蛋鸡饲养过程中氧化应激是影响蛋鸡生产性能和鸡蛋品质的原因之一，蛋鸡健康养殖大部分在于抗氧化营养机能的调控^{[1, 2]}，动物机体内具有几种能限制活性氧簇(ROS)酶系统的酶类，能有效应对机体氧化应激，超氧化物歧化酶(SOD)是其中一类，它是重要的氧自由基清除酶，它能歧化清除超氧阴离子自由基(O^2-·)，产生过氧化氢(H₂O₂)，消除O^2-·的毒性，有SOD作为催化剂，反应速度比无SOD快，SOD对维持机体内环境稳定有着重要的作用，近几年来，微生态制剂^[3]和中草药^[4]等绿色添加剂的使用，在蛋鸡抗氧化方面取得了进展，但是在蛋鸡机体抗氧化和抗氧化平衡的机理、氧化应激状况、有效的抗氧化添加物的筛选、抗氧化添加物的作用机理等方面仍需要研 究^[5]。D’Souza等^[6]发现微生态制剂能调节 SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化调节因子的基因信使RNA的表达量，乳酸菌和红曲霉对机体或细胞的氧化应激具有显著的调节作用^{[7, 8, 9]}，关于乳酸菌制剂^{[10, 11]}、中药乳酸菌制剂、中药红曲霉制剂^{[11, 12]}等这几种微生态制剂中对蛋鸡抗氧化能力研究的大多试验测定还止于血清和肝脏的宏观检测，从分子水平来看，有关抗氧化基因表达量的改变才是宏观变化的基础，而有关的对蛋鸡抗氧化酶基因表达的研究资料十分有限。因此，本试验从宏观角度分析了微生态制剂包括乳酸菌制剂、中药乳酸菌制剂、中药红曲霉制剂、等比例混合乳酸菌制剂和中药红曲霉制剂对蛋鸡血清和蛋黄中总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性的影响，还探讨了它们对蛋鸡肝脏抗氧化基因SOD1、SOD2转录水平的影响。

植物乳杆菌和紫色红曲霉2种试验菌株均由延边大学动物营养实验室提供，大枣、山药、山楂购自药店，大米、玉米面购自超市。

中药乳酸菌制剂主要用实验室预先制备的玉米面培养基添加粉碎后的大枣2%、山楂2%、山药1.5%，接种适量的植物乳杆菌菌液，乳酸菌制剂在制备好的玉米面培养基上直接接种适量的植物乳杆菌菌液即可，二者都在37 ℃恒温培养箱中培养3~5 d。中药红曲霉制剂在制备好的大米培养基上添加粉碎后的大枣2%、山楂2%、山药1.5%，接种适量的紫色红曲霉菌液，32 ℃恒温培养箱中培养14~16 d，制备好微生态制剂活菌数≥1×10⁶ CFU/g，冷冻干燥，-20 ℃保存。

选取360只健康、体重相近的300日龄的海兰褐产蛋鸡，随机分5组，每组3个重复，每个重复24只鸡。预试期7 d，正试期72 d。Ⅰ组为对照组，饲喂基础饲粮，Ⅱ组在基础饲粮中添加0.5%中药乳酸菌制剂，Ⅲ组在基础饲粮中添加0.25%中药红曲霉制剂和0.25%乳酸菌制剂，Ⅳ组在基础饲粮中添加0.5%乳酸菌制剂，Ⅴ组在基础饲粮中添加0.5%中药红曲霉制剂。基础饲粮参照NRC(1994)营养需要配制的粉状配合饲粮，其组成及营养水平见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % 原料 Ingredients 含量 Content 营养水平 Nutrient levels2) 含量 Content 玉米 Corn 59.68 代谢能 ME/(MJ/kg) 2.74 豆粕 Soybean meal 25.28 粗蛋白质 CP 16.70 棉籽粕 Cottonseed meal 4.11 钙 Ca 3.47 磷酸氢钙 CaHPO4 1.05 总磷 TP 0.49 石粉 Limestone 8.64 有效磷 AP 0.27 食盐 NaCl 0.36 赖氨酸 Lys 0.94 赖氨酸 Lys 0.26 蛋氨酸 Met 0.26 蛋氨酸 Met 0.12 预混料 Premix1) 0.50 合计 Total 100.00 1)预混料为每千克饲粮提供The premix provided the following per kg of diets：VA 5 200 IU，VD 600 IU，VE 10 IU，VK 0.8 mg，VB1 0.8 mg，VB2 2.3 mg，VB12 0.04 mg，泛酸钙 calcium pantothenate 4.4 mg，烟酸 niacin 11 mg，吡哆醇 pyridoxine 3.2 mg，生物素 biotin 0.1 mg，胆碱 choline 1 100 mg，叶酸 folic acid 0.26 mg，Cu 8 mg，Fe 60 mg，Zn 55 mg，Mn 31 mg，I 0.3 mg，Se 0.1 mg。 2)营养水平为计算值。Nutrition levels were calculated values.

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

试验在同一鸡舍中进行，蛋鸡采用3层全阶梯笼养，每笼4只，由专人管理，每日喂料2次，自由采食和饮水，按常规免疫。每日记录各组的产蛋量、蛋重、耗料量、破软蛋数，并且观察鸡的健康、发病及粪便情况。

试验结束最后1 d，每组的各个重复均随机选取10枚鸡蛋，冰箱内4 ℃恒温保存，准确量取新鲜蛋黄5 g，按1 ∶ 4比例加入无水乙醇，漩涡震荡3 min，充分混匀，3 500 r/min离心取上清待测，操作按试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书进行。

试验结束最后1 d，每组随机选取6只(每个重复2只)颈静脉放血屠宰，采集颈静脉血样和肝脏样品。血液置离心管中倾斜室温放置30 min后，3 300 r/min离心收集血清备用，采用黄嘌呤氧化酶法测定T-SOD活性，操作按试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书操作。

屠宰后鸡只倒挂15 min后，用医用酒精对胸腹部进行消毒，开膛，采集左侧肝叶中部2块筋膜较少的组织肝脏，迅速剪成小块，液氮中速冻，-80 ℃保存备用。

根据GenBank基因库上Gallus的SOD1、SOD2及β-肌动蛋白(β-actin)引物序列为模板设计引物，并由长春华大中天生物技术有限公司合成，引物序列见表2。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 目的基因引物序列 Table 2 Primer sequence of target genes 目的基因 Target genes 登录号 Accession No. PCR产物长度 Length of PCR product/bp 引物序列 Primer sequences 超氧化物歧化酶1 SOD1 NM205064 99 5′-TTGTCTGATGGAGATCATGGCTTC-3′ 5′-TGCTTGCCTTCAGGATTAAAGTGAG-3′ 超氧化物歧化酶2 SOD2 NM204211 86 5′-CAGATAGCAGCCTGTGCAAATCA-3′ 5′-GCATGTTCCCATACATCGATTCC-3′ 肌动蛋白β-actin XM009889215 300 5′-TGCGTGACATCAAGGAGAAG-3′ 5′-TGCCAGGGTACATTGTGGTA-3′

表2 目的基因引物序列 Table 2 Primer sequence of target genes

采用Trizol试剂(Takara公司)的说明书提取肝脏组织总RNA，用紫外分光用分光光度计测定RNA的浓度，并在260和280 nm下测吸收值的比值在1.8~2.0时，表示提取的RNA纯度较高，适合下一步试验，取5 μL总RNA在1.5%的琼脂糖凝胶上120 V电泳20~25 min，以检测RNA的完整性。取各个样品0.5 μL总RNA按Takara公司Prime Script RT kit定量反转录试剂盒说明书合成cDNA，然后按照Light Cycler 480 SYBR Green Ⅰ Master预混液说明书进行配制，cDNA模板2.5 μL，ddH₂O 1.5 μL，上下游引物各0.5 μL，Master mix 5 μL，总体积10 μL。完成上述步骤后，把加好样品96孔板放在罗氏LightCycler 480 Ⅱ荧光定量PCR仪进行反应，反应条件：预变性95 ℃ min，变性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 20 s ，延伸72 ℃ 20 s，45个循环，溶解曲线：95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min，冷却：40 ℃ 10 s。

mRNA表达量以β-actin为内参基因，以对照组的基因表达量为基准，应用2^-△△Ct方法计算SOD1和SOD2基因mRNA相对表达量，所有数据首先经Excel 2007处理，采用SPSS 19.0软件进行单因子方差分析中LSD法进行多重比较，差异显著性用P<0.05表示，结果用平均值±标准差表示。

由表3可知，与对照组相比，Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组蛋黄中T-SOD活性均显著提高(P<0.05)，且分别提高了26.61%、13.25%、14.34%，Ⅱ组比Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组提高了11.79%、10.73%、21.10%，均差异显著(P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ组比Ⅴ组提高了8.33%和9.37%，均差异显著(P<0.05)。各试验组血清中T-SOD活性与对照组相比均显著升高(P<0.05)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组分别提高了38.90%、36.87%、15.62%和37.95%；Ⅱ组比Ⅳ组提高了20.13%，差异显著(P<0.05)；Ⅲ组比Ⅳ组提高18.38%，差异显著(P<0.05)，Ⅴ组比Ⅳ组提高了19.31%，差异显著(P<0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 不同微生态制剂对蛋鸡蛋黄和血清中T-SOD活性的影响 Table 3 Effects of different kinds of probiotics on activity of T-SOD in yolk and serum of laying hens 组别 Groups 总超氧化物歧化酶 T-SOD 蛋黄 Yolk/(U/mg prot) 血清 Serum/(U/mL) Ⅰ 10.11±0.21c 246.45±15.63c Ⅱ 12.80±0.19a 342.32±7.43a Ⅲ 11.45±0.35b 337.33±3.39a Ⅳ 11.56±0.70b 284.95±11.62b Ⅴ 10.57±0.15c 339.99±10.26a 同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，肩标相同字母表示差异不显著(P<0.05)。下表同。 In the same row，values with different small letter superscripts mean significant difference (P＜0.05),while with the same letter superscripts mean no significant difference (P＞0.05). The same as below.

表3 不同微生态制剂对蛋鸡蛋黄和血清中T-SOD活性的影响 Table 3 Effects of different kinds of probiotics on activity of T-SOD in yolk and serum of laying hens

由图1可清晰见到18S、28S和5S 3条电泳条带，表明RNA提取效果较好，可以进行下一步试验。

图1(Figure 1)

Fig. 1

图1 总RNA凝胶电泳结果 Fig. 1 Gel electrophoresis results of total RNA samples

由表4可知，与对照组相比，Ⅱ组肝脏中SOD1 mRNA表达量显著提高(P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组差异不显著(P>0.05)；Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ组肝脏中SOD2 mRNA的表达量均显著提高(P<0.05)，Ⅲ组则无显著差异(P>0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 不同微生态制剂对蛋鸡肝脏中SOD1、SOD2 mRNA表达量的影响 Table 4 Effects of different kinds of probiotics on expression levels of SOD1 and SOD2 mRNA in liver of laying hens 组别 Groups 超氧化物歧化酶1 SOD1 超氧化物歧化酶2 SOD2 Ⅰ 1.00±0.00b 1.00±0.00c Ⅱ 3.82±2.89a 4.91±0.92ab Ⅲ 2.12±0.62ab 1.74±0.54c Ⅳ 2.06±1.05b 5.64±0.12a Ⅴ 1.89±0.98b 3.73±1.75b

表4 不同微生态制剂对蛋鸡肝脏中SOD1、SOD2 mRNA表达量的影响 Table 4 Effects of different kinds of probiotics on expression levels of SOD1 and SOD2 mRNA in liver of laying hens

蛋鸡血清和蛋黄中T-SOD活性的提高，一定程度上可以反映蛋鸡机体抗氧化能力的加强和蛋品质的提高，本试验研究的不同微生态制剂都能使蛋鸡血清中T-SOD的活性升高，说明饲喂上述微生态制剂对蛋鸡血清抗氧化指标有一定的积极影响，血清中超氧化物歧化酶活性升高，一定程度上可提高机体抗氧化能力和应对外界饲养环境给 产蛋鸡的应激，进而提高蛋鸡的产蛋性能与蛋品 质，事实上本试验测定的产蛋鸡生产性能和蛋品质这方面数据，经过统计分析，可以说明上述这几种微生态制剂的确能提高蛋鸡的产蛋率，降低料蛋比，改善蛋品质^[13]，孙建晨^[14]报道的中药红曲霉制剂可提高蛋鸡机体抗氧化能力和鸡蛋的品质与本试验这一结论结果相吻合，添加的乳酸菌制剂能提高血清中T-SOD活性与王全溪等^[9]报道饲粮中添加100 mg/kg乳酸菌素组肉鸡血清SOD活性均显著高于对照组的结论相符合，本试验饲粮中添加混合后的乳酸菌制剂和中药红曲霉制剂与二者单独添加的Ⅳ和Ⅴ组对血清中T-SOD活性影响差别不显著，对蛋黄中T-SOD而言，混合后的2种制剂比单独添加中药红曲霉制剂效果要好且差异显著，与单独添加的乳酸菌制剂效果则无明显差异，其原因可能为蛋鸡生产代谢过程中，乳酸菌制剂的某些成分促进了红曲酶制剂调节鸡蛋抗氧化能力，在饲粮中除添加中药红曲霉制剂组外，各个试验组中蛋黄T-SOD活性均比对照组显著提高，都具有提高鸡蛋抗氧化的能力，饲粮添加中药乳酸菌制剂效果要优于其他各试验组，可能乳酸菌与中药某些成分相互促进^[16]，具体作用机制还有待研究。

在哺乳动物组织中，SOD1存在于细胞质中，SOD2则位于线粒体上，它们在机体上发挥着独立的作用。SOD1活性的增加会减轻氧化物对肝脏造成的损伤，基因工程改造缺乏SOD1的小鼠极易患肝癌^[17]，SOD2可以清除由呼吸链反应中所产生的自由基，减轻机体所受到的过氧化导致的损伤^{[18, 19]}，杨茂平等^[20]的研究表明，SOD2基因多态性表达与血浆T-SOD活性有关系，基因SOD2通过影响血浆SOD2活性成为导致冠心病加剧的危险因素。基因工程改造缺乏SOD2的小鼠还会患上严重的疾病，小鼠在出生数天后，死于严重的氧化应激^[21]。肝脏是维持机体各种代谢的最主要场所，肝脏中SOD1和SOD2 mRNA表达量的增多，某种程度上可以反映机体的T-SOD水平和抗氧化能力，根据本试验研究的结果可知，与Ⅰ组相比，Ⅱ组能显著提高肝脏中SOD1基因的表达量，Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组肝脏中SOD1 mRNA的表达量比Ⅰ组有所提高，差异不显著，说明在本试验条件下相对于其他试验组，中药乳酸菌制剂更能减少蛋鸡肝脏的损伤，提高肝脏抗氧化能力，对于蛋鸡肝脏中SOD2 mRNA的表达量来说，Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ组都能显著提高SOD2 mRNA的表达量，Ⅲ组与Ⅰ组相比，SOD2 mRNA表达量有提高，但差异不显著，其原因可能是红曲霉生长最适pH为3.5~5.0，尤嗜乳酸，混合后的乳酸菌制剂和中药红曲霉制剂进入肠道后，乳酸菌在肠道产生的代谢产物部分被红曲霉利用，供调节机体代谢的营养因子减少，从而影响了肝脏SOD2 mRNA表达量。

① 饲粮中添加不同微生态制剂都能显著提高蛋鸡血清中T-SOD的活性，添加中药乳酸菌制剂、乳酸菌制剂、混合后的乳酸菌制剂和中药红曲霉制剂能显著提高鸡蛋抗氧化能力。

② 添加中药乳酸菌制剂可使蛋鸡肝脏中SOD1、SOD2 mRNA的表达量显著提高，添加乳酸菌制剂和中药红曲霉制剂能显著提高蛋鸡肝脏中SOD2 mRNA表达量。

③ 综合来看，饲粮中添加0.5%中药乳酸菌制剂对蛋鸡机体SOD调节机制效果最好。