葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,E.C.1.1.3.4，GOD)是一种需氧脱氢酶，属氧化还原酶类，在有氧气的条件下专一性催化β-D-葡萄糖，生成葡萄糖酸和过氧化氢^[1]。自1999年国家农业部认定葡萄糖氧化酶为新型酶饲料添加剂以来，葡萄糖氧化酶在动物饲粮中使用愈来愈广泛。许多研究表明，在动物饲粮中添加一定量的葡萄糖氧化酶不仅能促进生长，提高饲料转化率^[2]，还能杀灭肠道内有害菌，改善肠道健康^[3]，增强机体免疫力^{[4, 5, 6, 7]}。由于抗生素滥用而造成的环境污染和产生具耐药性的超级细菌等问题，已引起人们高度重视，抗生素耐药性已成为“当今世界面临的最紧迫的公共卫生问题之一”。替代抗生素的饲料添加剂的应用研究日益增多，关于葡萄糖氧化酶能否达到抗生素效果的研究鲜见报道。本试验通过考察葡萄糖氧化酶对断奶仔猪生长性能、养分消化率及肠道微生物和形态结构的影响，探讨葡萄糖氧化酶替代饲粮中金霉素的效果，以期为葡萄糖氧化酶在断奶仔猪饲粮中的推广应用提供参考。

试验采用单因素完全随机化设计。选取体重(8.71±0.13) kg的“杜长大”三元杂交断奶仔猪300头，随机分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3个组，每个组5个重复，每个重复20头猪，公母各占1/2。试验Ⅰ组为对照组，饲喂基础饲粮；试验Ⅱ组在基础饲粮基础上添加0.1%的金霉素；试验Ⅲ组在基础饲粮基础上添加200 g/t的葡萄糖氧化酶。试验预试期3 d，正试期28 d。

试验基础饲粮参照NRC(2012)仔猪营养需要配制仔猪饲粮，其饲粮组成及营养水平见表1。葡萄糖氧化酶制剂由湖南鸿鹰生物科技有限公司提供，酶活性为1 000 U/g。试验地点为广西金陵集团雄桂种猪场。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % 原料 Ingredients 含量 Content 营养水平 Nutrient levels2) 含量 Content 玉米 Corn 61.5 消化能 DE/(MJ/kg) 13.60 豆粕 Soybean meal 26.0 粗蛋白质 CP 18.88 鱼粉 Fish meal 3.3 钙 Ca 0.91 乳清粉 Whey powder 2.2 总磷 TP 0.62 磷酸氢钙 CaHPO4 1.0 有效磷 AP 0.36 葡萄糖 Glucose 2.0 赖氨酸 Lys 1.28 石粉 Limestore 0.9 蛋氨酸 Met 0.39 氯化胆碱 Choline chloride 0.1 苏氨酸 Thr 0.82 预混料 Premix1) 3.0 蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys 0.66 合计 Total 100.0 色氨酸 Try 0.22 1)预混料可为每千克饲粮提供Premix provided the following per kg of the diet:VA 10 000 IU，VD3 3 000 IU，VE 25 IU，VK 2 mg，VB1 2 mg，VB2 6 mg，VB6 2 mg，VB12 0.2 mg，泛酸钙 calcium pantothenate 25 mg，烟酸 nicotinic acid 35 mg，生物素 biotin 0.15 mg，叶酸 folic acid 2 mg，Cu 10 mg，Fe 170 mg，Zn 130 mg，Mn 40 mg，Se 0.3 mg，I 0.6 mg，食盐 NaCl 3 g。 2)营养水平为计算值。Nutrient levels were calculated values.

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

3组分别饲喂对应的试验饲粮，早、中、晚各1次。自由饮水采食，自然采光通风。按猪场常规程序进行消毒、驱虫和免疫。

在试验期内每天对猪的采食量、余料量等进行收集及记录。期间收集猪在第7、14和21天08:00至18:00排出的全部粪便。每次收集的粪便及时装入样品袋，置于-20 ℃冰箱中保存。试验结束后，将每头猪排出的所有粪样分别搅拌混合均匀后，置于65 ℃烘箱干燥，粉碎，待测。试验结束时，每个组的每个重复各选择1头个体大小较为一致的猪，进行屠宰。

每天记录腹泻、粪便、毛色等情况。分别于试验开始和结束时，早晨空腹个体称重，以重复为单位记录耗料量，计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。计算腹泻率：

腹泻率(%)=[试验全期腹泻头次/
(试验头数×试验天数)]×100。

采用内源指示剂法测定饲粮和粪便中盐酸不溶灰分的含量，测定养分消化率。养分消化率计算公式：

某养分消化率(%)=100-(粪中
某养分含量×饲料中盐酸不溶灰分
含量/饲料中某养分含量×
粪中盐酸不溶灰分含量)×100。

胃肠道食糜pH测定：仔猪宰杀后立刻用pH计测定胃、空肠、回肠、十二指肠、盲肠及结肠内容物的pH。

肠道菌群检测：取胃、回肠、盲肠肠道中的食糜1 g左右，立即转移到灭菌离心管中，加入10倍体积的无菌稀释液，剧烈振摇，充分溶解，逐级稀释至10^-6。每个样品选择10^-4、10^-5、10^-6 3个稀释度，由高稀释度开始，用微量取样器吸取10 μL滴入厌氧菌培养基平皿内，用灭菌曲玻棒推匀，每个稀释度作3个平板。大肠杆菌接种于麦康凯培养基平皿上，乳酸杆菌接种于乳酸杆菌选择性培养基(LBS)平皿上，大肠杆菌在37 ℃人工气候箱中培养24 h，乳酸杆菌在YXQ-2型气培养箱[混合气比例：二氧化碳(CO₂)80%、氮气(N₂)15%、氢气(H₂)5%]中培养48 h后计数，采用平板菌落计数法，以50~150个菌落平板的稀释度作为计数用，细菌数量用肠道内容物中细菌个数的对数[lg(CFU/g)]表示。

肠道形态结构检测：取肠道的十二指肠、空肠、回肠各2 cm左右，用玻璃棒轻轻刮去消化道食糜，用生理盐水冲洗净，然后用吸干纸吸干消化道残余水分，置于10%甲醛磷酸缓冲液中固定，脱水→透明→浸腊→包理→修块等处理后，制成5 μm厚切片，用苏木精-伊红染色法染色，荧光显微镜选择典型视野拍摄图片，并用Leica Qwin图像分析系统进行观察分析，每张切片测量绒毛高度(VH)和隐窝深度(CD)，并计算VH/CD。

试验数据用使用SAS 13.0统计软件进行单因素方差分析，Duncan氏法多重比较；所有数据均以“平均值±标准差”表示，P＜0.05为显著性检验标准。

由表2可知，与试验Ⅰ组相比，试验Ⅱ、Ⅲ组平均日增重显著提高(P＜0.05)；试验Ⅲ组的平均日采食量显著高于试验Ⅰ和Ⅱ组(P＜0.05)；试验Ⅲ组的料重比显著低于试验Ⅰ组(P＜0.05)，与试验Ⅱ组之间没有显著差异(P＞0.05)，试验Ⅰ组和试验Ⅱ组之间的平均日采食量、料重比未见有显著差异(P＞0.05)。试验Ⅱ、Ⅲ组仔猪腹泻率比试验Ⅰ组下降了57.12%和54.21%(P＜0.05)，试验Ⅱ组与试验Ⅲ组的腹泻率没有显著差异(P>0.05)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 葡萄糖氧化酶对仔猪生长性能和腹泻率的影响 Table 2 Effects of glucose oxides on growth performances and diarrhea rate of piglets 项目 Items 试验Ⅰ组 Test group Ⅰ 试验Ⅱ组 Test group Ⅱ 试验Ⅲ组 Test group Ⅲ 初重 Initial weight/㎏ 8.65±0.11 8.77±0.06 8.71±0.18 末重 Final weight/㎏ 25.26±0.34b 26.14±0.49a 27.20±0.21a 平均日增重 ADG/(g/d) 553.7±41.5b 579.0±53.2a 616.3±28.9a 平均日采食量 ADFI/(g/d) 724.7±25.2b 751.5±18.2b 778.4±34.1a 料重比 F/G 1.31±0.09a 1.30±0.16ab 1.26±0.05b 腹泻率 Diarrhea rate/% 7.2±1.1a 3.1±1.3b 3.3±1.9b 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，肩标不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)，肩标相同字母或无字母表示差异不显著(P＞0.05)。下表同。 In the same row,values with different small letter superscripts mean significant difference (P < 0.05),values with different capital letter superscripts mean significant difference (P < 0.01),while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P > 0.05). The same as below.

表2 葡萄糖氧化酶对仔猪生长性能和腹泻率的影响 Table 2 Effects of glucose oxides on growth performances and diarrhea rate of piglets

由表3可知，试验Ⅱ、Ⅲ组的干物质和粗蛋白 质的消化率显著高于试验Ⅰ组(P＜0.05)，试验Ⅲ 组与试验Ⅱ组相比差异不显著(P＞0.05)。各组间的总能消化率差异不显著(P＞0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 葡萄糖氧化酶对仔猪饲粮养分消化率的影响 Table 3 Effects of glucose oxides on diet nutrient digestibility of piglets % 项目 Items 试验Ⅰ组 Test group Ⅰ 试验Ⅱ组 Test group Ⅱ 试验Ⅲ组 Test group Ⅲ 干物质 DM 84.14±1.57b 87.63±2.05a 88.48±1.74a 粗蛋白质 CP 83.52±2.12b 87.53±1.75a 86.82±2.01a 总能 GE 87.39±1.19 89.24±1.24 88.06±1.37

表3 葡萄糖氧化酶对仔猪饲粮养分消化率的影响 Table 3 Effects of glucose oxides on diet nutrient digestibility of piglets

由表4可知，与试验Ⅰ组相比，试验Ⅱ、Ⅲ组胃内食糜pH极显著降低(P＜0.01)；与试验Ⅱ组相比，试验Ⅲ组胃内食糜pH显著降低(P＜0.05)。试验Ⅱ组与试验Ⅲ组的十二指肠食糜的pH没有差异(P＞0.05)，但均显著低于试验Ⅰ组(P＜0.05)。试验Ⅱ组空肠食糜pH显著低于试验Ⅰ组(P＜0.05)，与试验Ⅲ组之间没有显著差异(P＞0.05)。各组之间的回肠、盲肠、结肠食糜的pH差异不显著(P＞0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 葡萄糖氧化酶对仔猪胃肠道食糜pH的影响 Table 4 Effects of glucose oxides on pH of gastrointestinal chyme of piglets 项目 Items 试验Ⅰ组 Test group Ⅰ 试验Ⅱ组 Test group Ⅱ 试验Ⅲ组 Test group Ⅲ 胃 Stomach 4.16±0.14Aa 3.48±0.06Bb 3.16±0.11Bc 十二指肠 Duodenum 5.76±0.11a 5.19±0.07b 5.33±0.10b 空肠 Jejunum 6.44±0.16a 6.02±0.12b 6.16±0.10ab 回肠 Ileum 6.68±0.09 6.47±0.12 6.55±0.08 盲肠 Cecum 5.83±0.06 5.69±0.04 5.78±0.09 结肠 Colon 6.11±0.13 6.05±0.05 5.98±0.07

表4 葡萄糖氧化酶对仔猪胃肠道食糜pH的影响 Table 4 Effects of glucose oxides on pH of gastrointestinal chyme of piglets

由表5可知，试验Ⅱ、Ⅲ组的十二指肠绒毛高度极显著高于试验Ⅰ组(P＜0.01)，试验Ⅲ组显著低于试验Ⅱ组(P＜0.05)；十二指肠的隐窝深度各 组没有显著差异(P＞0.05)；试验Ⅱ、Ⅲ组的VH/ CD显著高于试验Ⅰ组(P＜0.05)，但试验Ⅱ组与试验Ⅲ组的VH/CD没有显著差异(P＞0.05)。回肠和空肠的隐窝深度、绒毛高度以及VH/CD各组间未见有显著差异(P＞0.05)。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 葡萄糖氧化酶对仔猪小肠形态结构的影响 Table 5 Effects of glucose oxides on intestinal morphology of piglets 项目 Items 试验Ⅰ组 Test group Ⅰ 试验Ⅱ组 Test group Ⅱ 试验Ⅲ组 Test group Ⅲ 十二指肠 Duodenum 绒毛高度 VH/μm 380.13±35.47Bc 482.38±28.32Aa 468.53±37.32Ab 隐窝深度 CD/μm 325.17±49.59 343.83±56.01 332.53±28.66 绒毛高度/隐窝深度 VH/CD 1.17±0.04b 1.40±0.03a 1.41±0.03a 空肠 Jejunum 绒毛高度 VH/μm 292.32±43.01 317.43±21.42 311.27±37.10 隐窝深度 CD/μm 229.03±31.92 236.58±19.62 235.81±38.81 绒毛高度/隐窝深度 VH/CD 1.29±0.02 1.34±0.01 1.32±0.03 回肠 Ileum 绒毛高度 VH/μm 286.37±53.04 289.56±41.13 298.68±33.71 隐窝深度 CD/μm 209.03±19.92 216.57±22.43 205.98±28.70 绒毛高度/隐窝深度 VH/CD 1.37±0.10 1.34±0.04 1.45±0.05

表5 葡萄糖氧化酶对仔猪小肠形态结构的影响 Table 5 Effects of glucose oxides on intestinal morphology of piglets

由表6可知，与试验Ⅰ组相比，试验Ⅱ、Ⅲ组胃大肠杆菌数量分别降低了9.27%和8.24%(P＜0.05)，回肠大肠杆菌数量分别降低了12.98%和11.68%(P＜0.05)，各组盲肠的大肠杆菌的数量差异不显著(P＞0.05)；与试验Ⅰ组比较，试验Ⅱ、Ⅲ组仔猪胃和回肠内乳酸菌的数量显著增加(P＜0.05)，试验Ⅲ组回肠内乳酸菌的数量显著高于试验Ⅱ组(P＜0.05)；各组之间盲肠的乳酸菌数量差异不显著(P＞0.05)。

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 葡萄糖氧化酶对仔猪胃肠道微生物菌群数量的影响 Table 6 Effects of glucose oxidase on gastrointestinal microflora of piglets lg(CFU/g) 项目 Items 试验Ⅰ组 Test group Ⅰ 试验Ⅱ组 Test group Ⅱ 试验Ⅲ组 Test group Ⅲ 大肠杆菌数量 Number of E.Coli 胃 Stmoach 10.7±0.2a 9.7±0.2b 9.8±0.1b 回肠 Ileum 7.7±0.2a 6.7±0.2b 6.8±0.2b 盲肠 Cecum 6.5±0.2 6.3±0.2 6.1±0.1 乳酸菌数量 Number of Lactobacillus 胃 Stmoach 6.2±0.2b 7.3±0.2a 7.8±0.2a 回肠 Ileum 7.4±0.2c 8.6±0.2b 9.4±0.2a 盲肠 Cecum 7.8±0.2 8.4±0.2 8.3±0.2

表6 葡萄糖氧化酶对仔猪胃肠道微生物菌群数量的影响 Table 6 Effects of glucose oxidase on gastrointestinal microflora of piglets

断奶阶段是仔猪生长中一个十分重要和关键的阶段，不良的环境条件、营养水平和心理因素都会降低仔猪的免疫力，导致仔猪腹泻，减慢生长速度。在饲粮中添加葡萄糖氧化酶，可改善仔猪的平均日采食量，降低仔猪腹泻率，提高仔猪的生长性能。宋海彬等^[8]报道，在断奶仔猪基础饲粮添加葡萄糖氧化酶，仔猪的平均日增重提高了25.0％，料重比下降了17.2％，腹泻率降低了56.0％，这表明葡萄糖氧化酶在促进仔猪生长、提高饲料转化率、减少仔猪腹泻率方面具有显著的效果。杨久仙等^[3]研究报道，葡萄糖氧化酶可以改善仔猪平均日增重，提高饲料转化效率。殷骥等^[9]研究发现葡萄糖氧化酶显著提高仔猪的平均日增重7.03％，显著降低料重比2.75%。

本试验饲粮中添加葡萄糖氧化酶能显著提升断奶仔猪的平均日增重，与张宏宇等^[2]的报道结果相同。本试验结果显示，200 g/t葡萄糖氧化酶改善料重比、降低仔猪腹泻率，与0.1%金霉素使用效果差异不显著。诸多研究表明葡萄糖氧化酶对增加仔猪平均日采食量、促进仔猪生长、提高饲料转化率、减少腹泻率等方面具有显著效果。

葡萄糖氧化酶催化胃肠道中的葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，降低胃肠道食糜的pH，发挥酸化剂的作用，激活了胃蛋白酶，加快饲料中粗蛋白质的消化率^[10]。杨久仙等^[3]研究发现，葡萄糖氧化酶降低仔猪血清尿素氮水平，显著提高饲粮干物质及粗蛋白质消化率。本试验结果显示，添加葡萄糖氧化酶的试验组饲粮中的干物质和粗蛋白质的消化率显著高于对照组，但对总能的消化率没有影响，这可能与葡萄糖氧化酶催化葡萄糖，减少了葡萄糖的能量代谢有关，其机理有待进一步研究。

葡萄糖氧化酶催化胃肠道中的葡萄糖生成葡萄糖酸，从而降低胃肠道pH，发挥酸化剂的作用^[8]。杨久仙等^[3]研究发现，葡萄糖氧化酶显著降低胃和十二指肠食糜pH。本研究发现，葡萄糖氧化酶能显著降低胃、十二指肠和空肠食糜的pH，但对回肠、盲肠、结肠食糜的pH影响不显著，这可能证实葡萄糖氧化酶主要是在胃肠道前段发挥作用，与葡萄糖氧化酶的特性相关。

小肠黏膜的上皮绒毛高度和隐窝深度与肠黏膜的吸收能力存在很大的关联，绒毛变短、隐窝变深说明绒毛萎缩，吸收能力下降，绒毛高度与隐窝深度比值越大说明肠上皮表面积越大，消化和吸收能力就会越强^[11]。仔猪断奶应激对肠道的形态和微生物区系产生不利影响，肠绒毛长度缩短，消化吸收能力下降^[12]。在本试验饲粮中添加葡萄糖氧化酶，断奶仔猪空肠、十二指肠肠的绒毛高度和VH/CD显著得到提高，进而改善了养分的消化率，提高仔猪的平均日增重。

断奶应激会改变仔猪肠道微生物区系平衡和肠绒毛形态，对肠道的形态和微生物区系产生不利影响^[12]。葡萄糖氧化酶能氧化β-D-葡萄糖生成过氧化氢和葡萄糖酸，同时消耗大量的氧气，从而发挥抑制有害菌、促进有益菌繁殖的作用，有效改善胃肠道微生态区系^{[13, 14, 15]}。离体培养试验结果显示，葡萄糖酸可以促进胃肠道内食糜产生更多的短链脂肪酸，而短链脂肪酸是肠道微生物的主要能量来源^[16]。汤海鸥等^[17]研究表明，葡萄糖氧化酶的添加降低了仔猪新鲜粪样的大肠杆菌和沙门氏菌数量，其中沙门氏菌的数量还出现了显著性降低，这说明葡萄糖氧化酶能有效的改善仔猪的肠道微生态平衡。本试验饲粮中添加葡萄糖氧化酶，显著降低了胃和回肠大肠杆菌数量，显著提高了仔猪胃和回肠内乳酸菌的数量。但对盲肠段乳酸菌和大肠杆菌数量没有显著影响。葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖时消耗氧气，产生氧化氢和葡萄糖酸，主要是在胃肠道前段发挥作用，降低肠道前段食糜的pH，为乳酸菌的生长繁殖制造适宜的酸性环境，形成微生态乳酸菌的竞争优势，抑制大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌的存活。葡萄糖氧化酶改善肠道菌群平衡，维持肠道良好的形态结构，从而改善仔猪肠道的健康水平，提高养分消化率，促进生长。

饲粮中添加200 g/t的葡萄糖氧化酶，能显著降低仔猪胃和十二指肠的pH，抑制大肠杆菌数量，增加乳酸菌的数量，改善肠道形态结构，降低断奶仔猪腹泻率，提高养分消化效率，促进养分的消化吸收，进而提高仔猪的生长性能。实际生产中，葡萄糖氧化酶可作为抗生素的替代品，进行推广使用。