我国绵羊、绒山羊的存栏量，羊肉、羊绒、羊皮等主要产品的产量均跃居世界第1位，养羊业在我国畜牧业中占有重要地位。由于长年来重用轻养，我国的天然草场退化、沙化严重，饲养方式也正在经历从放牧向舍饲或半舍饲过渡。如何充分开发利用我国的饲料资源，对于促进养羊业的健康、可持续发展具有重要意义。但是在我国，灌木资源十分丰富，从北到南都有野生的灌木分布。据统计，内蒙古自治区现有天然灌木林5 400万亩、人工灌木林1 950万亩。饲用灌木类植物不仅营养成分丰富、含量较高且适口性好，牛羊都喜食。因此，对灌木资源的开发利用是开辟饲料资源的重要途径。红豆草、柠条等灌木植物中都含有抗营养因子单宁，而使其未能得到广泛饲用。单宁是一种广泛存在于植物体内的多元酚类化合物，根据其化学结构可分为缩合单宁和水解单宁。单宁与唾液蛋白质和口腔黏液反应可引起收敛作用，对肠道产生刺激和系统毒性。饲粮中的单宁可以通过形成难消化的单宁-蛋白质复合物和降低消化酶的活性来影响饲粮蛋白质的消化^[1]。Longstaff等^[2]研究表明，单宁对鸡体内的α-淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶具有抑制作用。Molan等^[3]研究发现瘤胃液中400 mg/mL或更高浓度的缩合单宁能抑制瘤胃许多种细菌的生长。关于如何消除单宁的抗营养作用，科研人员做了大量的研究，其中聚乙二醇(PEG)对单宁抗营养特性的屏蔽作用被广泛研究。Salem等^[4]研究报道，当绵羊采食新鲜的、晒干的和用PEG处理过的含单宁饲草时，绵羊对用PEG处理后的饲草的干物质(DM)、有机物(OM)、粗蛋白质(CP)和中性洗涤纤维(NDF)的消化率相对于前两者均有不同程度的提高。刘艳玲^[5]利用体外试验研究表明，当PEG的添加量为单宁的2~3倍时可以降低单宁对底物营养物质消化率的副作用。本试验旨在研究饲粮中添加不同水平单宁以及高单宁饲粮添加PEG对绵羊和山羊瘤胃总细菌、总厌氧真菌、原虫数量以及对营养物质表观消化率的影响，从而为开发利用含单宁的灌木资源提供科学依据。

选用体况良好的1.5～2.0岁、体重45 kg左右、安装永久性瘤胃瘘管的蒙古绵羊和内蒙古白绒山羊各4只。试验动物按照维持需要的1.2倍饲养，按照《动物营养参数与饲养标准》^[6]饲养。试验动物统一驱虫，单笼饲养。

试验动物饲喂精粗比为30 ∶ 70的饲粮。粗饲料为青干草，精料为内蒙古正大羊育肥料。试验动物每天饲喂2次，自由饮水。基础饲粮营养水平见表1，营养水平按照张丽英^[7]的方法测定。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲粮营养水平(风干基础) Table 1 Nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % 项目 Item 干物质 DM 有机物 OM 粗蛋白质 CP 中性洗涤纤维 NDF 酸性洗涤纤维 ADF 钙 Ca 磷 P 含量 Content 94.52 92.70 14.33 47.30 24.76 0.89 0.42

表1 基础饲粮营养水平(风干基础) Table 1 Nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

实测值 Measured values。

采用自身对照设计，共分4期进行，第1期饲喂基础饲粮(Ⅰ组，对照组)，第2、3、4期除饲喂基础饲粮外再分别添加占采食量2%单宁(Ⅱ组)、6%单宁(Ⅲ组)、6%单宁+12％PEG(Ⅳ组)；每期试验30 d，其中预试期12 d，正试期18 d。

单宁(相对分子质量1 701.2)购自国药集团化学试剂有限公司，根据动物每日的采食量将单宁按添加水平称量后均匀混合到每日投喂的精饲料中供动物采食，待精料全部采食完再投喂粗饲料。PEG(相对分子质量4 000)购自Biosharp公司，根据课题组前期的研究结果^[5]，PEG的添加量为单宁添加量的2倍，投喂方式与单宁相同。

采用全收粪消化法测定试验动物对饲粮DM、OM、CP、NDF和酸性洗涤纤维(ADF)的表观消化率。

饲粮样、剩料样和粪样中的DM、OM、CP、NDF、ADF含量分析参照张丽英^[7]的方法进行。

在每个正试期第1天，分别于晨饲前(0 h)和晨饲后6 h从试验动物瘤胃瘘管中采集瘤胃内容物，将部分瘤胃内容物迅速分装于冻存管中，在液氮中速冻后置于-80 ℃，用于测定瘤胃总细菌和总厌氧真菌数量；剩余内容物迅速经4层纱布过滤后，取1 mL滤液加入4 mL甲基绿福尔马林染液(MFS)固定，用于瘤胃原虫的计数。

用血球计数板计数原虫数量^[8]。

采用珠磨砚法提取瘤胃微生物总DNA，本方法的关键步骤是玻璃珠的用量和振荡破碎细胞及蛋白质的去除^[9]。

引物序列及参数见表2，委托上海生工生物股份有限公司合成。

表2

Table 1

表2(Table 2)

表2 瘤胃总细菌和总厌氧真菌的引物序列及参数 Table 2 Sequences and parameters of primers for ruminal general bacteria and general anaerobic fungi 项目 Items 引物序列 Primer sequences (5′—3′) 退火温度 Tm/℃ 长度 Length/bp 来源 Reference 总细菌 General bacteria F:CGGCAACGAGCGCAACCC R:CCATTGTAGCACGTGTGTAGCC 60 130 Denman等[10] 总厌氧真菌 General anaerobic fungi F:GAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTC R:CAAATTCACAAAGGGTAGGATGATT 60 120 Denman等[10]

表2 瘤胃总细菌和总厌氧真菌的引物序列及参数 Table 2 Sequences and parameters of primers for ruminal general bacteria and general anaerobic fungi

反应体系25 μL：模板(粗提DNA)2 μL，Premix Taq (TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye)12.5 μL，目标基因上游引物、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH₂O 8.5 μL。

PCR反应参数:95 ℃预变性5min;95 ℃变性30 s,退火温度退火40 s，72 ℃延伸40 s，40个循环；72 ℃ 8 min，4 ℃保温。

PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果并拍照，将目的片断用胶回收试剂盒(Axygen Biosciences)进行回收。

按照pGM-T克隆试剂盒使用说明进行连接，连接体系为10 μL:10×T4 DNA Ligation Buffer 1μL，T4 DNA Ligase(3 U/μL)1 μL，pGM-T Vector(50 ng/μL)1 μL，回收产物3 μL，ddH₂O 4 μL。16 ℃过夜连接后，取5 μL连接产物加到50 μL TOP10感受态细胞中，冰浴30 min，42 ℃水浴热激90 s，再冰浴2~3 min，加入500 μL的37 ℃预热的LB液体培养基，150 r/min、37 ℃振荡培养45 min。取100 μL菌液涂于加有氨苄青霉素(Amp)、β-半乳糖苷酶(X-gal)、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固体培养基平板上，倒置平板，37 ℃培养12~16 h。

挑取蓝色菌斑周围的单个白色菌斑接种到5 mL LB液体培养基(含50~100 μg/mL氨苄青霉素)里，37 ℃振荡培养过夜，进行菌落PCR测定，鉴定为阳性菌落的送检测序。

测序工作委托华大基因科技服务有限公司进行。将阳性质粒测序结果在NCBI的Blast 上比对分析，验证正确的菌液，用Axygen的质粒提取试剂盒提取质粒。

提取的质粒用酶标仪测定核酸浓度，并检验质粒的提取纯度，根据下列公式计算出质粒的拷贝数，制作标准品。

质粒拷贝数(个/μL)=[6.02×10²³(个/mol)×

NA浓度(ng/μL)]/{DNA长度(bp)×

660[g/(mol·bp)]}^[11]。

然后用已知拷贝数的质粒以10倍浓度梯度稀释至少5个梯度，每梯度3个重复进行实时定量PCR，同时用无酶水做阴性对照，根据实时定量PCR仪(美国Illumina公司)的Eco软件获得质粒拷贝数和循环阈值(Ct)对应的线性关系的标准曲线。

待测样品实时定量PCR反应条件和质粒标准品的一致，反应体系均为25 μL。定量前将样品浓度统一稀释至10 ng/μL，每个反应体系中加入同Priemix Taq等量的荧光染料SYBR Green Ⅱ。每个样品3个重复。将待测样品实时定量PCR得到的Ct代入标准曲线计算出总细菌或总厌氧真菌数量。计算公式如下：

总细菌或总厌氧真菌数量(个/g)=(MQ×C×

VD)/(S×V)^[12]。

式中：MQ为根据标准曲线Ct计算得到的总细菌或总厌氧真菌数量(个)；C为每个样品基因组DNA浓度(ng/μL)；VD为提取DNA时最后溶解DNA的ddH₂O的体积(μL)；S为用于实时定量PCR的DNA的量(ng)；V为提取粗DNA时瘤胃内容物样品用量(g)。

总细菌和总厌氧真菌数量最终用拷贝数的常用对数[lg(个/mL)]表示。

采用SAS 8.0软件包中的GLM过程进行方差分析,多重比较用Duncan氏法。以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

从表3可以看出，绵羊各组DM、OM、CP、NDF、ADF表观消化率无显著差异(P>0.05)。山羊Ⅲ组OM、CP、ADF表观消化率，Ⅳ组DM、OM、CP表观消化率显著低于Ⅰ组(P＜0.05)。Ⅳ组OM、CP表观消化率显著低于Ⅲ组(P＜0.05)。绵羊Ⅲ组DM、NDF表观消化率，Ⅳ组OM、CP消化率显著高于山羊(P＜0.05)，推测绵羊对单宁的耐受能力比山羊强。

表3

Table 1

表3(Table 3)

表3 不同水平的单宁酸和高单宁饲粮添加PEG对绵羊和山羊营养物质表观消化率的影响 Table 3 Effects of different levels of tannin and high tannin diet supplemented with PEG on nutrient apparent digestibility of sheep and goats % 项目 Items 组别 Groups SEM P值 P-value 营养物质 Nutrients 品种 Species Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 处理 Treatment 品种 Species 处理×品种 Treatment× species 干物质 DM 绵羊 Sheep 66.32 69.10 70.21A 63.77 2.86 0.017 0.005 0.051 山羊 Goat 69.31a 64.37a 58.33Bab 50.80b 3.57 SEM 3.37 2.00 3.13 3.76 有机物 OM 绵羊 Sheep 69.29 71.61 66.98 65.70A 3.05 ＜0.001 0.010 0.011 山羊 Goat 72.81a 69.24ab 60.78b 47.01Bc 3.12 SEM 2.91 2.67 4.79 4.33 粗蛋白质 CP 绵羊 Sheep 75.19 77.98 65.83 72.78A 3.39 ＜0.001 0.005 0.002 山羊 Goat 77.19a 73.77ab 65.40b 46.05Bc 3.49 SEM 2.75 3.52 2.78 3.80 中性洗涤纤维 NDF 绵羊 Sheep 70.03 72.26 76.27A 71.62 2.43 0.556 0.021 0.132 山羊 Goat 72.59 68.99 62.72B 62.30 3.76 SEM 4.08 2.18 2.59 3.99 酸性洗涤纤维 ADF 绵羊 Sheep 57.98 60.97 59.33 56.70 3.89 0.215 0.811 0.422 山羊 Goat 60.03a 65.97a 49.56b 56.48ab 6.17 SEM 3.96 3.32 5.89 5.02 　同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，同列数据肩标不同大写字母表示差异显著(P＜0.05)。下表同。 　Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference (P＜0.05),and in the same column with different capital letter superscripts mean significant difference (P＜0.05). The same as below.

表3 不同水平的单宁酸和高单宁饲粮添加PEG对绵羊和山羊营养物质表观消化率的影响 Table 3 Effects of different levels of tannin and high tannin diet supplemented with PEG on nutrient apparent digestibility of sheep and goats

从表4可以看出，绵羊和山羊在0和6 hⅡ组原虫数量与Ⅰ组无显著差异(P>0.05)。绵羊和山羊Ⅲ组的原虫数量与Ⅰ组相比有下降的趋势，且山羊在0 hⅢ组的原虫数量显著低于Ⅰ组(P＜0.05)。与Ⅳ组相比，绵羊和山羊Ⅰ和Ⅱ组的原虫数量均提高，与绵羊Ⅰ组0 h和山羊Ⅱ组0 h差异不显著(P>0.05)，0 h绵羊Ⅱ组、山羊Ⅰ组，6 h绵羊和山羊Ⅰ和Ⅱ组均显著提高(P＜0.05)。品种间比较发现0、6 h各组绵羊和山羊之间瘤胃原虫数量无显著差异(P>0.05)。

表4

Table 1

表4(Table 4)

表4 不同水平的单宁酸和高单宁饲粮添加PEG对绵羊和山羊瘤胃原虫数量的影响 Table 4 Effects of different levels of tannin and high tannin diet supplemented with PEG on ruminal protozoa quantity of sheep and goats lg(个/mL) 时间 Time/h 品种 Species 组别 Groups SEM P值 P-value Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 处理 Treatment 品种 Species 处理×品种 Treatment×species 0 绵羊 Sheep 5.54ab 5.59a 5.38ab 5.17b 0.12 0.006 0.185 0.450 山羊 Goat 5.60a 5.51ab 4.97b 5.02b 0.17 SEM 0.05 0.16 0.16 0.19 6 绵羊 Sheep 5.48a 5.53a 5.35ab 5.00b 0.13 ＜0.001 0.679 0.653 山羊 Goat 5.46a 5.65a 5.29a 4.80b 0.12 SEM 0.05 0.13 0.17 0.16

表4 不同水平的单宁酸和高单宁饲粮添加PEG对绵羊和山羊瘤胃原虫数量的影响 Table 4 Effects of different levels of tannin and high tannin diet supplemented with PEG on ruminal protozoa quantity of sheep and goats

目标片段在胶回收之后进行克隆，挑取得单克隆菌落于液体培养基中，摇菌过夜之后，提取质粒，进行PCR检测，被确证为目的片段后送检测序。

通过对阳性克隆插入片段的测序，结果表明阳性克隆片段与总细菌的片段同源性为97%，总厌氧真菌的片段同源性为100%，且包含完整的引物序列，说明成功构建了有目的片断的质粒，该质粒可用于质粒标准品的制作。

总细菌(y1)和总厌氧真菌数量(y2)根据Ct(x)的标准曲线公式如下：

y1=-3.20 lg(x)+43.13，R²=1.000；

y2=-3.33 lg(x)+43.31，R²=0.993。

标准曲线相关系数大于0.99，扩增效率在95%~106%之间，符合实时定量PCR标准曲线要求。

从表5可以看出，0 h与Ⅰ组相比，绵羊和山羊Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组总细菌数量显著降低(P＜0.05)；绵 羊Ⅱ组，山羊Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组总厌氧真菌数量显著降低(P＜0.05)。6 h与Ⅰ组相比，山羊Ⅱ和Ⅲ组总细菌数量降低，但变化不显著(P>0.05)；山羊Ⅱ和Ⅲ组总厌氧真菌数量有降低的趋势(P>0.05)；绵羊Ⅱ组总厌氧真菌数量显著降低(P＜0.05)。山羊Ⅳ组0和6 h总细菌数量和6 h总厌氧真菌数量显著高于Ⅱ和Ⅲ组(P＜0.05)；绵羊Ⅳ组6 h总厌氧真菌数量显著高于Ⅱ组(P＜0.05)。品种间比较发现，6 hⅢ组绵羊总厌氧真菌数量显著高于山羊(P＜0.05)。

表5

Table 1

表5(Table 5)

表5 不同水平的单宁和高单宁饲粮添加PEG对绵羊和山羊瘤胃总细菌和总厌氧真菌数量的影响 Table 5 Effects of different levels of tannin and high tannin diet supplemented with PEG on ruminal quantity of general bacteria and general anaerobic fungi of sheep and goats lg(个/mL) 时间 Time/h 项目 Items 品种 Species 组别 Groups SEM P值 P-value Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 处理 Treatment 品种 Species 处理×品种 Treatment×species 0 总细菌 General bacteria 绵羊 Sheep 13.31a 12.30b 12.70b 12.55b 0.13 ＜0.001 0.614 0.013 山羊 Goat 13.82a 12.19c 12.32c 12.70b 0.11 SEM 0.10 0.13 0.10 0.16 总厌氧真菌 General anaerobic fungi 绵羊 Sheep 10.01a 9.14b 9.70a 9.64ab 0.16 ＜0.001 0.001 0.548 山羊 Goat 9.83a 8.54c 9.15b 9.05bc 0.19 SEM 0.16 0.14 0.26 0.14 6 总细菌 General bacteria 绵羊 Sheep 12.02 11.84 11.61 12.16 0.17 0.008 0.691 0.300 山羊 Goat 12.14ab 11.46b 11.62b 12.70a 0.26 SEM 0.13 0.24 0.29 0.22 总厌氧真菌 General anaerobic fungi 绵羊 Sheep 9.41ab 8.78b 9.02Aab 9.84a 0.24 ＜0.001 0.425 0.121 山羊 Goat 9.66a 8.71b 8.11Bc 10.04a 0.18 SEM 0.23 0.20 0.17 0.23

表5 不同水平的单宁和高单宁饲粮添加PEG对绵羊和山羊瘤胃总细菌和总厌氧真菌数量的影响 Table 5 Effects of different levels of tannin and high tannin diet supplemented with PEG on ruminal quantity of general bacteria and general anaerobic fungi of sheep and goats

反刍动物可以有效地消化饲料主要得益于瘤胃内的微生物。Krause等^[13]研究指出，厌氧真菌在瘤胃中的主要作用可能是分泌的高活性酶，裂解植物木质化组织，降低植物的物理张力，从而有利于瘤胃微生物对底物的附着和降解，而瘤胃细菌是主要的植物纤维降解微生物。单宁通常被认为对瘤胃微生物的生长有抑制作用，Min等^[14]研究表明，百脉根缩合单宁能够降低瘤胃微生物对蛋白质的降解速度，同时能够抑制部分蛋白质降解菌的生长。Molan等^[15]发现，当将细菌生长在高缩合单宁的培养基中，除反刍动物半月形单胞菌能够正常生长外，其他微生物生长均受到抑制。Foley等^[16]研究表明补饲PEG能够减弱单宁对酶和微生物活性的抑制作用，提高营养物质在瘤胃中的消化和利用率。本试验中绵羊和山羊2%和6%单宁添加组瘤胃细菌数量均低于对照组，其原因可能是单宁与瘤胃细菌，尤其是蛋白质分解菌的细胞壁反应形成聚合物，降低了细菌的活性。关于单宁对瘤胃总厌氧真菌生长的影响，前人报道较少。McSweeney等^[17]研究指出，绵羊饲粮中添加含单宁的粗饲料会显著降低瘤胃纤维降解菌的数量，但是厌氧真菌的生长繁殖受单宁的影响较小。本试验得出绵羊0 hⅢ组，6 hⅡ和Ⅲ组瘤胃总厌氧真菌数量与对照组无显著差异，这一结果与前人的报道是一致的，其具体机理还有待进一步研究。本研究得出按单宁摄入量的2倍投喂PEG显著增加了山羊瘤胃总细菌的数量，其原因可能是PEG与单宁的结合力更强，削弱了单宁对细菌生长的影响，促进瘤胃细菌的增殖。

存在于瘤胃中的原虫可大量吞噬淀粉颗粒，稳定高精料饲粮下瘤胃发酵模式，提高瘤胃内纤维和OM消化率、稳定瘤胃内pH。丁学智^[18]研究表明单宁可显著降低原虫的数量。薛树媛^[19]在研究单宁的抗营养作用时发现少量植物单宁可以抑制原虫生长，减少绵羊瘤胃产甲烷菌的数量，降低甲烷能的损失。本试验中，2%单宁添加组的原虫数量与对照组相比无显著差异，6%单宁添加组的原虫数量相对于对照组有所下降，结合本试验得出的添加2%和6%单宁瘤胃固相食糜总细菌基因拷贝数显著低于对照组，以及本课题组前期研究发现的添加单宁瘤胃纤维降解菌数量显著下降^[20]的结果，笔者认为单宁对细菌的抑制作用可能比对原虫的抑制作用更强。本研究中，试验动物是在舍饲条件下进行各期试验的，4期试验中室内的温度、湿度等各方面饲养条件基本一致，所以，本研究中观察到绵羊和山羊4组间瘤胃微生物数量和营养物质表观消化率的差异主要是由于试验的不同处理所导致的。

前人研究表明，单宁最主要的负作用是影响瘤胃微生物对蛋白质的降解^[21]。单宁易与饲料中蛋白质结合并降低瘤胃微生物活性，从而影响饲料消化率。本试验得出，绵羊营养物质表观消化率单宁添加组与对照组无显著差异，而山羊随单宁摄入量的增加，营养物质受到的负面影响也随之加深，这一结果与绵羊和山羊各组之间瘤胃总细菌数量的变化趋势是一致的。Salem等^[4]研究表明，当绵羊采食新鲜的、晒干的和用PEG处理过的洋槐(Acacia cyanophylla)时，绵羊对用PEG处理后的Acacia cyanophylla的DM表观消化率相对于前两者均有所提高(57.5%、60.8%、61.9%)。刘艳玲^[5]指出，饲喂柠条颗粒饲料的绵羊在采食PEG后对饲料中DM、OM、CP、NDF和ADF的表观消化率显著提高。本试验的结果与前人的研究结果不一致，这可能是由于试验动物单宁酸摄入量不同所致。单宁不仅可以影响动物对饲料蛋白质、碳水化合物的消化，还可损伤小肠黏膜^[22]，其毒性作用还会使动物出现食欲减退或废绝、停止反刍、便秘、粪便黏稠呈黑色等中毒症状^[23]。试验过程中我们发现单宁酸的添加量达到6％时，4只山羊中有3只山羊的采食量明显下降，并出现精神萎靡，粪便黏稠，尿液浑浊的情况。而且由于6％单宁酸饲喂动物长达1个月，可能对动物造成较强的系统毒性，小肠黏膜结构可能遭受了不可逆的损伤，从而导致高单宁酸饲粮中添加PEG后营养物质消化率未能得以提高。

① 补饲2%和6%的单宁能够显著降低瘤胃总细菌和总厌氧真菌的数量。

② PEG可削弱单宁对瘤胃总细菌生长的影响。

③ 单宁补饲量达到6%时，显著降低山羊对饲粮OM、CP、ADF的表观消化率。