目前,我国评定反刍动物饲料营养价值采用静态性分析方法、概略养分分析法及Van Soest饲草洗涤剂分析法,对真实反映饲料消化利用情况有很大局限性。单独应用尼龙袋法、体内产气法、体外产气法能更真实还原瘤胃内环境,虽然属于动态模型,但其只能反映瘤胃内的消化利用情况,对经过瘤胃进入消化道后段的食糜降解利用情况没有涉及。康奈尔净碳水化合物和蛋白质体系(Cornell net carbohydrate and protein system,CNCPS)把饲料的化学分析与植物的细胞水平及反刍动物的消化利用结合起来,使分析结果更有参考价值。同时,CNCPS可通过化学组分含量来预测反刍动物在特定饲粮条件下的采食量、小肠中氨基酸供应量、代谢能摄入量等,最终可诊断饲粮配方的合理性,并指导配方优化,是目前较先进的反刍动物营养评价体系。但由于CNCPS的测定指标较多、操作分析较复杂,故探究用体外产气法结合CNCPS评定牧草营养价值的相关性,进而达到预测CNCPS的组分含量具有重要意义。
“川草2号”老芒麦(Elymus sibiricus Lnn. cv. Chuancao No.2)是四川省草原科学研究院1980年以青藏高原本地野生老芒麦为育种原始材料,采用系统选择方法选育而成的禾本科披碱草属优良新品种。该品种对高原亚高山寒温草甸有较强的适应性,具有耐寒、耐湿、耐旱,对土壤要求不严,在一般盐渍化土壤上也能生长,适口性好,经济价值高等优点[1],并含有抗病、抗逆性基因[2],是青藏高原牧区进行草地生态保护、退化、沙化草地治理的首选牧草品种[3]。已有关于体外产气法、CNCPS对粗饲料进行营养价值评定的研究[4, 5, 6, 7, 8],研究结果显示,体外产气法能为饲料营养价值评价提供重要的信息,在饲料营养价值评价和发酵动力学研究方面的应用,体现出了其在反刍动物营养研究中许多新领域的潜在应用价值。在大量研究反刍动物瘤胃发酵规律和饲料分析方法的基础上,CNCPS把饲料成分的化学分析与反刍动物瘤胃的消化利用结合起来,因而化学分析测定的指标反映了动物对饲料利用的情况,对饲料营养价值的评定更为精确,更好地反映了饲料的特性,CNCPS今后可作为评定反刍动物饲料营养价值的方法。
国内外已有关于其他草种,如播娘蒿、不同燕麦等的研究报道,但还没有“川草2号”老芒麦营养价值的系统评价结果。另外,目前将产气法与CNCPS法结合起来研究饲草营养价值的课题尚不完善。
因此,本试验旨在将体外产气法和CNCPS结合用于评定“川草2号”老芒麦不同生育期的营养价值,并探究两者相关性,确定利用体外产气量和CNCPS组分含量建立回归模型来估测牧草CNCPS组分的可行性。
1 材料与方法 1.1 体外产气试验 1.1.1 样品的采集和处理2014年3月至2014年9月在四川省草原科学研究院红原人工牧草基地分别采集抽穗期、开花期、灌浆期、乳熟期4个生育期的“川草2号”老芒麦,每个生育期草样分别随机选取4个代表性样方,每个样方1 m2。采样时尽可能避免枝叶脱落,保证草株完整性。采回的初级样品切段为2~3 cm后在65℃下风干,粉碎过1 mm筛,放入密闭容器备用。
1.1.2 瘤胃液采集与处理2014年11月选取自由采食“川草2号”老芒麦的3头体重相近[(353.00±5.12) kg]的成年牦牛,于青白江牦牛屠宰场屠宰后取瘤胃内容物样品,混合后用4层纱布过滤,封装后迅速带回实验室备用。
1.1.3 培养液的配制参照Menke等[9]和崔占鸿[10]的方法准备培养液。微量元素溶液(A液):CaCl2·2H2O 13.2 g,MnCl2·4H2O 10.0 g,CoCl2·6H2O 1.0 g,FeCl3·6H2O 8.0 g,加蒸馏水至100 mL;缓冲溶液(B液):NH4HCO3 4.0 g,NaHCO3 35.0 g,加蒸馏水至1 000 mL;常量元素溶液(C液):Na2HPO4 5.7 g,KH2PO4 6.2 g,MgSO4·7H2O 0.6 g,加蒸馏水至1 000 mL;还原剂溶液(D液):1N-NaOH 4.0 mL,Na2S·9H2O 0.625 g,加蒸馏水至100 mL。取400 mL蒸馏水,加入0.1 mL A液、200 mL B液、200 mL C液和40 mL D液,配制成培养液。将预先用39.50℃恒温水浴锅保温的瘤胃液与培养液按1 ∶ 5(V/V)配成混合培养液。
1.1.4 体外产气试验方法将配制好的混合培养液中加入1 mL刃天青溶液,将其置于39.00~39.50℃的恒温培养箱中,持续通入CO2使溶液由蓝色变成无色,现配现用。准确量取30 mL混合培养液注入100 mL玻璃针管内,然后称取牧草样品(400±1) mg放入针管中,每个样品3个重复,同时设定空白管。放入39.00~39.50℃的恒温培养箱中培养,分别记录3、6、9、12、18、24、30、36、48、72 h各时间点的产气量。
1.1.5 测定指标及计算方法 1.1.5.1 产气量的计算产气量(mL)=该时间段内培养管产气量(mL)-
空白管产气量(mL)。
1.1.5.2 产气动力学参数不同成分发酵的速率也反映瘤胃微生物对饲料的利用程度,通过记录在不同时间点的产气量形成数学曲线,饲料的动态发酵可以由发酵产气和挥发性脂肪酸(volatile fatty acid,VFA)决定。通过分析动态数据来评价不同的饲料组成的发酵程度,预测饲料消化速率。参照Ørskov等[11]提出的数学模型将各样品在特定时间点的产气量带入公式计算发酵参数。
P=a+b(1-ect)。
式中:P为培养t时间点的产气量(mL);e为自然对数;t为发酵时间(h);a为快速发酵部分的产气量(mL);b为慢速发酵部分的产气量(mL);c为b的产气速率常数(%/h);a+b为潜在产气量(mL)。
1.2 CNCPS组分测定试验 1.2.1 常规营养水平和CNCPS组分测定方法干物质(dry matter,DM)、粗蛋白质(crude protein,CP)、粗脂肪(ether extract,EE)和粗灰分(ash)含量的测定利用凯氏定氮仪、脂肪仪、纤维仪、马弗炉等设备,采用张丽英[12]的方法进行测定。酸性洗涤木质素(acid detergent lignin,ADL)、中性洗涤纤维(neutral detergent fiber,NDF)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber,ADF)、中性洗涤不溶性粗蛋白质(neutral detergent insoluble crude protein,NDIP)和酸性洗涤不溶性粗蛋白质(acid detergent insoluble crude protein,ADIP)含量按照Van Soest等[13]的方法测定;可溶性蛋白质(soluble protein,SOLP)含量按照Krishnamoorth等[14]的方法测定;非蛋白氮(NPN)、淀粉(starch)含量的测定利用分光光度仪按照AACC(1976)[15]方法进行。
1.2.2 CNCPS组分的计算方法CNCPS组分的计算按照Sniffen等[16]提出的方法计算,公式如下:
CHO(% DM)=1-CP(% DM)-
EE(% DM)-ash(% DM);
CA(% CHO)=[1-starch(% NSC)]×
[1-CB2(% CHO)-C(% CHO)];
CB1(% CHO)=starch(% NSC)×
[1-CB2(% CHO)-CC(% CHO)];
CNSC(% CHO)=1-CB2(% CHO)-
CC(% CHO);
CB2(% CHO)=100×[NDF(% DM)-
NDFIP(% CP)×0.01×CP(% DM)-
NDF(% DM)×0.01×lignin(% NDF)×
2.4]/CHO(% DM);
CC(% CHO)=100×[NDF(% DM)×
0.01×lignin(% NDF)×2.4]/CHO(% DM);
PA(% CP)=NPN(% SOLP)×0.01×
SOLP(% CP);
PB1(% CP)=SOLP(% CP)-
PA(% CP);
PB2(% CP)=1-PA(% CP)-PB1(% CP)-
PB3(% CP)-PC(% CP);
PB3(% CP)=NDFIP(% CP)-
ADFIP(% CP);
PC(% CP)=ADFIP(% CP)。
式中:CHO为碳水化合物;CA为CHO中糖类的含量,为瘤胃中快速降解碳水化合物(rapidly degraded carbohydrate);CB1为CHO中淀粉和果胶含量,为中速降解碳水化合物(intermediately degraded carbohydrate);CB2为CHO中可利用纤维含量,为缓慢降解碳水化合物(slowly degraded carbohydrate);CC为CHO中不可利用纤维含量,为ADL含量的2.4倍;CNSC为CHO中非结构性碳水化合物;PA为CP中NPN含量;PB1、PB2、PB3分别为CP中快速、中速、慢速降解真蛋白质含量;PC为CP中不可利用蛋白质含量。
1.3 统计分析利用SPSS 18.0软件中一般线性模型(GLM)程序进行方差分析,采用Duncan氏法进行多重比较检验;用非线性回归参数估计程序求出产气动力学参数,用简单相关分析、多元线性回归和一元线性回归程序分别求出相应参数的相关性和回归方程。
2 结果与分析 2.1 不同生育期老芒麦常规营养水平特点由表1可看出,不同生育期老芒麦常规营养组分差异较大。抽穗期和开花期老芒麦的CP、ash、NPN、SOLP、NDFIP、ADFIP含量显著高于灌浆期和乳熟期(P<0.05),而DM、NDF、ADF、ADL含量显著低于灌浆期和乳熟期(P<0.05)。抽穗期和开花期NPN、NDFIP、ADFIP含量显著高于灌浆期和乳熟期(P<0.05),表明尽管抽穗期的CP含量较高,但是CP中NPN、NDFIP、ADFIP含量高,蛋白质品质不优于灌浆期和乳熟期。
2.2 不同生育期老芒麦体外发酵产气特性由表2可看出,3~24 h抽穗期和开花期老芒麦产气量显著大于灌浆期和乳熟期(P<0.05);而灌浆期和乳熟期产气量均从18 h开始大幅上升,到72 h,与抽穗期差异不显著(P>0.05),但仍显著低于开花期(P<0.05)。产气参数方面,快速发酵部分的产气量以开花期最高(4.47 mL),次之依次为抽穗期(2.35 mL)、灌浆期(-1.64 mL)和乳熟期(-5.99 mL);慢速降解部分的产气量以乳熟期 最高(177.78 mL),其次为灌浆期(166.43 mL)。结合各指标可知,瘤胃对老芒麦抽穗期和开花期具有较好的消化降解力。
![]() | 表1 不同生育期老芒麦的常规营养水平(干物质基础) Table 1 Common nutrient levels of Elymus sibiricus Linn at different growing stages (DM basis, n=12) |
![]() | 表2 不同生育期老芒麦不同时间点产气量和产气参数 Table 2 GP and parameters at different time points of Elymus sibiricus Linn at different growing stages (n=12) |
由表3可看出,不同生育期老芒麦的CNCPS组分差异较大。对于CHO组分,灌浆期、乳熟期的CHO含量显著高于抽穗期、开花期(P<0.05);抽穗期CA和CNSC含量显著高于灌浆期和乳熟期(P<0.05),相反,CC、CB1含量则随生育期的延长呈递增趋势,即灌浆期和乳熟期显著高于抽穗期和开花期(P<0.05)。对于蛋白质组分,抽穗期的PC和开花期的PA含量显著高于其他生育期(P<0.05)。
![]() | 表3 不同生育期老芒麦CNCPS组分含量(干物质基础) Table 3 CNCPS component contents of Elymus sibiricus Linn at different growing stages (DM basis) |
由表4可看出,结合老芒麦整个生育期的CNCPS组分与体外产气量相关性,各生育期老芒麦的CA含量分别与6、9、12、18 h产气量呈极显著正相关(P<0.01);CB1含量则与30 h产气量呈显著正相关(P<0.05);CNSC含量与6、9、12、18 h 产气量呈极显著正相关(P<0.01);CB2及CC含量随时间的延长,与产气量呈负相关;PA含量与3 h产气量呈显著正相关(P<0.05),与6、9、12、18、24 h产气量呈极显著的正相关(P<0.01);PB2及PB3含量在24 h及之前的各时间点,与产气量呈显著或极显著正相关(P<0.05或P<0.01)。
![]() | 表4 体外产气量与CNCPS组分含量的相关系数(干物质基础) Table 4 The correlation coefficient between in vitro GP and CNCPS component contents(DM basis) |
如表5所示,对老芒麦不同时间点产气量与CNCPS组分进行回归分析,在达到显著水平基础上剔除变量后得到了相应的最优回归方程。除PB1以外,其他组分与相应时间点的累计产气量呈较强的回归关系。
![]() | 表5 体外产气量(X,mL)与CNCPS组分含量(Y,%)的回归方程和相关系数(干物质基础) Table 5 The regression equations and correlation coefficient between in vitro gas production (X,mL) and CNCPS component contents (Y,%) (DM basis) |
本试验结果表明,“川草2号”老芒麦在不同生育期营养价值差异较大。牧草越幼嫩,CP等主要养分含量高,木质化程度低,可溶性CHO含量高,适口性越好。随着牧草成熟,粗纤维含量增加,适口性降低。试验结果与前人对不同生育期播娘篙、小麦和燕麦营养价值评定的结果[17, 18, 19]相一致。
随老芒麦由抽穗期到乳熟期,CP含量逐渐降低,NDF、ADF和ADL含量逐渐升高,其中DM含量随生育期的延长而递增,灌浆期和乳熟期无显著差异,但这2期均显著高于抽穗期和开花期。表明开花期老芒麦水分含量较低,饲用价值高于抽穗期。此外,NDF和ADF含量分别为52.38%、27.59%,与一般牧草开花期含量相近或略低,老芒麦的CP含量与多花黑麦草[20]的CP含量(10.20%)相近或略高。相反,试验发现NDFIP和ADFIP含量随生育期延长而降低,即生育早期CP中难以利用的蛋白质含量高于生育晚期,且CHO中淀粉含量有递增的趋势。表明用静态指标(如CP的绝对含量)评价粗饲料营养价值出现局限性,不能反映CP在瘤胃中快速降解和慢速降解的比重,也不能反映不可利用部分所占比重,需要根据反刍动物消化生理特点进行动态综合评价。
3.2 不同生育期老芒麦体外产气特性体外产气法基于饲料样品在混合培养液消化所产生气体的比例来评估有机物消化率,能够较好地模拟瘤胃中的发酵历程。试验中,开花期快速发酵部分的产气量显著大于抽穗期,表明开花期老芒麦CHO组分中快速发酵部分较多,品质较好。这与本试验中产气规律及开花期CNCPS组分中CA含量数值上高于抽穗期的结果相吻合。同时,灌浆期老芒麦的CHO组分品质要高于乳熟期。抽穗期和开花期老芒麦72 h体外产气量、快速发酵部分的产气量均高于灌浆期和乳熟期,即从开花期开始,随着生育期的延长,老芒麦在瘤胃内快速发酵部分含量逐渐降低,且随着NDF和ADF含量的增加,产气量有降低的趋势。这与刘春英等[21]和汤少勋等[22]研究的体外产气量中NDF、ADF含量呈显著负相关的结果一致。因此,体外产气试验表明,开花期老芒麦营养价值高于抽穗期,灌浆期次之,最后为乳熟期。另外,产气量随时间延长的变化趋势张桂杰等[23]的研究相一致。
3.3 不同生育期老芒麦CNCPS组分特点及与体外产气量的相关回归关系CNCPS在牧草上的应用已有较多研究[24, 25, 26],表明CNCPS分析方法能够全面地反映饲料的营养价值和反刍动物对饲料利用的情况,对饲料营养价值的评定更接近真实值。本试验结果表明,不同生育期老芒麦CNCPS组分含量差异较大,在CHO组分中,CHO含量随生育期的延长逐渐增加,并且灌浆期、乳熟期的含量显著高于抽穗期、开花期,同时CC含量也以灌浆期、乳熟期较高,而CA和CNSC含量变化趋势相反;在蛋白质组分中,PA、PC组分含量也与CHO含量变化趋势相反。这可能是由于随着生育期的延长,牧草叶片逐渐老化,茎叶比升高,细胞壁水平含量升高,细胞内容物逐渐减少,草株木质素和结构性支持物增加,CP含量迅速下降,木质化程度升高,部分蛋白质可能与CC结合。因此,从CNCPS分析结果来看,4个生育期老芒麦对于反刍动物的营养价值与本试验中产气法得出的结果一致。
对于老芒麦CNCPS组分与体外产气量的相关回归关系,结果表明,老芒麦PA、PB1、PB2、CA、CB1、CB2含量与相应时间点体外产气量有显著的相关性,这与隋美霞[26]研究结果相一致。通过建立和验证这几种组分与产气量的回归模型,认为运用不同时间点的产气量与各饲料养分的回归模型来估测粗饲料的CNCPS组分含量具有可行性。本研究结果表明,不同生育期老芒麦CNSC、CA、CB1、CB2、CC、PA、PB3组分含量分别与不同时间点产气量呈显著或极显著的相关性,并建立和优化出了这几个组分与9、18、30、48、72 h体外产气量的回归模型。
4 结 论① 不同生育期老芒麦营养水平差异较大,综合多方面因素,开花期营养价值最高,其余依次为抽穗期、灌浆期和乳熟期,这与体外产气法和CNCPS的评价结果一致。
② 在老芒麦CNCPS组分中,CNSC、CA、CB1、CB2、PA、PB3含量与体外产气量呈显著或极显著的相关性,PA、PB1、PB2含量与体外产气量有显著的相关性。
③ 利用体外产气量和CNCPS组分含量建立回归模型来估测牧草CNCPS组分具有可行性和实际应用价值。
[1] | 陈默君,贾慎修.中国饲用植物[M]. 北京:中国农业出版社,2002. (![]() |
[2] | 李造哲,马青枝,云锦风,等.披碱草和野大麦及其杂种F1与BC1过氧化物酶同工酶分析[J]. 草业学报,2001,10(3):38-41. (![]() |
[3] | 王元富,杨智永,盘朝邦.川草2号老芒麦选育报告[J]. 四川草原,1995(1):19-24. (![]() |
[4] | 赵广永.用净碳水化合物-蛋白质体系评定反刍动物饲料营养价值[J]. 中国农业大学学报,1994,4(S):71-76. (![]() |
[5] | 洪金锁,刘书杰,柴沙驼,等.体外产气法与尼龙袋法评定青海当地燕麦青干草营养价值[J]. 中国畜牧兽医,2009,36(3):36-38. (![]() |
[6] | HUHTANEN P,SEPPÄLÄ A,OTS M,et al.In vitro gas production profiles to estimate extent and effective first-order rate of neutral detergent fiber digestion in the rumen[J]. Journal of Animal Science,2008,86(3):651-659. (![]() |
[7] | 曲永利,吴健豪,李铁.应用康奈尔净碳水化合物-蛋白质体系评定东北农区奶牛饲料营养价值[J]. 动物营养学报,2010,22(1):201-206. (![]() |
[8] | 陶春卫,张爱忠,姜宁,等.用CNCPS评定反刍动物几种常用粗饲料营养价值的研究[J]. 草食家畜,2009(3):50-54. (![]() |
[9] | MENKE K H,STEINGASS H.Estimation of the energetic feed value obtained from chemical analysis and in vitro gas production using rumen fluid[J]. Animal Research Development,1988,28(1):7-55. (![]() |
[10] | 崔占鸿.用体外产气法评价双低菜籽饼与藏嵩草的组合效应[J]. 家畜生态学报,2012,33(2):68-72. (![]() |
[11] | ØRSKOV E R,MCDONALD I.The estimation of protein degradability in the rumen from incubation measurements weighted according to rate of passage[J]. The Journal of Agricultural Science,1979,92(2):499-503. (![]() |
[12] | 张丽英.饲料分析及饲料质量检测技术[M]. 2版.北京:中国农业大学出版社,2003.(![]() |
[13] | VAN SOEST P J,SNIFFEN C J,MERTENS D R,et al.A net protein system for cattle:the rumen submodel for nitrogen[C]//OWENS F N.Protein requirements for cattle:proceedings of an international symposium. Stillwater:Oklahoma State University,1981:265.(![]() |
[14] | KRISHNAMOORTHY U,SNIFFEN C J,STERN M D,et al.Evaluation of a mathematical model of rumen digestion and an in vitro simulation of rumen proteolysis to estimate the rumen-undegraded nitrogen content of feedstuffs[J]. British Journal of Nutrition,1983,50(3):555-568. (![]() |
[15] | AACC.Approved methods of the AACC[M]. Saint Paul:American Association of Cereal Chemistry,1976.(![]() |
[16] | SNIFFEN C J,O'CONNOR J D,VAN SOEST P J,et al.A net carbohydrate and protein system for evaluating cattle diets:Ⅱ.carbohydrate and protein availability[J]. Journal of Animal Science,1992,70(11):3562-3577. (![]() |
[17] | 李孟良,高志炜.播娘蒿不同生育期鲜草产量与营养价值[J]. 草业学报,2004,13(5):66-69. (![]() |
[18] | 马召朋,栗孟飞,杨德龙,等.不同水分条件下冬小麦灌浆期茎叶可溶性碳水化合物积累转运与籽粒灌浆的关系[J]. 草业学报,2014,23(4):68-78. (![]() |
[19] | 杨云贵,程天亮,杨雪娇,等.3个燕麦品种不同收获期对青贮饲草营养价值的影响[J]. 草地学报,2013,21(4):683-688. (![]() |
[20] | 宋中齐,干友民,田刚,等.多花黑麦草在生长肉兔上的营养价值评定[J]. 草业学报,2014,23(5):352-358. (![]() |
[21] | 刘春英,孙学映,朱体超,等.不同黑麦草品种生产性能比较与优势品种筛选[J]. 草业学报,2014,23(4):39-48. (![]() |
[22] | 汤少勋,姜海林,周传社,等.不同牧草品种对体外发酵产气特性的影响[J]. 草业学报,2005,14(3):72-77. (![]() |
[23] | 张桂杰,王红梅,罗海玲,等.应用体外产气与活体外消化法评定不同生育期禾本科牧草营养价值[J]. 营养饲料,2012,48(23):60-63,70. (![]() |
[24] | 张吉鹍,李龙瑞,邹庆华.江西几种奶牛常用饲料的多体系营养价值评定[J]. 江西农业大学学报,2012,34(5):1003-1007. (![]() |
[25] | AQUINO D L,TEDESCHI L O,LANZAS C,et al.E-valuation of CNCPS predictions of milk production of dairy cows fed alfalfa silage[C]//Proceedings of the Cornell Nutritional Conference.[S.l]:[s.n.]2003: 137-150. (![]() |
[26] | 隋美霞.产气法和CNCPS法对粗饲料营养评价的比较研究[D]. 硕士学位论文.哈尔滨:东北农业大学,2009. (![]() |