刺参(Apostichopus japonicas)是北方沿海重要的水产养殖对象。随着刺参养殖业的迅速发展，其天然的优质饵料马尾藻(Sargassum polycystum)和鼠尾藻(Sargasssum thunbergii)不断减少^[1]。因此，寻找刺参饲料合适的植物蛋白质源尤为重要。浒苔(Enteromorpha prolifera)，隶属绿藻门，石莼目，石莼科，浒苔属(Enteromorpha)，是一种多细胞大型经济类海藻^{[2, 3, 4]}。浒苔营养物质比较丰富，在大菱鲆^[5]、梭鱼^[6]、大黄鱼^[7]和黑鲍^[8]等水产动物饲料中已经开展了相关应用研究，研究手段有物理、化学、酶制剂和微生物菌剂等^{[9, 10, 11]}，而利用微生物菌剂发酵更是具备了有效降解有机物，完善营养组成，提高利用率的优势。但关于微生物发酵浒苔对刺参消化生理和非特异性免疫的研究尚未见报道。本试验采用浒苔添加比例与发酵与否双因素试验设计，配制出试验用刺参饲料，研究其对幼刺参生长、消化和非特异性免疫的影响，确定刺参饲料中浒苔的适宜添加比例，以及微生物发酵饲料对刺参健康养殖的效果，为浒苔绿潮的高值化利用、缓解优质刺参饲料匮乏等问题提供参考依据。

酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae，编号为 CICC1251)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，活化培养后经梯度耐盐筛选得到试验用菌株。在液体酵母浸出粉胨葡萄糖培养基 (yeast extract peptone dextrose medium,YPD)^[12]中37 ℃、140 r/min的恒温振荡培养18 h，所得菌悬液即为试验用发酵菌悬液。

本试验在刺参常规饲料配方的基础上，通过添加0、10%、20%、30%和40%的浒苔粉，相应替代马尾藻粉配制而成，分别标记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ(表1)。然后，将上述每种饲料分为均等2份，再利用1.1中酿酒酵母菌发酵菌悬液对其中1份发酵2 d(发酵条件为：温度35 ℃、含水量60%、接种量10%)，烘干，粉碎，试验最终得到10种试验饲料(其中未发酵为1，发酵为2)。将上述饲料分装到标记好的密封袋，于-20 ℃冰柜中保存备用。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 未发酵试验饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of unleavened experimental diets (DM basis) % 项目 Items 饲料 Diets Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ 原料 Ingredients 马尾藻粉 Sargassum polycystum powder 40.00 30.00 20.00 10.00 浒苔粉 Enteromorpha prolifera powder 10.00 20.00 30.00 40.00 石莼粉 Ulva lactuca powder 30.00 30.00 30.00 30.00 30.00 豆粕 Soybean meal 8.00 8.00 8.00 8.00 8.00 扇贝边粉 Scallop side powder 15.00 15.00 15.00 15.00 15.00 贝壳粉 Shell powder 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 维生素预混料 Vitamin premix 1) 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 矿物质预混料 Mineral premix 2) 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 合计 Total 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 营养水平 Nutrient levels 粗蛋白质 CP 19.96 19.50 19.46 19.33 19.20 粗脂肪 EE 1.76 1.72 1.68 1.66 1.63 1)每千克维生素预混料含有Contained the following per kg of vitamin premix:VA 1 200 000 IU,VD 300 000 IU,VE 5 000 mg,VB1 3 000 mg,VB2 2 000 mg,VB6 800 mg,VB12 5 mg,VC 20 000 mg,VK 33 000 mg,生物素biotin 30 mg,肌醇inositol 10 000 mg,叶酸folic acid 300 mg,泛酸钙calcium pantothenate 3 000 mg,烟酸nicotinic acid 3 000 mg。 2)每千克矿物质预混料含有Contained the following per kg of mineral premix:Cu 1 500 mg,Se 25 mg,Fe 5 000 mg,Co 500 mg,I 150 mg,Zn 2 000 mg。

表1 未发酵试验饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of unleavened experimental diets (DM basis)

试验用幼参由青岛市瑞滋海珍品发展有限公司提供，为当年同一批次繁育的苗种，挑选出活力良好、规格一致[平均体重(3.94±0.46) g/头)]的个体，随机分为10组，每组设3个重复，每个重复随机挑选30头刺参，称重之后放入塑料水槽(直径100 cm，高80 cm)中暂养，每个水槽中放置1个布满聚乙烯波纹板的海参专用框。

试验时间为2014年9月29日至2014年11月13日，试验周期为46 d。试验期间的海水盐度为31、溶氧浓度为6.0 mg/L左右、pH在7.5~8.0，连续充气，水温变化如图1。每天08:00换水1/3~1/2，09:30将饲料与海泥按1.0 ∶ 1.4(均为干重)的比例混合、浸泡；16:30左右，将浸泡后的混合料充分搅拌、均匀泼洒(投喂量按刺参总重量的3%计算，并根据刺参摄食情况及养殖用水透明度适时调整)；20:30观察刺参摄食情况，检查充氧设施工作状况。整个试验期间，每2 d吸底1次，每15 d进行1次换框。每天记录水温、饲料投喂量、海泥添加量、刺参摄食状况和死亡数目。

图 1(Figure 1)

Fig. 1

图1 试验期间水温变化趋势 Fig. 1 The change trend of water temperature during the experiment

试验结束之后，计数每组的刺参并称重，从每个水槽中随机取5头刺参，解剖后抽取体腔液用于酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力的测定；保存其肠道用于淀粉酶(amylase,AMS)、纤维素酶(cellulase)和胰蛋白酶(trypsin,TRY)活力的测定；取体壁、内脏团称重。

计算幼刺参的成活率(survival rate,SR)、增重率(weight gain rate,WGR)、特定生长率(specific growth rate,SGR)、饲料效率(feed efficiency,FE)和脏壁比(ratio of viscera to body wall,R)。各指标计算公式如下：

SR(%)=100×终末刺参头数/初始刺参头数；
            WGR(%)=100×(终末平均体重-
            初始平均体重)/初始平均体重；
             SGR(%/d)=100×(ln终末平均体重-
            ln初始平均体重)/养殖天数；
            FE(%)=100×(终末总重-初始总重)/
            投饲总量；
             R(%)=100×内脏团重量/体壁重量。

粗蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法(VELP,UDK-142 Automatic Distillation Unit，意大利)；粗脂肪含量的测定采用索氏抽提法(石油醚为抽提液)(FOSS脂肪测定仪SOXTEC-2050，瑞士)。

样品ACP、AKP、SOD、AMS活力和蛋白质浓度，采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定，酶活力以比活力表示；TRY活力的测定参照Erlanger等^[13]的方法；纤维素酶活力的测定采用3,5-二硝基水杨酸法^[14]。

试验数据采用SPSS 17.0软件分析，以浒苔添加比例和发酵与否为影响因素，采用双因素方差分析(two-way ANOVA)和Duncan氏法多重比较进行统计分析，设定显著水平为P < 0.05。试验结果以平均值±标准差(mean±SE)表示。

由表2可知，在未发酵组中，随着浒苔添加比例的提高，幼刺参的WGR、SGR和FE有升高的趋势，其中1×Ⅴ组(最优组)SGR、FE和WGR比1×Ⅰ组(最劣组)分别提高了48.91%、72.19%和81.51%。在发酵组中，随着浒苔添加比例的提高，幼刺参的WGR、SGR和FE先升高后降低，2×Ⅳ组(最优组)WGR、SGR和FER比2×Ⅱ组(最劣组)分别提高了68.40%、45.77%和69.50%。不同浒苔添加比例下，添加30%与40%的浒苔对WGR、SGR和FER的影响差异不显著(P>0.05)，但二者均显著高于添加10%的浒苔(P < 0.05)。发酵与否对幼刺参各生长性能指标均无显著影响(P>0.05)。就幼刺参的生长性能而言，浒苔添加比例与发酵与否之间没有显著的交互作用(P>0.05)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 浒苔添加比例与微生物发酵对幼刺参生长性能的影响 Table 2 Effects of Enteromorpha prolifera adding ratio and microbial fermentation on growth performance of juvenile sea cucumbers (Apostichopus japonicus Selenka) 项目 Items 成活率SR/% 增重率WGR/% 特定生长率SGR/(%/d) 饲料效率FE/% 脏壁比R/% 发酵与否 Yes or no fermentation 1 99.97±0.22 108.83±10.06 1.60±0.10 67.32±5.65 69.59±2.62 2 98.88±0.42 119.11±8.03 1.72±0.08 69.55±4.86 71.34±1.70 P值 P-value 0.089 0.332 0.272 0.724 0.567 浒苔添加比例 Enteromorpha prolifera adding ratio Ⅰ 98.89±0.70 82.64±11.80 a 1.32±0.14 a 50.46±6.70 a 65.07±4.88 Ⅱ 99.44±0.56 96.70±12.70 ab 1.50±0.13 ab 58.14±7.59 ab 66.81±2.60 Ⅲ 100.00±0.00 115.89±8.62 ab 1.70±0.09 ab 71.11±5.26 ab 72.60±3.84 Ⅳ 99.44±0.56 136.39±11.30 b 1.90±0.11 b 81.33±6.22 b 75.00±2.90 Ⅴ 99.38±0.70 138.06±16.55 b 1.90±0.15 b 81.13±9.96 b 72.83±2.67 P值 P-value 0.601 0.019 0.014 0.038 0.476 发酵与否×浒苔添加比例 Yes or no fermentation× Enteromorpha prolifera adding ratio 1×Ⅰ 100.00±0.00 73.48±12.36 1.21±0.16 48.53±7.74 60.40±7.28 1×Ⅱ 100.00±0.00 85.47±8.45 1.37±0.10 53.57±3.85 62.82±1.87 1×Ⅲ 100.00±0.00 111.52±6.63 1.66±0.07 68.39±5.76 72.73±6.32 1×Ⅳ 100.00±0.00 118.19±14.12 1.72±0.15 73.85±3.21 77.47±2.46 1×Ⅴ 99.88±1.11 155.14±32.55 2.04±0.31 92.24±4.22 74.50±4.91 2×Ⅰ 97.77±1.11 91.80±21.44 1.42±0.24 52.39±4.14 69.73±4.58 2×Ⅱ 98.88±1.11 107.92±12.07 1.62±0.13 62.70±7.91 70.80±5.73 2×Ⅲ 100.00±0.00 120.26±20.80 1.74±0.20 73.83±1.81 72.46±5.43 2×Ⅳ 98.88±1.11 154.59±11.43 2.07±0.10 88.80±7.80 72.53±2.61 2×Ⅴ 98.88±1.11 120.98±4.42 1.76±0.05 70.02±3.53 71.14±2.96 P值 P-value 0.601 0.149 0.205 0.161 0.199 同列数据肩标不同字母表示差异显著(P < 0.05)。下表同。 Values in the same column with different letter superscripts mean significantly different (P < 0.05). The same as below.

表2 浒苔添加比例与微生物发酵对幼刺参生长性能的影响 Table 2 Effects of Enteromorpha prolifera adding ratio and microbial fermentation on growth performance of juvenile sea cucumbers (Apostichopus japonicus Selenka)

由表3可知，随着浒苔添加比例的提高，幼刺参肠道淀粉酶和胰蛋白酶活力没有显著变化(P>0.05)，而纤维素酶活力则呈先升高后下降趋势，在未发酵组以1×Ⅳ组活力最高；在发酵组以2×Ⅴ组活力最高。同一替代比例下，发酵组的纤维素酶活力要高于未发酵组，且在添加比例为10%、20%、40%时差异显著(P < 0.05)。浒苔添加比例与发酵与否之间的交互作用对肠道纤维素酶活力有显著影响(P < 0.05)，对肠道胰蛋白酶和淀粉酶活力均无显著影响(P>0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 浒苔添加比例与微生物发酵对幼刺参肠道消化酶活力的影响 Table 3 Effects of Enteromorpha prolifera adding ratio and microbial fermentation on intestinal digestive enzyme activities of juvenile sea cucumbers (Apostichopus japonicus Selenka) 项目 Items 淀粉酶AMS/(U/mg prot) 纤维素酶Cellulase/(U/g prot) 胰蛋白酶TRY/(U/g prot) 发酵与否 Yes or no fermentation 1 6.12±0.41 620.16±16.61 a 0.46±0.05 2 5.57±0.32 669.83±12.82 b 0.53±0.06 P值 P-value 0.545 <0.001 0.548 浒苔添加比例 Enteromorpha prolifera adding ratio Ⅰ 5.35±0.39 581.39±19.40 a 0.38±0.15 Ⅱ 5.56±0.63 601.60±12.53 a 0.43±0.04 Ⅲ 6.05±0.79 665.00±32.58 a 0.44±0.05 Ⅳ 6.25±0.59 695.90±7.86 b 0.59±0.11 Ⅴ 6.04±0.54 681.11±17.51 b 0.64±0.03 P值 P-value 0.769 <0.001 0.679 发酵与否×浒苔添加比例 Yes or no fermentation× Enteromorpha prolifera adding ratio 1×Ⅰ 5.64±0.62 559.16±26.31 a 0.35±0.01 1×Ⅱ 5.68±0.95 564.58±10.47 a 0.38±0.04 1×Ⅲ 6.34±1.12 645.55±17.28 b 0.41±0.05 1×Ⅳ 6.57±1.20 682.91±12.67 c 0.62±0.19 1×Ⅴ 6.39±0.85 648.61±7.35 b 0.55±0.02 2×Ⅰ 5.06±1.20 603.61±6.75 ab 0.40±0.06 2×Ⅱ 5.43±1.04 638.61±20.03 b 0.47±0.03 2×Ⅲ 5.76±0.79 684.44±6.28 c 0.47±0.04 2×Ⅳ 5.93±0.43 708.89±12.02 c 0.56±0.02 2×Ⅴ 5.69±0.31 713.61±20.58 c 0.73±0.29 P值 P-value 0.764 <0.001 0.081

表3 浒苔添加比例与微生物发酵对幼刺参肠道消化酶活力的影响 Table 3 Effects of Enteromorpha prolifera adding ratio and microbial fermentation on intestinal digestive enzyme activities of juvenile sea cucumbers (Apostichopus japonicus Selenka)

由表4可知，浒苔添加比例与发酵与否对幼刺参体腔液中ACP、AKP和SOD活力均无显著影响(P>0.05)，且浒苔添加比例与发酵与否之间的交互作用对上述3种非特异性免疫酶的活力亦均无显著性影响(P>0.05)，但均随浒苔添加比例的 提高有先升高后降低的趋势，并均在添加比例 为30%时获得最大值。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 浒苔添加比例与微生物发酵对幼刺参体腔液非特异性免疫酶活力的影响 Table 4 Effects of Enteromorpha prolifera adding ratio and microbial fermentation on non-specific immune enzyme activities of coelomic fluid of juvenile sea cucumbers (Apostichopus japonicus Selenka) 项目Items 酸性磷酸酶ACP/(U/dL) 碱性磷酸酶AKP/(金氏单位/dL) 超氧化物歧化酶SOD/(U/mL prot) 发酵与否 Yes or no fermentation 1 2.25±0.19 1.51±0.11 2.44±0.11 2 2.09±0.19 1.40±0.13 2.43±0.13 P值 P-value 0.296 0.549 0.986 浒苔添加比例 Enteromorpha prolifera adding ratio Ⅰ 1.75±0.22 1.18±0.14 2.14±0.09 Ⅱ 1.93±0.35 1.24±0.24 2.25±0.17 Ⅲ 2.13±0.30 1.45±0.17 2.39±0.28 Ⅳ 2.72±0.24 1.82±0.18 2.76±0.14 Ⅴ 2.34±0.24 1.61±0.14 2.64±0.17 P值 P-value 0.087 0.191 0.444 发酵与否×浒苔添加比例 Yes or no fermentation× Enteromorpha prolifera adding ratio 1×Ⅰ 1.79±0.19 1.22±0.15 2.14±0.26 1×Ⅱ 1.99±0.17 1.34±0.16 2.30±0.31 1×Ⅲ 2.20±0.61 1.50±0.40 2.36±0.26 1×Ⅳ 2.75±0.28 1.79±0.24 2.78±0.03 1×Ⅴ 2.53±0.44 1.69±0.13 2.59±0.22 2×Ⅰ 1.71±0.49 1.12±0.35 2.13±0.02 2×Ⅱ 1.86±0.45 1.14±0.27 2.21±0.19 2×Ⅲ 2.06±0.38 1.40±0.24 2.41±0.34 2×Ⅳ 2.68±0.39 1.84±0.26 2.73±0.19 2×Ⅴ 2.15±0.50 1.52±0.36 2.68±0.51 P值 P-value 0.893 0.878 0.498

表4 浒苔添加比例与微生物发酵对幼刺参体腔液非特异性免疫酶活力的影响 Table 4 Effects of Enteromorpha prolifera adding ratio and microbial fermentation on non-specific immune enzyme activities of coelomic fluid of juvenile sea cucumbers (Apostichopus japonicus Selenka)

本试验结果表明，添加浒苔可以有效提高幼刺参的生长性能，随着浒苔添加比例的提高，幼刺参的WGR、SGR和FE呈现出上升的趋势，原因可能是浒苔高蛋白质、低脂肪，氨基酸含量均衡^[15]，且含有多糖、萜类和甾体等生物活性物质，能够调节机体代谢，促进幼刺参生长^[16]。刘天红等^[17]研究得出，添加33%浒苔能够维持刺参正常生长，降低饲料系数，但其试验用刺参生长缓慢；而本试验中浒苔的适宜添加比例在30%~40%之间。其原因可能是前者试验中的饲料为纯藻粉，单纯投喂藻粉会增加刺参的排泄能耗，不利于刺参的生长^[18]；而本试验中所用的刺参饲料除了添加藻粉外，另外添加了豆粕、扇贝边粉等(表1)蛋白质和脂肪含量相对高的营养物质，使得饲料的营养更加全面、丰富。朱建新等^[19]认为浒苔的蛋白质和脂肪含量都偏低，如果搭配蛋白质和脂肪含量更高的饲料成分，投喂刺参的效果更好。朱伟等^[20]研究发现，在单纯鼠尾藻等藻类饲料的基础上添加一定数量的动物性蛋白质以及其他添加剂，能明显提高幼刺参的生长速度。郭娜^[21]在刺参饲料中添加了5%鱼粉的基础上，添加45%浒苔可以达到良好的生长效果，与本试验结果基本相符。

饲料营养成分组成不同、水环境的变化以及刺参生理状态的波动都会对刺参肠道消化酶活力造成一定的影响^[22]。本试验对幼刺参肠道中活力相对较高的淀粉酶、胰蛋白酶和纤维素酶进行了测定，结果表明随着浒苔添加比例的提高，幼刺参肠道纤维素酶活力呈现出先上升再下降的趋势。其原因可能是浒苔添加比例的提高导致了饲料中粗纤维含量的增加，从而刺激了幼刺参纤维素酶的分泌，但当粗纤维含量过高时又阻碍了消化酶的分泌。胡喜峰等^[23]研究证实，纤维物质可以刺激动物胃肠蠕动，促进消化酶分泌，进而提高营养物质吸收率；而纤维素过量会加快食物在消化道中的排空速度，降低营养物质在肠道中被消化吸收的作用时间和几率。

AKP和ACP是2种重要的水解酶，在刺参抵抗疾病、免疫反应和细胞损伤与修复过程中具有重要的生物学意义^{[24, 25, 26]}。SOD是机体清除氧自由基的重要抗氧化物酶，Regoli等^[27]研究发现生物体对环境胁迫的适应能力取决于其抗氧化防御的能力，抗氧化防御能力较低的物种更易受到氧化侵害。本试验结果表明，饲料中添加浒苔对幼刺参体腔液中的AKP、ACP和SOD活力无显著影响，这可能与刺参摄食浒苔后消化吸收生物活性物质的量尚未达到改变动物部分免疫功能的效果有关。

微生物发酵除了可以改变饲料的理化性状，增加适口性及营养价值，提高消化利用率外^[28]，还可以利用底物中的营养物质，分泌出其他有利的生物活性物质。姜燕^[29]认为发酵饲料可将发酵菌及代谢产物带入养殖环境，易于刺参消化吸收；且发酵菌可将饲料作为底物进行利用，对其中的大分子有机物进行降解。本试验结果表明，微生物发酵对幼刺参的WGR、SGR和FE有微弱的促进作用，当浒苔添加比例为40%时，WGR、SGR和FE反而降低，其原因可能是浒苔添加比例过大时，发酵后饲料中释放出的葡萄糖、小肽、氨基酸等小分子物质含量可能超过了幼刺参正常摄食消化吸收的阈值，从而导致其生长下降。此外，刺参摄入海水使得肠道内的微生物量较大，微生物在生长过程中产生的代谢酶可对刺参摄入体内的食物进行降解^[29]，这也可能是微生物发酵作用效果不明显的原因。

刺参通过调节消化道的功能和消化酶活力来适应不同来源的食物^{[30, 31]}。饲料中的浒苔纤维素含量高，细胞壁致密且厚^{[16, 32]}，不利于幼刺参的消化和吸收。在微生物发酵过程中能够产生并积累维生素、氨基酸、水解酶和促生长因子等，使饲料中大分子营养物质发生一定程度的降解，更易于消化吸收^{[33, 34]}。本试验结果表明，微生物发酵对幼刺参肠道中的纤维素酶活力有明显的促进作用，其原因可能是本试验所用的酿酒酵母菌可以利用饲料中的糖类，将多糖降解为小分子还原性糖，并分泌出可促进高分子营养物质降解的纤维素酶等，进一步改善发酵效果^[35]。

发酵饲料中的益生菌容易在养殖水体中扩散，不仅可以改善水环境^[36]和底质，而且被养殖动物摄食后可维持肠道菌群平衡。Gill等^[37]研究证实，发酵微生物生长代谢中产生的一些代谢产物可一定程度上抑制或杀死病原菌，预防或降低疾病的发生，增强动物的免疫力，防止疾病的发生。本试验结果显示，微生物发酵对刺参体腔液中的AKP、ACP和SOD活力均无显著影响，其原因可能是以上3种酶是在试验末期测定，幼刺参已对生活环境与所摄食饲料产生了良好的适应性。

幼刺参饲料中浒苔的适宜添加比例在30%~40%之间，添加浒苔饲料的发酵与否与幼刺参的生长性能无显著相关性，但可提高肠道中纤维素酶的活力。