氨气对家禽的危害一直为人们所关注，畜禽生产过程中产生的氨气已成为全球最大的污染源^[1]。除臭添加剂中，仅有丝兰提取物是在《饲料添加剂品种目录(2013)》^[2]之列，但因种植条件要求高、资源有限、价格昂贵，故应用并不广泛。巨大芽孢杆菌1259(Bacillus megaterium 1259，BM1259)制剂，是一种正在研发的新型除臭调理饲料添加剂，其效果也逐渐被认可。本课题组前期研究表明在饲粮中添加2×10⁶ CFU/g的BM1259可降低冬季密闭鸡舍空气氨气浓度53%～74%，硫化清浓度55%～90%^[3]，有成为除臭型饲料添加剂的潜力。因此，本试验旨在研究在饲粮中添加BM1259对蛋鸡产蛋性能及排泄物中含氮物浓度的影响，为BM1259在蛋鸡生产中对生产性能的影响及作为降低挥发性含氮物危害，提高蛋鸡环境福利质量的应用提供依据。

选取576只300日龄健康、产蛋率差异不显著(P＞0.05)的海兰褐蛋鸡进行随机分为6个组：对照组饲喂参考海兰褐蛋鸡营养需求配制的基础饲粮(表1)，另外5组饲粮在基础饲粮中分别添加100、150、200、250和300 mg/kg BM1259。每个组6个重复，每个重复16只产蛋鸡，各组之间体重、产蛋率差异不显著(P＞0.05)。预试期14 d，饲喂基础饲粮；正试期42 d。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) % 项目 Items 含量 Content 原料 Ingredients 玉米 Corn 61.28 大豆粕 Soybean meal 25.00 石粉 Limestone 7.60 DL-蛋氨酸 DL-Met 0.12 贝壳粉 Shell powder 1.00 预混料 Premix1) 5.00 合计 Total 100.00 营养水平 Nutrient levels2) 代谢能 ME/(MJ/kg) 10.878 粗蛋白质 CP 16.426 赖氨酸 Lys 0.779 蛋氨酸 Met 0.370 蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys 0.650 钙 Ca 3.319 总磷 TP 0.316 非植酸磷 NPP 0.119 1)每千克预混料可提供A kilogram of premix provided the following：VA 1 580 000 IU，VD3 55 000 IU，VE 300 IU，VK 40 mg，硫胺素 thiamine 30 mg，核黄素 riboflavin 85 mg，泛酸钙 calcium pantothenate 200 mg，烟酸 nicotinic acid 498 mg，吡哆醇 pyridoxine 8 mg，VB12 5 mg，生物素 biotin 2 mg，胆碱 choline 9.2 mg，Fe (as ferrous sulfate) 60 mg，Cu (as copper sulfate) 8 mg，Zn (as zinc sulfate) 66 mg，Mn 65 mg，Se 0.3 mg，Ⅰ 1 mg，Ca 170 g，P 28 g。 2)营养水平为计算值。Nutrient levels were calculated values.

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis)

BM1259制剂由“新型生物饲料添加剂-BM1259的研制”课题组提供，批号：20120731，巨大芽孢杆菌有效活菌含量为1×10¹⁰ CFU/g。

试验鸡舍自然通风，试验鸡2只/笼，自由采食、饮水，光照程序16.5 h日照和7.5 h黑暗。定期清粪，保持舍内清洁卫生。

分别于正试期第28、31、35天，08:00时，收集试验鸡排出的30 min内未被污染的新鲜排泄物，放入冰盒中。封盒、-40 ℃保存。

试验期间，每天按重复记录日产蛋数、日产蛋量、采食量和死淘情况，统计试验期间各组的产蛋重、产蛋数、产蛋率、平均蛋重、日采食量、料蛋比以及存活率。

采食量指各重复每周的喂料量与退料量差值；产蛋重是试验期间的日产蛋量的统计值；产蛋数是试验期间的日产蛋数的统计值；产蛋率是每周各重复的入舍母禽产蛋率的统计值。

采用靛酚蓝比色法^[4]。准确称量5 g(±0.01 g)排泄物样于100 mL锥形瓶中，加入45 mL蒸馏水、数颗玻璃珠，充分稀释均匀。取稀释待测液3 mL于离心管中，4 000 r/min离心10 min。取100 μL上清液于10 mL试管中，依次加入A和B试剂各3 mL。混匀，60 ℃水浴显色10 min，冷水冷却，酶标仪波长546 nm比色。对照标准曲线，计算结果。

A试剂(苯酚试剂)：称酚9.975 g，亚硝基铁氰化钾50.65 mg，溶于蒸馏水中，定容至1 000 mL，放于棕色瓶中；B试剂(次氯酸钠试剂)：氢氧化钠(NaOH) 5 g，溶于水中，冷却，加入20 mL次氯酸钠，混匀，定容至1 000 mL。标准曲线(标准曲线：Y=0.025X+0.003 67，r²=0.997);用氮标准溶液重复上述操作。

采用试剂盒法，试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

采用靛酚蓝比色法^[5]。准确称取新鲜排泄物5 g(±0.01 g)放入100 mL锥形瓶，在瓶中加入1 mL甲苯溶液。15 min后加入10 mL 10%尿素和20 mL pH 6.7的柠檬酸盐缓冲液(随加随摇匀)。37 ℃恒温箱中培养24 h，3 000 r/min离心5 min。取1 mL上清液于50 mL容量瓶中，加入20 mL蒸馏水、4 mL苯酚钠溶液、3 mL次氯酸钠溶液(随加随摇匀)。20 min后显色，定容。1 h内在酶标仪上于578 nm比色。

根据标准曲线计算脲酶活性，脲酶活性用培养前后产生的氨氮浓度表示。脲酶活性单位为：每24 h每克排泄物样产生的氨氮毫克数。

标准曲线：用氮标准溶液重复上述操作。

尿酸在280 nm有1个吸收峰，测定前后该值的变化，表示酶的活性^[5]。准确称量排泄物样2 g(±0.01 g)于50 mL锥形瓶中，加入0.5 mL甲苯，30 min后加入无菌水、尿酸溶液和pH=7.3的磷酸盐缓冲液各10 mL，混匀。将1/2溶液过滤(另1/2置于30 ℃恒温培养箱中培养)。取2 mL滤液于50 mL容量瓶中，用0.1 mol/L 盐酸(HCl)定容，在紫外分光光度计上于280 nm处测定光密度。24 h后，将培养过的溶液过滤，取2 mL滤液于50 mL容量瓶中，用0.1 mol/L HCl定容，最后在酶标仪上于280 nm处测定光密度。

尿酸酶活性以反应前后溶液光密度之差表示。以对照组作为基准，计算各试验组尿酸酶的相对活性。

用Excel整理数据，采用SPSS 18.0软件中的单因素方差分析，LSD法进行多重比较，结果以平均值与标准误表示。

由表2可知，与对照组相比，BM1259能显著影响平均蛋重和产蛋重(P<0.05)，极显著影响产蛋数、产蛋率、料蛋比(P<0.01)。蛋鸡的产蛋率、平均蛋重、日采食量、料蛋比与BM1259添加水平为二次曲线关系(P<0.05)。除150和200 mg/kg组外，其他各组均未出现蛋鸡死淘情况。与对照组相比，100 mg/kg组产蛋重、产蛋数、产蛋率以及平均蛋重均极显著提高(P<0.01)，并极显著改善料蛋比(P<0.01)，该组表现出了极佳的生产性能。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 BM1259对蛋鸡生产性能的影响 Table 2 Effects of BM1259 on performance of laying hens 项目 Items BM1259添加水平 BM1259 added level/(mg/kg) SEM P值 P-value 0 100 150 200 250 300 BM1259 线性 Linear 二次 Quadratic 产蛋重 Egg weight/g 881.87Bb 921.97Aa 899.82Bb 891.02Bb 904.25Aa 907.86Aa 8.05 0.013 0.314 0.579 产蛋数 Number of egg/个 14.58Bb 15.20Aa 15.01a 14.63Bb 14.94Aa 14.89Aa 0.12 0.004 0.690 0.249 产蛋率 Laying rate/% 91.12Bb 95.00Aa 95.10Aa 92.90Bb 93.36Aa 93.09Aa 0.75 0.002 0.664 0.005 平均蛋重 Average egg weight/g 55.79Bb 58.24Aa 57.67Aa 57.50Aa 57.31Aa 57.61Aa 0.47 0.012 0.123 0.035 日采食量 Daily feed intake/g 126.05 123.48 122.81 124.68 124.30 125.86 0.95 0.109 0.671 0.013 料蛋比 The ratio of feed to egg 2.35Aa 2.20Bb 2.20Bb 2.26Bb 2.26Bb 2.27Bb 0.03 0.001 0.605 0.002 存活率 Survival rate/% 100.00Aa 100.00Aa 98.61Bb 98.61Bb 100.00Aa 100.00Aa 0.25 <0.001 1.000 <0.001 同行数据肩标不同小写字母者差异显著(P<0.05)，不同大写字母者差异极显著(P<0.01)。下表同。 In the same row,while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

表2 BM1259对蛋鸡生产性能的影响 Table 2 Effects of BM1259 on performance of laying hens

由表3可知，与对照组相比，饲粮中添加BM1259有降低蛋鸡排泄物中NH₃-N浓度的趋势(P=0.077)，且蛋鸡排泄物中NH₃-N浓度与BM1259添加水平呈线性关系(P<0.05)。饲粮中添加BM1259对排泄物尿素氮浓度影响极显著(P<0.01)，且蛋鸡排泄物尿素氮浓度与BM1259添加水平呈线性和二次曲线关系(P<0.05)。饲粮中添加BM1259对排泄物尿酸浓度影响显著(P<0.05)，且蛋鸡排泄物尿酸浓度与BM1259添加水平呈线性关系(P<0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 BM1259对产蛋鸡排泄物中NH3-N、尿素氮及尿酸浓度的影响 Table 3 Effects of BM1259 on concentrations of NH3-N,urea nitrogen and uric acid in excreta of laying hens mg/g 项目 Items BM1259添加水平 BM1259 added level/(mg/kg) SEM P值 P-value 0 100 150 200 250 300 BM1259 线性 Linear 二次 Quadratic 氨态氮 NH3-N 1.05 0.87 0.81 0.79 0.75 0.75 0.08 0.077 0.005 0.200 尿素氮 UN 0.40Aa 0.27Bb 0.19Cc 0.24Bb 0.28Bb 0.23Bb 0.01 <0.001 <0.001 <0.001 尿酸 UA 2.10Aa 1.93Bb 1.87Bb 1.76Bb 1.86Bb 1.76Bb 0.08 0.024 0.002 0.177

表3 BM1259对产蛋鸡排泄物中NH3-N、尿素氮及尿酸浓度的影响 Table 3 Effects of BM1259 on concentrations of NH3-N,urea nitrogen and uric acid in excreta of laying hens

由表4可知，饲粮中添加BM1259后排泄物的脲酶活性与对照组间差异极显著(P<0.01)，且蛋鸡排泄物脲酶活性与BM1259添加水平呈线性和二次曲线关系(P<0.05)。饲粮中添加BM1259 没有显著影响蛋鸡排泄物中尿酸酶相对活性(P>0.05)，但饲粮中添加BM1259后排泄物尿酸酶相对活性均低于对照组，其中对尿酸酶相对活性抑制效果最好的是300 mg/kg组，比对照组降低了31.21%。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 BM1259对产蛋鸡排泄物中尿酶活性和尿酸酶相对活性的影响 Table 4 Effects of BM1259 on urease activity and uricase relative activity in excreta of laying hens 项目 Items BM1259添加水平 BM1259 added level/(mg/kg) SEM P值 P-value 0 100 150 200 250 300 BM1259 线性 Linear 二次 Quadratic 脲酶活性 Urease activity/ (mg/g) 63.67Aa 43.05Bb 44.63Bb 44.04Bb 35.22Cc 41.16BCb 1.90 <0.001 <0.001 <0.001 尿酸酶相对活性 Uricase relative activity/% 100.00 72.58 77.01 73.01 84.85 69.79 12.33 0.531 0.260 0.421

表4 BM1259对产蛋鸡排泄物中尿酶活性和尿酸酶相对活性的影响 Table 4 Effects of BM1259 on urease activity and uricase relative activity in excreta of laying hens

芽孢杆菌能在蛋鸡体内产生多种消化酶并调整肠道内菌群的组成，使蛋鸡更好地消化、吸收营养物质，提高饲料报酬。饲粮中添加地衣芽孢杆菌，可提高试验海兰褐蛋鸡的产蛋量及产蛋总重^[6]；Abdelqader等^[7]研究发现，在蛋鸡的基础饲粮中添加2.3×10⁵ CFU/kg枯草芽孢杆菌能提高试验蛋鸡产蛋量、饲料转化率。在45周龄尼克珊瑚粉蛋鸡基础饲粮中添加枯草芽孢杆菌制剂，较对照组能改善料蛋比，降低死淘率^[8]。本试验中，饲喂添加BM1259的饲粮能够显著增加平均蛋重，极显著影响产蛋数、产蛋率，并极显著降低料蛋比。本试验的试验鸡处于产蛋高峰期，整体健康状况较好，出现死淘的2组内也仅是个别现象，估计是由于个体差异导致，与BM1259关系不大。

课题组前期研究中发现BM1259具有其他芽孢杆菌所不具备的大幅降低鸡舍空气中含氮物浓度的功效^[3]，本试验进而探究在产蛋鸡饲粮中添加BM1259对其排泄物中含氮物浓度的影响。巨大芽孢杆菌的生长过程需要消耗大量氧气，降低了肠道内的氧浓度，抑制了耗氧腐败菌的生长，降低了腐败物质的生成。同时，芽孢杆菌能提高对含氮物质的消化率，从而降低排泄物中含氮物浓度^[9]。李秀等^[10]通过研究BM1259对新扬州鸡氮代谢的影响中，发现活菌制剂有降低新扬州鸡排泄物中尿素氮浓度的趋势，但差异并不显著。李晓刚^[11]研究发现BM1259能显著降低蛋鸡排泄物中脲酶活性、尿酸酶活性。王建彬等^[12]研究表明，枯草芽孢杆菌制剂可以显著降低试验对象排泄物中尿酸浓度。本试验得出，与对照组相比，饲粮添加BM1259极显著降低了蛋鸡排泄物中的脲酶活性以及一定程度上降低了尿酸酶相对活性，达到了降低挥发性含氮物危害，提高蛋鸡环境福利质量的目的。在微生物氮代谢中，脲酶和尿酸酶是起主要作用的微生物酶，对这2种酶活性的降低，便能减缓尿酸、尿素氮的降解从而使得排泄物中NH₃-N浓度降低，氨气的挥发量也随之减少，从而降低了舍内氨气浓度。本试验的结果也与上述推论一致：添加BM1259可以极显著降低蛋鸡排泄物中的尿酸、尿素氮浓度，NH₃-N浓度也有降低的趋势。试验结果中除臭性能的效果趋势往往并不接近线性，而是呈现“U”型，结合试验采用的巨大芽孢杆菌的本身性质，微生物菌剂中起作用的活菌制剂的作用原理是自身代谢与改善肠道菌群相结合。提高饲粮中BM1259的添加水平会增加活菌自身代谢对含氮物的消耗量，但也会使肠道菌群紊乱，从而影响微生物菌剂的除臭效果。

① 饲粮中添加BM1259能显著影响产蛋重、平均蛋重，极显著影响产蛋数、产蛋率，并极显著降低料蛋比；其中添加水平为100 mg/kg时表现最优。

② 饲粮中添加BM1259能一定程度上降低排泄物NH₃-N浓度、尿酸酶相对活性，显著降低尿酸浓度，极显著降低尿素氮浓度、脲酶活性，其中添加水平为200与250 mg/kg组表现最佳。