能值的测定，作为制订和调整饲料配方的依据。基础饲料主要由酪蛋白、明胶、鱼油、糊精、卵磷脂、褐藻酸钠、微晶纤维素、维生素预混料组成，其组成及营养水平见表1。用蛋氨酸锰来调节试验饲料中的锰含量，设计饲料中锰的添加梯度分别为0、6、12、18、24、36 mg/kg。蛋氨酸锰含锰量为15%，所以，每千克基础饲料中蛋氨酸锰的添加量分别为0、40、80、120、160、240 mg。经测定，6种试验饲料中锰的实际含量分别为3.45、8.26、15.98、23.16、28.67、33.83 mg/kg。试验饲料制作加工过程参照Blair等^[9]介绍的方法，具体如下：先将主要原料粉碎过300目筛，按照添加量的多少从低至高逐级称重并混合均匀，与鱼油搓匀之后再加少量水搓匀，烘干粉碎制成过100目筛的微颗粒饲料，装袋标号备用。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) % 项目 Items 含量 Content 原料 Ingredients 酪蛋白 Casein 40.00 明胶 Gelatin 10.00 鱼油 Fish oil 8.00 糊精 Dextrin 20.00 卵磷脂 Lecithin 2.00 褐藻酸钠 Sodium alginate 3.00 维生素预混料 Vitamin premix1) 1.50 微晶纤维素 Microcrystalline cellulose 14.00 无锰矿物质预混料 Mineral premix without manganese2) 1.50 合计 Total 100.00 营养水平 Nutrient levels 粗蛋白质 CP 44.33 粗脂肪 EE 9.12 粗灰分 Ash 9.26 总能 GE/(MJ/kg) 19.92 1)维生素预混料为每千克饲料提供Vitamin premix provided the following per kg of the diet：VD 2 400 IU，VE 100 mg，VK l mg，VC 70 mg，VB1 0.5 mg，VB2 7 mg，VB6 6 mg，VB12 1 mg，D-泛酸 D-pantothenic acid 32.6 mg，烟酸 nicotinic acid 28 mg，生物素 biotin 1 mg，叶酸 folic acid 7.5 mg，肌醇 inositol 440 mg。 2)无锰矿物质预混料为每千克饲料提供Mineral premix without manganese provided the following per kg of the diet：CuSO4·5H2O 75 mg，ZnSO4·7H2O 300 mg，MgSO4·7H2O 1 525.5 mg，Ca(H2PO4)2 4 125 mg，CaCO3 3 000 mg，KI 750 mg，FeSO4·7H2O 750 mg，Al2(SO4)3·6H2O 6 mg，NaCl 1 200 mg，Na2SeO3·H2O 0.75 mg，CoCl2·6H2O 45 mg，沸石粉 zeolite 3 216.75 mg。

表1 基础饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis)

饲料制作完毕之后进入养殖试验阶段，养殖时间为2013年8至2013年10月，养殖周期为8周。试验选用相同规格(65 cm×55 cm×45 cm)的18个水槽，均匀地在水槽的底部铺设3～4 cm厚的细沙(细沙取自北海竹林盐场海滩，使用前用淡水彻底清洗消毒再由海水浸泡1 d)，加水深约20 cm，此为方格星虫稚虫的栖息场所。选用体重相近、健康无病的方格星虫稚虫7 200条，以400条为1个重复，3个重复为1组，随机分成6组，分别饲喂6种锰含量不同的人工微颗粒饲料。投喂方法为过量投喂，即保证沙子表面有少量未食用完全的饲料。饲养采用自然光照周期，24 h连续微充氧，水温维持在26~30 ℃，盐度维持在18~22，溶解氧浓度大于5.0 mg/L。

饲养阶段结束后，将方格星虫稚虫转移至海水深为10 cm左右的无沙水槽中停食吐沙2 d，之后收集各水槽内的稚虫并称重，称重后于液氮中快速冷冻，转移至-80 ℃超低温冰箱中保存。称重的同时记录稚虫的成活条数，用以计算各组的成活率。

成活率(survival rate,SR,％)=100×N_t／N₀；

增重率(weight gain rate,WGR,％)=100×(W_t-W₀)／W₀；

特定生长率(specific gain rate,SGR,％／d)=100×(lnW_t-lnW₀)／t。

式中：N₀为初始投放条数；N_t为终末存活条数；W₀为初始体重；W_t为终末体重；t为试验天数。

采用AOAC(1995)的方法分析试验方格星虫稚虫体成分和饲料常规成分。其中，水分含量采用105 ℃烘箱烘干至恒重法测定，粗蛋白质含量采用凯氏定氮法(Kjeltec 8400，瑞典)测定，粗脂肪含量采用索氏抽提法(Soxtec 2050，瑞士)测定，粗灰分含量采用550 ℃马福炉中灼烧(12 h)法测定。

采用GB/T 13885—2003方法进行体壁(解剖剪剪开后去除内脏和体腔液所得)和虫体锰含量的测定。具体方法如下：将样品经550 ℃马福炉灰化，用浓盐酸溶解残渣并稀释定容，然后导入原子吸收分光光度计(4510F，上海仪电分析)的空气-乙炔火焰中，测定锰的吸光度，并与锰校正溶液的吸光度比较定量。

方格星虫稚虫体腔液中Mn-SOD活性采用南京建成生物工程研究所研制的试剂盒测定。酶活性用比活力(U/mg prot)表示。

采用SPSS 13.0对所得数据进行方差分析，若差异达到显著水平，则进行Tukey’s多重比较，显著水平为P<0.05。数据以平均值±标准误表示。

由表2可知，方格星虫稚虫的增重率和特定生长率随着饲料中锰含量的升高而呈现出先上升后下降的趋势，在锰含量为23.16 mg/kg时增重率、特定生长率达到最高，显著高于最低和最高锰含量组(P＜0.05)，锰含量为3.45 mg/kg时方格星虫稚虫的特定生长率最低。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 饲料中锰含量对方格星虫稚虫生长性能的影响 Table 2 Effects of dietary manganese content on growth performance of juvenile peanut worm,Sipunculus nudus Linnaeus 锰含量Manganese content/(mg/kg) 初始体重IBW/mg 终末体重FBW/mg 增重率WGR/% 特定生长率SGR/(%/d) 成活率SR/% 3.45 17.18±0.27 43.57±1.30a 153.45±4.54a 1.66±0.03a 73.58±2.48a 8.26 16.49±0.33 46.45±1.11ab 181.65±1.14bc 1.85±0.01bc 79.50±2.52ab 15.98 17.52±0.16 50.32±0.49bc 187.34±4.76bc 1.88±0.03bc 83.67±1.26bc 23.16 17.04±0.46 52.06±1.08c 205.83±8.39c 1.99±0.05c 85.83±0.98bc 28.67 17.22±0.21 48.38±1.13abc 181.02±6.12bc 1.84±0.04bc 90.25±1.39c 33.83 17.22±0.12 48.04±0.94abc 178.96±3.50b 1.83±0.02b 88.67±1.21c P值 P-value 0.273 0.001 0.001 <0.001 <0.001 同列数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。 In the same column,values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表2 饲料中锰含量对方格星虫稚虫生长性能的影响 Table 2 Effects of dietary manganese content on growth performance of juvenile peanut worm,Sipunculus nudus Linnaeus

在8周的饲养试验期间，各组方格星虫稚虫的成活率在73.58%～90.25%之间，饲料锰含量对成活率有极显著影响(P＜0.01)。随着饲料中锰含量的升高，方格星虫稚虫的成活率呈现先升后降的趋势，在锰含量为28.67 mg/kg时成活率达到最高，且显著高于锰含量为3.45、8.26 mg/kg时(P＜0.05)。

经回归分析(图1)，增重率(y)与饲料中锰含量(x)的二次曲线回归方程为： y=-0.132 9x²+5.595 9x+138.52(R²=0.820 4)。由回归方程得出，当增重率达到极值时，饲料中锰含量为22.36 mg/kg。

图1(Figure 1)

Fig. 1

图1 饲料中锰含量与方格星虫稚星虫增重率的回归分析 Fig. 1 Regression analysis between dietary manganese content and WGR of juvenile peanut worm, Sipunculus nudus Linnaeus

由表3可知，饲料锰含量对虫体水分、粗灰分及粗蛋白质含量无显著影响(P＞0.05)。虫体粗脂肪含量则随饲料中锰含量的升高呈现出先上升后下降的趋势，在锰含量为28.67 mg/kg时达到最高，且饲料锰含量为3.45和8.26 mg/kg的组虫体粗脂肪含量显著低于其余各组(P<0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 饲料锰水平对方格星虫稚星虫体成分的影响 Table 3 Effects of dietary manganese content on body composition of juvenile peanut worm,Sipunculus nudus Linnaeus % 锰含量Manganese content/(mg/kg) 水分Moisture 粗蛋白质CP 粗脂肪EE 粗灰分Ash 3.45 78.67±0.32 69.01±0.80 2.07±0.18a 22.09±0.86 8.26 79.19±0.60 69.35±1.27 2.36±0.10a 21.43±1.48 15.98 78.90±0.49 69.90±0.23 3.15±0.19b 21.14±1.27 23.16 79.44±0.51 70.24±0.65 3.28±0.14b 21.74±1.88 28.67 79.67±0.11 70.53±0.83 3.30±0.16b 19.93±1.43 33.83 79.16±0.48 70.15±0.53 3.11±0.10b 21.10±1.18 P值 P-value 0.670 0.747 <0.001 0.911 粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分含量为干物质基础。 CP,EE and ash contents were DM basis.

表3 饲料锰水平对方格星虫稚星虫体成分的影响 Table 3 Effects of dietary manganese content on body composition of juvenile peanut worm,Sipunculus nudus Linnaeus

由表4可知，饲料中锰含量对方格星虫稚虫虫体锰含量有显著影响(P＜0.05)，虫体锰含量随着饲料中锰含量的升高而升高，在锰含量为33.83 mg/kg时达到最高。饲料锰含量对方格星虫稚虫体壁锰含量无显著影响(P>0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 饲料锰含量对方格星虫稚虫组织锰含量及体腔液中Mn-SOD活性的影响 Table 4 Effects of dietary manganese content on manganese content in tissues and coelomic fluid Mn-SOD activity of juvenile peanut worm,Sipunculus nudus Linnaeus 锰含量 Manganese content/(mg/kg) 体壁锰 Body wall manganese/(μg/g) 虫体锰 Body manganese/(μg/g) 体腔液中Mn-SOD Coelomic fluid Mn-SOD/(U/mL) 3.45 16.10±0.73 13.69±0.61a 15.77±0.90a 8.26 17.88±0.66 15.32±0.50ab 16.96±0.99ab 15.98 18.55±1.02 15.42±0.86ab 20.03±0.90abc 23.16 18.89±0.61 16.73±0.41ab 22.20±1.18bcd 28.67 19.03±1.01 16.89±0.84ab 26.23±1.44d 33.83 19.81±0.61 17.16±0.75b 24.98±1.38cd P值 P-value 0.081 0.028 <0.001

表4 饲料锰含量对方格星虫稚虫组织锰含量及体腔液中Mn-SOD活性的影响 Table 4 Effects of dietary manganese content on manganese content in tissues and coelomic fluid Mn-SOD activity of juvenile peanut worm,Sipunculus nudus Linnaeus

由表4可知，饲料锰含量对方格星虫稚虫体 腔液中Mn-SOD活性有显著影响(P＜0.05)，方格星虫稚虫体腔液中Mn-SOD活性随着饲料中锰含量的升高呈现出先上升后下降的趋势，在锰含量为28.67 mg/kg时达到最高，且显著高于饲料锰含量为3.45、8.26和15.98 mg/kg时(P＜0.05)。

锰为生命必需的微量元素，水生动物锰的摄取来源由两部分组成，一是水中溶解的锰离子，二是饲料中添加的锰元素。通常水中的锰离子很微量，并不能满足水生动物在生长发育过程中对锰的需求，因此，通过日常饲粮供给锰源来维持水生动物正常的代谢活动非常必要^{[10, 11]}。

不同的水产动物对锰的需求量不同，在一定范围内添加能促进生长。本试验中方格星虫获得最大增重率和特定生长率的饲料锰含量为21.05 mg/kg，比鳗鲡(Anguilla japonica)的15 mg/kg^[12]、1龄草鱼(Ctenopharyngodon idellus)的15 mg/kg^[13]、草鱼种的10 mg/kg^[14]要高，比黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)的60 mg/kg^[15]和斑点叉尾 (Ictalurus punctatus)的25 mg/kg^[16]要低。佐藤秀一^[17]的研究表明，虹鳟((Oncorhynchus mykiss)饲料中锰的最小添加量为15 mg/kg。董晓慧等^[18]在对南美白对虾(Penaeus vannamei Boone)的研究中指出，锰源和锰含量对南美白对虾的生长性能都有显著影响，以硫酸锰为锰源时，饲料锰含量维持在30 mg/kg较好；以甘氨酸锰为锰源时，饲料锰含量为10 mg/kg时就能取得较好养殖效果。陈冬梅等^[19]的研究表明，鲤鱼(Cyprinus carpio)饲料中铜、铁、锌、锰在一定比例下能使鲤鱼获得最大的生长优势，最适比例为铜23.5 mg/kg、铁141.7 mg/kg、锌89.0 mg/kg、锰31.8 mg/kg。赵振山等^[20]研究了团头鲂(Megalobrama amblycephala)中锰的补充量为12.9 mg/kg，当补充量大于25.8 mg/kg时生长受阻。蒋蓉^[21]通过4因素3水平正交试验的研究表明，在其他微量元素配合下黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)饲料中锰的补充量为153.08 mg/kg时能获得最大增重率和最低饲料系数。魏万权等^[22]研究发现，基础饲料中含锰9.19 mg/kg，向其中添加10 mg/kg锰时牙鲆(Paralichthys)幼鱼生长最快，当补充量为30 mg/kg时生长明显下降。本试验结果基本与上述学者的研究结果类似，在饲料中添加适量的锰能促进方格星虫稚虫的生长，当锰含量由3.45 mg/kg上升至23.16 mg/kg时，增重率和特定生长率都持续增长，之后再继续升高饲料锰含量，增重率和特定生长率缓慢下降。造成这种现象的原因可能是锰可以通过动物体内酶的作用来参与碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢。早在1984年，Romanenko^[23]的研究就指出锰能促进蛋白质合成，锰不仅在生物体内是精氨酸酶、脯氨酸酶、RNA聚合酶、丙酮酸羧化酶等的组成成分，也是磷酸化酶、胆碱酯酶、转移酶类、水解酶类等多种酶类的激活因子，另外，锰还作为合成胆固醇的辅助因子，在类脂化合物的代谢过程中起重要作用。方格星虫血液中氧载体为含铁的金属蛋白蚯蚓血红蛋白^[1]，锰能改善微量元素铜的利用，而铜又可以调节机体对微量元素铁的吸收和利用，从而促进生长；但是过量的锰可能导致动物体内的铁储备减少，这可能会造成蚯蚓血红蛋白与氧分子结合量下降，影响了方格星虫的正常生长代谢，从而使得高锰含量组增重率和特定生长率低于其余各组^[24]。另外，各种微量元素被机体吸收具有拮抗作用，饲料中锰含量过高必定影响其他微量元素的吸收，这可能也是导致高锰含量饲料反而使得方格星虫稚虫的生长发育受阻的原因之一。

本试验中，随着饲料中锰含量的增加，方格星虫稚虫体成分中的粗蛋白质、水分和粗灰分含量没有显著差异，但粗脂肪含量各组间有显著差异。井明艳等^[11]在锰的生物学功能及有机态锰的应用研究中指出锰具有特殊的促进机体内脂肪利用的作用，是有效减少猪背膘厚的有效方法之一，但实际上本试验结果显示，高锰含量饲料导致方格星虫稚虫体内粗脂肪含量升高，由于本试验并未对锰在方格星虫稚虫体内的代谢途径进行研究，因此，饲料中锰含量对方格星虫稚虫生长影响的具体机制还有待进一步的研究。

本试验中，虫体锰含量随着饲料中锰含量的升高而升高，体壁锰含量也有增高的趋势，这与在斑点叉尾 ^[16]和牙鲆^[22]上的研究结果类似。研究发现，提高牙鲆幼鱼饲料中的锰含量，其肌肉和骨骼中锰的含量明显上升^[22]。锰在体内新陈代谢中参与磷酸化过程，锰化合物可使氧化作用增强，从而提供给机体的能量增多，有利于生长^[22]。

动物体内的2种超氧化物歧化酶(SOD)分别为Mn-SOD和铜锌超氧化物歧化酶(CnZn-SOD)，SOD的主要作用是催化超氧阴离子(O^-₂)歧化为过氧化氢和氧气，从而保护了富含不饱和脂肪酸的生物膜免受O^-₂的侵害。SOD活性与水生动物的免疫水平密切相关，在非特异性免疫中，生物体抗氧化防御是第1道防线，而SOD活性的高低反映了机体清除O^-₂的能力，也就意味着SOD活性越高，机体清除O^-₂的能力越强^{[12, 25]}。王宏伟等^[26]在饲料中锰含量对日本沼虾(Macrobrachium mipponensis)抗氧化酶活性的影响研究中发现，在投喂锰含量为150 μg/g的饲料后，日本沼虾的O^-₂值降低，SOD活性升高；并且锰对日本沼虾体内的SOD活性的影响并不完全呈持续上升趋势，而是具有明显的剂量效应，饲料中锰含量过高或过低都会使Mn-SOD活性受到影响。在中华米虾(Caridina denticulata sinensis)的研究中，饲料中锰含量对米虾体内SOD活性不仅具有剂量效应，还具有时间效应。该研究对比分析了用不同锰含量饲料喂养2个月以及3个月后中华米虾体内SOD的活性，结果显示：在一定时间内，饲料中锰含量为0.26 mg/g时对中华米虾体内SOD的激活作用显著，但超过一定质量浓度，就会降低SOD的活性；并且各组在2个月时测得的SOD活性均比3个月时的高，饲料锰含量越高这种差异越明显^[27]。本研究与上述学者的研究结果相似，饲料中锰含量对方格星虫稚虫体腔液中Mn-SOD活性有显著影响，且体腔液中Mn-SOD活性随着饲料中锰含量的升高呈现出先上升后下降的趋势，在锰含量为28.67 mg/kg时达到最高。分析其原因可能是饲料中锰含量低的组，方格星虫稚虫从饲料中摄取的锰较少，缺少锰使得SOD结构稳定性下降，不能充分发挥其作为酶的活性中心或激发酶活性的作用，这样SOD的活性必然下降。当锰少量进入体内时，生物体内脂质过氧化作用会增强，使得这一代谢的产物丙二醛(MDA)含量增加，机体的内自稳机制会使体内抗氧化能力出现代偿性增强，血清SOD活性代偿性增高；体内的锰元素会随着新陈代谢及时排出体外，因此机体的脂质过氧化作用并不会持续增强^{[26, 27]}。另外，过量的锰还会影响其他金属元素的摄入，从而导致生物体内环境发生改变，也会使一些酶活性降低。因此，饲料中添加锰一定要适量。

在饲料中适量添加锰可以促进方格星虫稚虫的生长发育，改变锰含量对方格星虫稚虫的增重率、特定生长率、成活率、虫体粗脂肪含量、虫体锰含量、体腔液中Mn-SOD活性有显著影响。以蛋氨酸锰为饲料锰源，当增重率达到极值时，饲料中锰含量为22.58 mg/kg。