2. 潍坊工商职业学院, 诸城 262234;
3. 中国农业大学动物科技学院, 动物营养学国家重点实验室, 北京 100193
, WANG Aina2, TANG Jun1, CHEN Daiwen1, QIAO Shiyan3, YU Bing1, HE Jun1, ZHENG Ping1, YU Jie1, LUO Junqiu1
2. Weifang Business Vocational College, Zhucheng 262234, China;
3. State Key Laboratory on Animal Nutrition, College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193, China
轮状病毒(rotavirus，RV)是一种分段的双链RNA病毒，且是诱导婴幼儿和幼龄动物严重胃肠炎和腹泻的主要病原之一。而RV的流行病学表明，仔猪对其极为易感，初生仔猪感染RV的死亡率可达100%[1]。已有的研究表明，RV感染可影响幼儿血液中淋巴细胞亚群、抗体、细胞因子和补体的含量[2, 3]；本课题组前期的研究也表明，RV感染可以显著提高断奶仔猪血清中免疫球蛋白(Ig)G、白细胞介素(IL)-2和IL-6的含量，降低了血清中IL-4的含量，并通过影响维甲酸诱导基因Ⅰ信号通路显著干扰了断奶仔猪体内先天性免疫[4, 5]。近年的研究发现，鼠李糖乳酸杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG，LGG)可调节动物和人的免疫功能[6, 7, 8]，并可调节RV感染婴幼儿和小鼠的免疫功能[9, 10]。而以无菌新生仔猪作为新生儿模型的进一步研究表明，灌服LGG可改善机体免疫功能，提高RV弱毒苗免疫对人RV攻毒仔猪的保护作用[11, 12, 13, 14]。但目前对于LGG补充是否可缓解RV感染影响正常断奶仔猪免疫功能尚未见报道。因此，本试验目的在于考察饲粮中添加LGG对RV感染仔猪免疫功能的影响，并结合其对机体蛋白质代谢的影响，探讨其改善仔猪生长性能的可能机制，以期为生产中LGG应用于缓解病毒感染干扰仔猪的免疫功能和蛋白质代谢，进而促进其生长提供试验支撑。
1 材料与方法 1.1 试验材料LGG菌粉：1010 CFU/g，脱脂乳包被(中国农业大学农业部饲料工业中心提供)。
RV：OSU毒株(G5P9)(ATCC#VR-893)，购自国家兽医微生物菌种保藏管理中心。
1.2 试验动物与设计试验选取24头平均体重约为6.69 kg健康的21日龄断奶的“杜×长×大”仔猪，采用2×2两因素设计，即LGG处理(饲粮添加109 CFU/kg LGG或不添加LGG)和RV感染(灌服RV或无菌培养液)。全部仔猪采用代谢笼单笼饲养。试验第1天空腹称重后，将所有仔猪根据体重相近原则随机分为2个处理，每个处理12个重复，每个重复1头猪，分别饲喂添加109 CFU/kg LGG或不添加LGG的饲粮。试验第15天空腹称重后，所有仔猪均灌服100 mmol/L NaHCO3溶液5 mL，每个饲粮处理中随机选取6头仔猪口服RV(1.4×107 TCID50/mL)3 mL，剩余仔猪口服无菌最小必需培养基(MEM)3 mL。攻毒后，试验共分成了4个处理，每个处理6个重复，每个重复1头猪。试验全期为19 d。
1.3 试验饲粮及营养水平试验基础饲粮为玉米-豆粕型，参照NRC(2012)7~11 kg阶段猪营养需要配制。试验饲粮为基础饲粮中添加109 CFU/kg LGG或不添加LGG构成，添加的LGG等量替代基础饲粮中的玉米。基础饲粮组成及营养水平见表1。
 | 表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basia) |
试验在四川农业大学动物营养研究所教学试验基地代谢室进行。正式试验前预饲喂2 d，使仔猪适应饲粮和饲养环境。猪舍温度控制在27~30 ℃，湿度不高于80%，每天饲喂4次(08:00、12:00、16:00、20:00)，以每次采食后料槽有少量余料为度，每天记录数据。所有仔猪自由饮水，试验期间消毒、清扫按常规程序进行，并保持猪舍通风、清洁。 1.5 RV培养
本试验按文献[15]提供的方法，选用恒河猴肾细胞(MA104)进行RV OSU毒株的培养和强化。主要的试验方法简述如下：MA104细胞使用含有10%胎牛血清的MEM进行培养，待细胞长到70%~80%时接种病毒，37 ℃感染2 h，随后补足MEM无血清培养基培养3~5 d，收集病毒。将以上收集的RV重复上述步骤数次，当接种病毒后72 h，70%以上细胞出现明显细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)，收集病毒，测定毒力，-80 ℃保存备用。
1.6 测定指标及方法 1.6.1 生长性能以重复为单位，于试验第1、15和20天对所有的猪进行空腹称重，并记录每日的采食量，用于计算仔猪的平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)、平均日增重(average daily gain，ADG)和料重比(feed/gain，F/G)。
1.6.2 样品采集试验第20天对所有仔猪空腹进行前腔静脉采血10 mL，2 mL于乙二胺四乙酸二钠(EDTA)抗凝管，8 mL置于普通离心管。普通离心管中的血液于低温下静置30 min，3 000 r/min离心15 min制备血清，于-20 ℃保存备用。
1.6.3 血清尿素氮血清尿素氮含量采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定，操作按说明书进行。
1.6.4 免疫功能取EDTA抗凝血，按文献[4]提供的试验方法使用流式细胞仪分别计数外周血中CD3+、CD4+和CD8+ T淋巴细胞亚群数量，并计算CD4+/CD8+。血清中的IgG、IgM、IgA、细胞因子(IL-2和IL-4)和轮状病毒特异性抗体(rotavirus specific antibody，RV-Ab)含量采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒测定，所有ELISA试剂盒均购自TSZ公司，操作按说明书进行。
1.7 数据处理与分析试验数据采用Excel 2007进行初步整理，试验前2周的生长性能数据采用SAS 8.0软件进行t检验；其余数据采用SAS 8.0软件中两因子方差分析，模型主效应包括RV攻毒和LGG以及二者之间的互作，差异显著后进行Duncan氏法多重比较，各指标以重复为单位进行统计。以P＜0.05为差异显著判断标准，以P＜0.10为有差异趋势判断标准。数据以“平均值±标准误”表示。
2 结 果 2.1 饲粮添加LGG和/或RV攻毒对断奶仔猪生长性能的影响从表2中可以看出，试验第1~14天和第15~19天，饲粮添加LGG均显著影响了仔猪的F/G(P＜0.05)，对ADFI和ADG无显著影响(P＞0.05)。攻毒后(试验第15~19天)，RV感染显著提高了F/G(P＜0.05)，对ADFI和ADG无显著影响(P＞0.05)；而与对照组RV感染仔猪相比，试验组显著降低了RV感染仔猪的F/G(P＜0.05)。
| 表 2 饲粮添加LGG和/或RV攻毒对断奶仔猪生长性能的影响 Table 2 Effects of dietary LGG supplementation and/or RV challenge on growth performance of weaning piglets |
从表3中可以看出，RV攻毒显著提高了断奶仔猪血清尿素氮的含量(P＜0.05)；饲粮添加LGG 显著降低了断奶仔猪血清尿素氮含量(P＜0.05)；而与对照组RV感染仔猪相比，试验组显著降低了RV感染仔猪的血清尿素氮含量(P＜0.05)。
| 表 3 饲粮添加LGG和/或RV攻毒对断奶仔猪血清尿素氮含量的影响 Table 3 Effects of dietary LGG supplementation and/or RV challenge on serum urea nitrogen content of weaning piglets |
从表4中可以看出，RV攻毒显著降低了断奶仔猪血液中CD3+和CD4+ T淋巴细胞数量及CD4+/CD8+(P＜0.05)；饲粮添加LGG有提高断奶 仔猪血液中CD4+ T淋巴细胞数量的趋势(P=0.09)；而与对照组RV感染仔猪相比，试验组显著提高了RV感染仔猪血液中CD4+ T淋巴细胞数量(P＜0.05)。
| 表 4 饲粮添加LGG和/或RV攻毒对断奶仔猪血液中T淋巴细胞亚群的影响 Table 4 Effects of dietary LGG supplementation and/or RV challenge on sub-group of T lymphocytes in blood of weaning piglets |
从表5中可以看出，RV攻毒显著降低了断奶仔猪血清中IgG、IgA和IL-4的含量(P＜0.05)，显著提高了断奶仔猪血清中IL-2和RV-Ab的含量(P＜0.05)；饲粮添加LGG显著提高了血清中IgG和IL-4的含量(P＜0.05)；而与对照组RV感染仔猪相比，试验组显著提高了RV感染仔猪血清中IL-4的含量(P＜0.05)，显著降低了RV感染仔猪血清中IL-2的含量(P＜0.05)。
| 表 5 饲粮添加LGG和/或RV攻毒对断奶仔猪血清中免疫球蛋白和细胞因子含量的影响 Table 5 Effect of dietary LGG supplementation and/or RV challenge on the content of immunoglobulins and cytokines in serum of weaning piglets |
作为仔猪腹泻主要的病毒性病原，RV对仔猪的健康和生长产生严重影响，而这可能部分源于RV感染对仔猪免疫功能产生了影响[1, 4]。本研究也得到了类似的研究结果，即灌服RV显著影响了断奶仔猪的饲料利用效率(即提高了F/G)，显著降低了CD3+和CD4+ T淋巴细胞数量及CD4+/CD8+，显著提高了血清中IL-2的含量，并显著降低了血清中IgG、IgA和IL-4的含量。另外，本研究还发现灌服RV显著提高了仔猪血清中RV-Ab的含量。因此，以上结果可以确定本试验成功构建了RV感染模型。
近年相关的研究表明，饲粮补充LGG可提高断奶仔猪的生长性能。岑路等[16]和王海东等[17]在断奶仔猪上的研究均发现，饲粮中添加LGG可提高仔猪ADG，改善了F/G。本试验的结果与前人的研究结果基本一致，即饲粮添加LGG显著降低了仔猪的F/G，且与饲喂对照饲粮的RV感染仔猪相比，饲喂添加了LGG的饲粮显著降低了RV感染仔猪的F/G。前人的研究表明，血清尿素氮含量在一定程度上可间接反映动物机体对蛋白质的利用效率，且其含量高低与蛋白质利用效率和生长性能呈负相关[18, 19]。而本试验的研究也发现，饲粮添加LGG可降低仔猪血清中尿素氮含量，并可缓解RV攻毒诱导仔猪的血清尿素氮含量 升高。因此，可以推测饲粮添加LGG改善了RV感染仔猪的生长性能可能源于其改善了仔猪体内蛋白质代谢，进而增强机体蛋白质利用效率实现的。
在动物机体的免疫功能中，T淋巴细胞亚群组成和辅助性T(T-helper，Th)淋巴细胞产生的细胞因子(主要是Th1和Th2型细胞因子)平衡均发挥着重要的作用。其中，CD4+ T淋巴细胞可激活其他免疫细胞，进而调控机体的免疫功能[20]；而Th1型细胞因子(即促炎性细胞因子，如IL-2)与Th2型细胞因子(即抗炎性细胞因子，如IL-4)体系的动态平衡，可有效防御病原物质侵袭，并保证机体不因炎症反应过强而受损[21]。近年的诸多研究表明，LGG具有提高人和动物机体内免疫功能的作用，主要体现在其可调节体内多种免疫细胞(如树突细胞、淋巴细胞和单核细胞)及其分泌多种细胞因子[6, 7, 8, 10]。本试验也得到了类似的结果，即饲粮中添加LGG可不同程度地提高断奶仔猪血液中CD4+ T淋巴细胞数量和血清中IL-4的含量；并可不同程度地缓解RV攻毒导致的断奶仔猪血液中CD4+ T淋巴细胞数量和血清中IL-4含量的下降与血清中IL-2含量的提高。Liu等[22]以IPEC-J2细胞为对象进一步探讨LGG改善机体免疫功能的研究表明，LGG处理可提高细胞内先天性免疫因子(如Toll样受体2)的表达，进而调节了IPEC-J2细胞内相关的细胞因子分泌。因此，结合近年的研究和本研究的相关结果可推测，饲粮添加LGG调节T淋巴细胞亚群和Th1/Th2型细胞因子的平衡，进而维持了RV感染仔猪的健康，这一过程可能还涉及到了其对先天性免疫因子的调节作用。
另外，LGG对动物机体的体液免疫也具有一定的调节作用。Majama等[9]和Sindhu等[23]以婴幼儿为对象的研究表明，LGG的补充可提高血清中IgG和IgA的含量。以无菌新生仔猪作为新生儿模型的研究表明，灌服LGG可以提高RV弱毒苗免疫后仔猪体内RV特异性抗体的生成[11, 12, 13, 14]。而本试验的结果也表明，饲粮中添加LGG显著提高了血清中IgG的含量。
4 结 论饲粮中添加LGG降低了血清尿素氮含量和调节了机体免疫功能，进而提高了机体营养物质(如蛋白质)利用和机体健康，最终改善了RV感染断奶仔猪的生长性能。
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