蛋白质资源短缺是世界性的大问题。我国人多粮少，粮食产量不高，蛋白质饲料更显缺乏，每年都要从国外进口大量的鱼粉、豆粕等蛋白质饲料原料。根据中国国家饲料工业办公室的估算，我国蛋白质饲料资源年缺口达到3 000万t以上，到2020年缺口将达4 800万t，成为制约畜牧业发展的重要因素。解决的方法之一是充分利用除豆粕、鱼粉之外的其他蛋白质原料，开发新的非常规蛋白质资源，包括目前未被很好利用的棉籽粕、菜籽粕等众多的杂粕资源。我国是世界上棉花生产大国之一，棉籽粕年产500万t以上。但是，由于其氨基酸含量不平衡，且利用率差，特别是棉酚等抗营养因子的存在，严重制约了这种蛋白质饲料资源的利用[1, 2]，尤其在蛋鸡生产中的利用率较低。
棉籽粕是重要的蛋白质饲料资源，其蛋白质含量因脱壳程度的不同而不同。一般地，脱壳棉籽加工所得的棉籽粕，蛋白质含量可达41%~42%[3, 4, 5]，脱壳的棉籽加工成的棉籽蛋白，其粗蛋白质含量可高达50%以上。棉籽粕中的抗营养因子主要有棉酚和环丙烯类脂肪酸，由于它们的存在，限制了棉籽粕在畜禽饲料中的应用，其中起主要作用的是具有毒性的棉酚。《饲料卫生标准》(GB 13078—2001)规定了产蛋鸡配合饲粮中游离棉酚(free gossypol,FG)含量的最高限值为≤20 mg/kg。存在于棉籽粕中的棉酚有2种形式，即游离棉酚和结合棉酚(bound gossypol,BG)。游离棉酚以游离状态存在，由于其活性基团未被结合，很易发生化学反应，而且排泄缓慢，在体内组织器官中具有蓄积效应，因此对动物毒性较大。蓄积的棉酚在动物体内各器官分布是不均衡的，按其沉积量的多少排序为：肝脏>肌肉>血液>肾脏>肺，之后为心脏、脾脏和脑组织[6]。而且，近年来的研究发现，结合棉酚在动物消化过程中，能够释放出游离棉酚，可被消化道吸收[7, 8, 9]。Abou-Donia等[10]通过14C标记棉酚研究了其在肝脏亚细胞结构中的分布，结果表明大量的棉酚聚集在微粒体和线粒体膜上，而胞核内数量很少。线粒体是细胞呼吸、能量供应和氧化、磷酸化的重要细胞器，线粒体损伤会造成细胞死亡[11, 12]。
但是，目前针对长期饲喂含游离棉酚饲粮对蛋鸡肝脏棉酚蓄积规律及其对肝脏功能和生产性能影响的报道较少。本研究通过设置不同游离棉酚水平饲粮长期饲喂蛋鸡，旨在研究游离棉酚在蛋鸡肝脏中的蓄积规律，以及对蛋鸡肝脏组织结构及生产性能、蛋品质的影响，为更好的在蛋鸡生产中使用棉籽粕提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验所用棉籽粕为新疆产，游离棉酚含量按GB/T 13086—1991方法实验室实测值为510 mg/kg，粗蛋白质含量按GB/T 6432—1994方法实验室实测值为48.86%。
1.2 试验设计、试验饲粮及饲养管理23周龄海兰褐蛋鸡270只，随机分为3组，分 别为对照(CON)组和试验(FG20和FG40)组，每组设3个重复，每个重复30只，CON组饲喂不含游离棉酚的玉米-豆粕型饲粮，FG20组和FG40组分别饲喂游离棉酚水平为20和40 mg/kg的含游离棉酚饲粮。试验饲粮组成参考《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)制定，饲粮为自配粉状饲料，试验饲粮组成及营养水平见表1。
 | 表 1 试验饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) |
试验过程中，所有试验鸡均采用自制大笼饲养(180 cm×180 cm，设有栖架和产蛋箱)，每笼30只。饲养管理按海兰褐商品蛋鸡推荐方法进行，每天喂料2次，自由采食和饮水。试验期45周。
1.3 测定指标与方法 1.3.1 肝脏游离棉酚含量试验第5、15、25、35和45周，每个重复随机取试验鸡3只，处死，取肝脏样品-20 ℃保存。参考Kim等[13]和Hron等[14]的方法，以高效液相色谱法测定肝脏中游离棉酚含量。液相参数为，Waters 510型液相色谱仪，AccurasilC18 250 mm×4.6 mm反相色谱柱和2 cm C18保护柱，0.9 mL/min流速等度洗脱，进样体积20 μL。棉酚以棉酚-氨丙醇复合物(GA)的形式检测，紫外检测器波长为254 nm，灵敏度0.5 AUFS。
1.3.2 肝脏组织结构观察试验第45周，取试验鸡肝脏样品，福尔马林固定，以常规方法制作石蜡切片，苏木精-伊红(HE)染色，镜检观察。另取CON组与FG40组试验鸡，处死后快速取肝脏样品，戊二醛和锇酸固定后，乙醇梯度脱水，Epon812树脂浸透、包埋，超薄切片，以醋酸双氧铀、柠檬酸铅双重染色，透射电镜(JEM-1200EX，日本电子株式会社)观察、照相。
1.3.3 生产性能及产蛋性能按重复记录试验鸡每天产蛋数、产蛋量和死淘鸡数及每周耗料量，每5周统计各组试验鸡产蛋率、蛋重、耗料量、体增重及料蛋比，按试验前期(1~15周)、中期(16~30周)和后期(31~45周)统计各组试验鸡死淘率。
1.3.4 蛋品质每5周，每重复随机取3枚鸡蛋，测定蛋品质和蛋壳质量，每次连续测定3 d，计算平均值。蛋形指数以“(横径/纵径)×100”计算，蛋壳厚度、蛋壳强度分别以蛋壳厚度测量仪(ETG-1061，日本Robotmation公司)和蛋壳强度测试仪(EFG-0503，日本Robotmation公司)测定，哈夫单位、蛋黄颜色以多功能蛋品检测仪(EMT-5200，日本Robotmation公司)测定。
1.4 数据分析数据统计采用SAS(Version 8e，SAS Institute，1998)统计软件进行。采用重复测量数据的方差分析(reapted measurement analysis)进行统计分析，如果组件效应差异显著(P＜0.05)，各平均值采用Duncan氏法进行多重比较。试验数据用平均值±标准差(mean±SE)表示，P＜0.05表示差异显著。
2 结果与分析 2.1 游离棉酚在蛋鸡肝脏中的蓄积规律使用含20和40 mg/kg游离棉酚的饲粮连续饲喂蛋鸡45周，其肝脏中游离棉酚含量的测定结果如图1所示。结果表明，随饲喂时间延长，含游离棉酚饲粮饲喂的蛋鸡肝脏中游离棉酚的沉积量明显增加，而且对比FG20组和FG40组数据可见，肝脏中游离棉酚的沉积量具有明显的剂量效应，经过连续45周饲喂，这2个组蛋鸡肝脏中游离棉酚的含量分别达462和955 μg/g。
 | 图 1 蛋鸡肝脏中游离棉酚含量 Fig. 1 Content of free gossypol of laying hens liver |
由图2可知，肝脏组织学切片镜检表明，与未使用含游离棉酚饲粮的蛋鸡肝脏组织(图2-A)相比，饲喂含游离棉酚饲粮蛋鸡肝脏组织发生明显变化，肝细胞均有不同程度的脂肪变性，胞浆中有数目不等的脂肪滴(图2-B)，肝脏结构紊乱，肝细胞肿胀，基本轮廓消失，有炎性细胞浸润现象(图2-C)。
 | 图 2 蛋鸡肝脏组织切片 Fig. 2 The tissue section of laying hens liver (400×) |
由图3可知，肝脏组织电镜切片观察表明，含游离棉酚饲粮长期饲喂蛋鸡，其肝脏亚细胞结构与未使用含游离棉酚饲粮蛋鸡肝脏组织(图3-A)相比，肝细胞的核膜增厚、断裂(图3-B)，线粒体肿胀，线粒体膜破坏，内部嵴断裂溶解，内质网池破坏(图3-C)，细胞中液泡数量增多，并有脂滴存在(图3-D)。
 | 图 3 蛋鸡肝脏电子显微镜切片 Fig. 3 The electron microscopic section of laying hens liver (25 000×) |
由表2可知，蛋鸡产蛋率没有显著差异(P＞0.05)，饲喂含游离棉酚饲粮对试验全期(1~45周)蛋鸡耗料量有增加的趋势(P=0.093 5)，但对料蛋比没有显著影响(P＞0.05)，试验全期蛋鸡平均增重约为300 g，不同时间点各组试验蛋鸡体增重均无显著变化(P＞0.05)。
| 表 2 不同游离棉酚水平饲粮对蛋鸡生产性能的影响 Table 2 Effects of different free gossypol levels on performance of laying hens |
由表3可知，试验鸡死淘率的统计结果表明，不同水平的含游离棉酚饲粮对蛋鸡产蛋前期(1~15周和16~30周)死淘率没有显著影响(P＞0.05)，但显著增加产蛋后期(31~45周)蛋鸡死淘率(P＜0.05)，而且这种影响具有剂量效应，FG40组显著高于FG20组(P＜0.05)。试验全期，FG20组与FG40组蛋鸡死淘率无显著差异(P＞0.05)，但均显著高于对照组(P＜0.05)。
| 表 3 不同游离棉酚水平饲粮对蛋鸡死淘率的影响 Table 3 Effects of different free gossypol levels on mortality and elimination rate of laying hens |
由表4可知，试验结果表明，各试验组蛋重未因饲粮中含有不同水平游离棉酚产生显著的差异(P＞0.05)，试验全期平均蛋重为63.0 g左右；试验全期各组破蛋率无显著差异(P＞0.05)。
| 表 4 不同游离棉酚水平饲粮对蛋鸡产蛋性能的影响 Table 4 Effects of different free gossypol levels on laying performance of laying hens |
由表5可知，与对照组相比，试验蛋鸡长期饲喂含游离棉酚饲粮导致1~5周、6~10周蛋黄颜色显著增加(P＜0.05)，而饲粮中游离棉酚水平对各时期蛋壳厚度(除41~45周外)、哈夫单位均无显著影响(P＞0.05)，对蛋形指数(除16~20周外)和蛋壳强度(除36~40周外)影响也无显著显著(P＞0.05)。
| 表 5 不同游离棉酚水平饲粮对蛋鸡蛋品质的影响 Table 5 Effects of different free gossypol levels on egg quality of laying hens |
棉酚被动物吸收后大部分经胆汁随粪便排出，少量随尿液排出，也可以由乳排出。棉酚在动物体内各器官中的残留是不均匀的，肝脏含量最多，其次是胆汁、肾脏、脾脏和血液，而淋巴结、心脏、肺、膈肌和胰脏中的含量较低[15, 16]。另外一些研究也同样证明，在羊[17, 18]和肉鸡[19, 20]等动物体内，棉酚残留最先在肝脏中蓄积。
Gamboa等[19]和Lordelo等[20]的研究均表明肉鸡肝脏、肾脏、血液、心脏和肌肉中游离棉酚含量与饲粮中游离棉酚含量呈显著线性相关。Lordelo等[20]研究表明，肉鸡饲粮游离棉酚水平达到最大允许水平(100 mg/kg)时，肉鸡肝脏、肾脏和肌肉中游离棉酚含量分别为32.7、6.3和1.1 mg/kg。本研究的结果表明，用含游离棉酚20和40 mg/kg的饲粮饲喂蛋鸡，其肝脏中游离棉酚的沉积量呈现显著的时间和剂量效应，饲喂5、25和45周后肝脏中游离棉酚的含量分别达到60、185、462和462、642、955 mg/kg，与前人的研究结果相符。
3.2 棉酚蓄积对肝脏组织的影响张志峰等[21]报道了饲喂含游离棉酚162.5 mg/kg的饲粮致育肥猪中毒死亡的病例，剖检发现其肝脏体积增大，质地变硬，腹腔中有大量黄色炎性渗出物，切片镜检发现肝小叶周边区的肝细胞体积增大，发生明显的水泡变性，部分肝细胞萎缩，严重病变区肝细胞坏死，结构模糊。庄元忠等[22]研究了棉酚对肝脏和肾脏的影响，4 mg/kg棉酚连续饲喂猕猴2年，电镜观察发现有相当数量肝细胞发生了不同程度的变化，部分细胞核呈多角形，粗面内质网扩张，滑面内质网数量略增多，线粒体嵴断裂，部分细胞核固缩，线粒体坏死。周兰芳等[23]利用大鼠研究了连续4周每天给予15和30 mg/kg醋酸棉酚对其肝脏组织亚细胞结构的影响，结果表明，15 mg/kg给药组肝细胞粗面内质网部分呈不规则样扩张，可见连续空泡肿胀，滑面内质网腔扩大，少数线粒体肿胀，基质空化，30 mg/kg给药组肝细胞线粒体肿胀，嵴消失，细胞核与胞质间隙增大。
本研究的结果与前述研究一致，含20和40 mg/kg游离棉酚的饲粮长期饲喂蛋鸡造成蛋鸡肝脏组织结构紊乱，肝细胞肿胀，基本轮廓消失，发生颗粒变性、水泡变性、炎性细胞浸润等问题，亚细胞观察也可见肝细胞核膜增厚、断裂，线粒体肿胀，线粒体膜破坏，内部嵴断裂溶解，内质网池破坏。结果提示了棉酚造成了蛋鸡肝脏组织损伤，其原因可能与棉酚毒性对肝细胞的直接损害有关。
3.3 棉酚对蛋鸡生产性能的影响关于棉酚对蛋鸡生产性能的影响，现有研究已取得的结果不尽相同。冷青文等[24]研究表明，利用含游离棉酚78 mg/kg的饲粮饲喂45周龄海兰褐蛋鸡，其产蛋率和平均蛋重显著下降。李建国等[25]报道，43周龄海兰褐蛋鸡饲喂游离棉酚含量分别为0、20、70和120 mg/kg的饲粮，10周后对产蛋率无显著影响，70 mg/kg的游离棉酚组蛋鸡的日采食量略有下降，120 mg/kg 游离棉酚组日采食量显著降低，平均蛋重显著降低。Panigrahi等[26]也报道，饲粮中棉酚为255 mg/kg可极显著降低蛋鸡的采食量和产蛋量。但是，Lordelo等[16]研究发现，饲粮中含200和400 mg/kg棉酚负异构体在试验各期对产蛋量均无显著影响。方琴音[27]和杨茹洁[28]研究也表明，蛋鸡饲粮中游离棉酚含量分别达到200和179 mg/kg时对蛋鸡生产性能的影响不显著。
以上研究结果的差异可能与试验饲粮配制过程是否采取氨基酸平衡模式有关，也可能与棉籽粕加工方式不同引起棉籽粕中营养物质及游离棉酚含量及存在形式差异有关。但是，总体上，以生产性能为衡量指标时，蛋鸡对游离棉酚的耐受性较高。本研究的结果也表明，饲粮中含游离棉酚水平较低(20和40 mg/kg)对蛋鸡产蛋率、耗料量、料蛋比等参数均未产生显著影响。但是，长期饲喂含游离棉酚饲粮增加了蛋鸡死淘率，尤其是产蛋后期蛋鸡的死淘率显著升高，这可能与棉酚蓄积造成的蛋鸡肝脏功能损伤有关。
3.4 棉酚对蛋品质的影响研究的结果表明，含20和40 mg/kg游离棉酚饲粮饲喂蛋鸡45周未引起所产鸡蛋蛋白高度和哈夫单位的显著性变化。本研究条件下，使用含游离棉酚饲粮对鸡蛋品质的主要影响反映在蛋黄颜色，与对照组相比，含游离棉酚饲粮的长期饲喂导致鸡蛋蛋黄颜色的增加，影响蛋品质。前人的研究也取得了相似的结果。Lordelo等[16]研究表明，蛋鸡采食400 mg/kg正消旋纯棉酚饲粮20 d，蛋黄颜色评分及异常蛋检出率显著升高。陈连颐等[29]的研究也表明，游离棉酚导致蛋黄颜色增加，且煮熟后的蛋黄随色泽的增加而逐渐变硬。方琴音[27]以38周龄新罗曼蛋鸡为研究对象，饲粮中游离棉酚含量为30 mg/kg，试验第1周末各组鸡蛋就出现蛋黄变色。Gilani等[30]用含10%棉籽粕饲粮(游离棉酚含量71 mg/kg)饲喂51周龄海兰蛋鸡12周，蛋黄颜色显著升高。已有的研究表明，使用含游离棉酚较高的棉籽粕饲粮饲喂蛋鸡导致蛋黄变色的可能原因是由于棉酚和蛋白质结合，蛋黄膜超微结构发生变化，蛋黄中钙、铁元素流失到蛋清中，而导致了鸡蛋在储存过程中蛋黄变褐、变硬的现象出现[31]。
4 结 论含有20和40 mg/kg游离棉酚的饲粮长期饲喂蛋鸡，引起蛋鸡肝脏中棉酚的蓄积，且有明显的剂量效应，试验结束时蛋鸡肝细胞结构发生紊乱，线粒体和内质网损伤。本试验条件下，含游离棉酚饲粮长期饲喂未引起蛋鸡生产性能和产蛋性能的显著性变化，但产蛋后期(31~45周)蛋鸡的死淘率显著增加，而且含游离棉酚饲粮引起1~10周蛋黄颜色显著增加。结果证明，含游离棉酚饲粮长期饲喂蛋鸡会造成其肝脏中游离棉酚的蓄积，进而影响其肝脏功能，但饲粮游离棉酚含量为20和40 mg/kg对于蛋鸡生产性能影响较小。
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