我国疆土辽阔，是种植农业大国，具有非常丰富的红薯资源。据报道，我国的红薯种植面积和产量位居世界第1位，种植面积占世界总种植面积的70%，年产量占世界总产量的80%^{[1, 2]}，是我国仅次于水稻、小麦和玉米的主要粮食作物之一^[3]。红薯渣一般来源于红薯食品加工厂，是红薯挤压提取淀粉后的弃渣，每年加工淀粉、粉丝及小食品后产生的红薯渣约为24万t^[4]，一个年产红薯淀粉量为3 000 t的企业可产湿渣约4 000 t，如此庞大的产量却只有少部分被用作饲料原料，其余的都被当做废料丢弃而腐败酸化，造成资源的巨大浪费和严重的环境污染^[5]。

对红薯渣进行开发利用，不仅可以为红薯加工企业解决副产品利用率低、资源浪费严重、环境污染较大的问题，还能提高红薯的利用率，丰富其加工产品，促进薯农的种植积极性和增加收入，进一步提升红薯加工产业在我国的地位^[6]。但红薯渣本身品质不好，主要成分为纤维素、木质素，蛋白质含量低，适口性差，不利于动物消化吸收，不适合直接作为动物饲料使用。目前，对于红薯渣的研究多集中在其膳食纤维的提取和改性研究方面。本试验从微生物发酵技术着手，挑选适合发酵红薯渣的最佳菌株，并筛选最佳混合菌组合和最佳发酵路线，再采取4因素4水平的正交试验进行发酵条件优化，旨在研究出固态发酵红薯渣的最佳工艺条件，最大量的提高红薯渣中粗蛋白质含量，提升营养物质水平，使其能达到蛋白质饲料的标准，研发成为新型蛋白质饲料资源而为将来的广泛推广提供科学依据。

黑曲霉(Aspergillus)：塔宾曲霉2206、炭黑曲霉41254、黑曲霉41126、米根霉40503，购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)；酵母菌(yeast)：酿酒酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母、热带假丝酵母1253，由湖南省微生物研究院提供；枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)：Y30、Y108、Y111、Y128、Y160，由中国科学院亚热带农业生态研究所提供；乳酸杆菌(Lactobacillus)：1株，由湖南省微生物研究院提供。

红薯渣由长沙金薯食品有限公司提供。马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1.0 L煮沸30 min，4层纱布完全滤去马铃薯块，将滤液补足至1.0 L，加葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，pH自然，121℃、15磅高压蒸气灭菌20 min，常温保存。细菌基础(LB)培养基：酵母提取物5.0g，胰蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，定容到1.0 L，加琼脂15.0g，pH自然，121℃、15磅高压蒸气灭菌20 min，常温保存。乳酸细菌(MRS)培养基购买于青岛日水生物技术有限公司。添加氮源为尿素，购买于国药集团化学试剂有限公司。

黑曲霉菌和酵母菌培养选用PDA培养基，枯草芽孢杆菌选用LB培养基，乳酸菌选用MRS培养基。

发酵底物：85%红薯渣，15%豆粕，湿度40%，自然pH。

单一菌株筛选方法：称取20g底物于150 mL三角瓶中，封口膜封口，121℃、15磅高压蒸气灭菌20 min，制备若干份备用。将各待选菌株种子液按3%接种量分别接种于不同的已灭菌发酵底物瓶中，搅拌均匀，30℃发酵3 d，发酵过程中每隔12 h摇瓶，以保证好氧菌的正常生长。产物105℃烘干，测定粗蛋白质、粗纤维含量。筛选出发酵产物中粗蛋白质含量最高，粗纤维含量相对较低的单一菌株。

好氧菌混合发酵：选用筛选出的最佳黑曲霉菌和酵母菌，按黑曲霉菌：酵母菌比例分别为1∶2、1∶1、2∶1，3%接种量接种于不同的已灭菌发酵底物瓶中，搅拌均匀，30℃发酵3 d，发酵过程中每隔12 h摇瓶，以保证好氧菌的正常生长。产物105℃烘干，测定粗蛋白质、粗纤维含量。

厌氧菌混合发酵：选用筛选出的最佳酵母菌、乳酸菌和枯草芽孢杆菌按比例(1∶1∶1)以3%的接种量，接种到20g已灭菌的发酵底物中，搅拌均匀，装入新的小号自封袋赶尽袋内空气封口，保证厌氧环境，30℃发酵3 d，产物105℃烘干，测定粗蛋白质、粗纤维含量。

二次发酵：好氧菌混合发酵产物灭菌后全部取出装入新的自封袋，赶尽袋内空气封口继续进行厌氧菌混合发酵程序，测定产物粗蛋白质、粗纤维含量。

依据选定的最佳菌种组合和发酵路线进行发酵条件优化，选择对红薯渣发酵影响较大的4个因素，进行4因素4水平的正交试验分析，分别为发酵时间(1、2、3、4 d)、发酵温度(28、30、32、34℃)、尿素添加量(0.75%、1.00%、1.25%、1.50%)和菌种接种量(1%、2%、3%、4%)。正交试验设计因素水平组合见表1。

粗蛋白质含量采用凯氏定氮法测定；粗纤维含量采用全自动纤维分析仪(德国格哈特Fibretherm FT12)测定；能量值采用等温式全自动量热仪(长沙开元仪器5E-AC8018)测定；游离氨基酸含量采用全自动氨基酸分析仪(日本日立L-8800)测定。

试验数据采用SPSS 17.0进行单因素方差分析，结合Duncan氏法进行多重比较，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著，结果以平均值±标准差表示。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 正交试验L16(44)因素水平表 Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment in the test L16(44) 因素水平 Factors and levels 发酵时间 Fermentation time/d (A) 发酵温度 Fermentation temperature/℃ (B) 菌种接种量 Bacteria inoculation/%(C) 尿素添加量 Addition of urea/%(D) 1 1 28 1 0.75 2 2 30 2 1.00 3 3 32 3 1.25 4 4 34 4 1.50

表1 正交试验L16(44)因素水平表 Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment in the test L16(44)

由表2可见，4株酵母菌中以产朊假丝酵母发酵产物粗蛋白质含量最高，粗纤维含量较低；4株黑曲霉中以黑曲霉41126发酵产物粗蛋白质含量 最高，粗纤维含量较低；5株枯草芽孢杆菌中以枯草芽孢杆菌Y111发酵产物粗蛋白质含量最高，粗纤维含量较低。因此，产朊假丝酵母、黑曲霉41126和枯草芽孢杆菌Y111为最佳单一菌株，参与进行接下来的混合菌发酵。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 单一菌株发酵红薯渣产物粗蛋白质和粗纤维含量 Table 2 The content of crude protein and crude fiber of single strain fermentation sweet potato residue product % 菌种名称 Name of strains 粗蛋白质 Crude protein 粗纤维 Crude fiber 对照组 Controlgroup 8.41 14.32 热带假丝酵母1253 Tropicalis 1253 12.05 14.35 热带假丝酵母 Candida tropicalis 10.83 14.01 产朊假丝酵母 Candida utilis 12.53 14.02 酿酒酵母 S. cerevisiae 12.43 14.29 塔宾曲霉 Tubingensis 13.42 14.29 炭黑曲霉 Carbonarius 13.05 14.26 黑曲霉41126 Aspergillus 41126 13.67 14.12 米根霉 Oryzae 12.96 14.25 枯草芽孢杆菌Y30 Bacillus subtilis Y30 10.51 13.87 枯草芽孢杆菌Y108 Bacillus subtilis Y108 10.03 13.80 枯草芽孢杆菌Y111 Bacillus subtilis Y111 10.63 13.60 枯草芽孢杆菌Y128 Bacillus subtilis Y128 10.13 13.80 枯草芽孢杆菌Y160 Bacillus subtilis Y160 10.09 13.56

表2 单一菌株发酵红薯渣产物粗蛋白质和粗纤维含量 Table 2 The content of crude protein and crude fiber of single strain fermentation sweet potato residue product

将单一菌株筛选出的3株菌和乳酸菌组合，分别进行好氧菌发酵试验、厌氧菌发酵试验、二次发酵试验。不同混合方式发酵产物粗蛋白质含量和粗纤维含量见表3、表4和表5。

由表3、表4可见，好氧菌发酵结果明显好于厌氧菌发酵，好氧菌发酵粗蛋白质含量较对照组均为极显著升高(P＜0.01)，最高值为H∶C=1∶2组，相比对照组提高了65.61%。

由表5可见，二次发酵结果明显优于好氧发酵，混菌组合为(H∶C=2∶1)+C∶R∶K=1∶1∶1)时，二次发酵产物的粗蛋白质含量最高可提升82.90%(P<0.01)，各组间粗纤维含量差异均不显著(P>0.05)，但都呈下降趋势。故选定最佳发酵路线菌种组合为(H∶C=2∶1)+(C∶R∶K=1∶1∶1)的二次发酵。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 好氧菌混合发酵结果 Table 3 The result of aerobic bacteria mixed fermentation % 项目 Items 对照组 Controlgroup H∶C=1∶2 H∶C=1∶1 H∶C=2∶1 粗蛋白质 Crude protein 8.17±0.09Aa 13.53±1.36Bb 13.31±1.39Bb 13.17±0.61Bb 粗纤维 Crude fiber 14.47±0.26a 14.03±0.68b 14.35±0.25ab 14.25±0.25ab     H：黑曲霉，C：产朊假丝酵母，R：乳酸菌，K：枯草芽孢杆菌。同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)，肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下表同。     H: Aspergillus,C: Candida utilis,R: Lactobacillus,K: Bacillus subtilis. In the same row,values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),and with different capital letter superscripts mean markedly significant difference (P<0.01). The same as below.

表3 好氧菌混合发酵结果 Table 3 The result of aerobic bacteria mixed fermentation

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 厌氧菌混合发酵结果 Table 4 The result of anaerobic bacteria mixed fermentation % 项目 Items 对照组 Controlgroup C∶R∶K=1∶1∶1 粗蛋白质 Crude protein 7.59±0.40 8.88±0.18 粗纤维 Crude fiber 13.44±0.63 13.38±0.12

表4 厌氧菌混合发酵结果 Table 4 The result of anaerobic bacteria mixed fermentation

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 二次发酵结果 Table 5 The result of secondary fermentation % 项目 Items 对照组 Controlgroup (H∶C= 1∶2)+(C∶R∶K= 1∶1∶1) (H∶C= 1∶1)+(C∶R∶K= 1∶1∶1) (H∶C= 2∶1)+(C∶R∶K= 1∶1∶1) 粗蛋白质 Crude protein 8.26±0.12Aa 14.81±1.95Bb 14.05±1.74Bb 15.11±1.30Bb 粗纤维 Crude fiber 14.23±0.07 13.90±0.53 13.98±0.53 14.10±0.27

表5 二次发酵结果 Table 5 The result of secondary fermentation

按照表1的组合进行试验，每组3个重复，试验结果取平均值，结果见表6和表7。由表6正交试验结果直观分析表R值可以看出，尿素添加量对红薯渣发酵产物蛋白质含量的影响最大，发酵温度第2，发酵时间和菌种接种量对粗蛋白质含量 影响较小，即D>B>A>C。从K值可以看出，理论上A3B1C3D2的试验组合可使发酵产物的粗蛋白质含量提高到最佳水平，含量为12.35%。即最佳发酵工艺：发酵时间3 d，发酵温度28℃，菌种接种量3%，尿素添加量1%。

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 正交试验结果 Table 6 The result of orthogonal experiment 水平 Levels 发酵时间 Fermentation time/d (A) 发酵温度 Fermentation temperature/℃ (B) 菌种接种量 Bacteria inoculation/%(C) 尿素添加量 Addition of urea/%(D) 粗蛋白质含量 Crude protein content/% 1 1 1 1 1 9.94 2 3 3 1 3 10.47 3 4 4 1 4 11.41 4 2 2 1 2 11.14 5 2 4 3 1 10.34 6 4 3 2 1 10.05 7 3 2 4 1 10.26 8 1 4 4 3 11.37 9 4 1 4 2 11.09 10 1 3 3 4 10.37 11 2 3 4 4 10.56 12 2 1 2 3 11.15 13 3 1 3 2 12.35 14 3 4 2 2 10.87 15 4 2 3 3 10.60 16 1 2 2 4 10.77 K1 42.45 44.53 42.96 40.59 K2 43.19 42.77 42.84 45.45 K3 43.95 41.45 43.66 43.59 K4 43.15 43.99 43.28 43.11 R 0.38 0.77 0.21 1.21

表6 正交试验结果 Table 6 The result of orthogonal experiment

由表7可知，因素D(尿素添加量)对试验结果的影响差异极显著(P<0.01)，其他3项均不显著(P>0.05)，因素B(发酵温度)对发酵结果的影 响高于因素A(发酵时间)和因素C(菌种接种量)。

表7

Table 7

表7(Table 7)

表7 正交试验方差分析表 Table 7 Analysis of variance on orthogonal experiment 因素 Factors 偏差平方和 Square of deviance 自由度 Degree of freedom 均方 Mean square F 显著性 Significant A 1.436 3 0.479 1.050 0.383 B 1.441 3 0.480 1.054 0.381 C 0.846 3 0.282 0.619 0.608 D 8.027 3 2.676 5.870 0.002 误差 Error 15.953 35 0.456

表7 正交试验方差分析表 Table 7 Analysis of variance on orthogonal experiment

选择最佳发酵条件下的红薯渣发酵产物进行常规成分的分析，结果见表8和表9。对照组为添加1%尿素的红薯渣原料。

由表8可见，在最佳发酵条件下，红薯渣产物中粗蛋白质含量极显著高于对照组(P<0.01)，粗纤维含量下降不显著(P>0.05)，能量值提高到16.896 MJ/kg，显著高于对照组(P<0.05)，较之提高了8.6%。

由表9可见，红薯渣发酵产物中17种氨基酸的含量均有了不同程度的提高，其中大部分必需氨基酸有较大的提升，如蛋氨酸提高了82.65%，苯丙氨酸提高了20.75%，赖氨酸提高了4.86%等。对照组中不含半胱氨酸，发酵产物中含有0.800%的半胱氨酸。

表8

Table 8

表8(Table 8)

表8 发酵产物粗蛋白质、粗纤维含量和能量 Table 8 Crude protein,crude fiber content and energy of fermentation production 项目 Items 对照组 Controlgroup 发酵组 Fermentationgroup 粗蛋白质 Crude protein/% 6.64±0.43A 12.35±0.19B 粗纤维 Crude fiber/% 9.50±0.73 9.14±0.36 能量 Energy/(MJ/kg) 15.444±0.02a 16.896±0.10b

表8 发酵产物粗蛋白质、粗纤维含量和能量 Table 8 Crude protein,crude fiber content and energy of fermentation production

表9

Table 9

表9(Table 9)

表9 发酵前后氨基酸的含量 Table 9 The contents of amino acids before and after fermentation % 项目 Items 对照组 Controlgroup 发酵组 Fermentationgroup 提升率 Improve rate 天冬氨酸 Asp 7.607 7.666 0.76 苏氨酸 Thr 2.858 2.947 3.02 丝氨酸 Ser 3.107 3.136 0.92 谷氨酸 Glu 10.325 10.771 4.32 甘氨酸 Gly 3.035 3.173 4.55 丙氨酸 Ala 3.282 4.106 25.11 半胱氨酸 Cys 0.000 0.800 100.00 缬氨酸 Val 3.228 3.986 23.48 异亮氨酸 Ile 3.026 3.207 5.98 亮氨酸 Leu 5.583 5.643 1.10 酪氨酸 Tyr 1.679 1.746 4.00 苯丙氨酸 Phe 4.015 4.848 20.75 赖氨酸 Lys 4.094 4.293 4.86 组氨酸 His 1.653 2.262 36.85 精氨酸 Arg 3.781 3.852 1.84 脯氨酸 Pro 3.205 3.376 5.34 蛋氨酸 Met 0.340 0.621 82.65

表9 发酵前后氨基酸的含量 Table 9 The contents of amino acids before and after fermentation

通过单一菌株相同条件下分别发酵红薯渣测定其产物中的粗蛋白质和粗纤维含量的结果得出，黑曲霉菌41126提高红薯渣粗蛋白质含量的效果最好，产朊假丝酵母次之，枯草芽孢杆菌Y111稍低于前2种，随着粗蛋白质含量的增加，粗纤维含量也在小幅上升，但都低于对照组。这可能是因为黑曲霉菌和酵母菌自身菌体蛋白质含量较高，且在发酵中可以转化非蛋白氮和无机氮为产物粗蛋白质，从而使产物蛋白质含量上升，芽孢杆菌用于改善红薯渣中的氨基酸的含量和发酵环境，抑制其他病原菌生长。孙展英^[7]对马铃薯固态发酵工艺研究结果也表明产朊假丝酵母为最适酵母菌，以上结果均与贠建民等^[8]对于马铃薯淀粉渣生料多菌种固态发酵生产蛋白质饲料工艺中的研究结果变化一致。

因每批次的红薯渣粗蛋白质和粗纤维含量有所差异，故每一次的发酵试验都做了一个对照组作为参照。徐晶等^[9]研究微生物固态生料发酵棉籽粕结果表明，混菌发酵效果优于单菌发酵，脱毒率较单菌发酵高7.27%，水溶性蛋白质含量较单菌发酵高0.99%。刘传都^[10]研究显示，以黑曲霉、绿色木霉和酵母菌2∶2∶3的组合发酵木薯渣所得产物粗蛋白质含量最高达14.7%。付敏等^[11]试验结果显示，混菌固态发酵菜籽饼的最佳条件为，同时添加接种比例为黑曲霉：白地霉：枯草芽孢杆菌(1∶1∶3)的菌液16%，可提高小肽含量385.19%，提高游离氨基酸含量300.00%。这与本试验好氧菌混和发酵结果一致，黑曲霉∶产朊假丝酵母=1∶2时，粗蛋白质含量为13.53%，相比对照组提高了39.62%，高于任何一组单菌发酵结果。

厌氧菌混合发酵比例采取1∶1∶1是因为在厌氧条件下，产朊假丝酵母主要进行的反应为无氧代谢，酵母利用糖类发酵产生乙醇和其他副产物，过高的酵母菌含量会使培养环境恶化^[12]，抑制酵母菌的繁殖，而使得培养基中糖类含量升高产生Crabtree阻遏效应，抑制呼吸酶活性而酒精含量增加，进一步影响细菌的发酵作用^[13]。芽孢杆菌含量过高会造成发酵产物产生刺激性气味，不利于拌入饲粮，而乳酸菌虽然为厌氧益生菌，但对于提高产物粗蛋白质含量无明显作用，同时过高的乳酸菌含量会造成培养基pH过低不适合其他菌种生长。厌氧发酵结果表明，在厌氧条件下混菌发酵对于红薯渣营养物质的改善没有明显效果。

朱平军^[14]在其发酵试验中运用了二次发酵法，总发酵时间96 h，总接种量10%，其比例为黑曲霉：枯草芽孢杆菌∶酵母菌∶植物乳杆菌=4∶2∶2∶2，前48 h进行好氧发酵，后48 h进行厌氧仿生发酵，结果表明此工艺条件下粗蛋白质含量由发酵前43.75%提升至发酵后52.03%。李军训^[15]在试验中对植物饼粕进行好氧-厌氧组合发酵方式，结果表明组合发酵方式优于单独好氧或厌氧发酵，大幅度提高了植物蛋白质的分解效率。 本试验结果表明，菌种组合为H∶C=2∶1+C∶R∶K= 1∶1∶1时，粗蛋白质含量较对照组提高了45.33%，比单一好氧发酵对于粗蛋白质的提升水平高出5.71%。以上试验证明二次发酵法在实际发酵中是可行的，本试验与前人不同的是，分别进行了好氧发酵结果检测、厌氧发酵结果检测和二次发酵结果检测，3种发酵路线形成鲜明对比，更能说明二次发酵工艺的效果更好。

已有文献报道，发酵时间、发酵温度、氮源添加量和菌液接种量是影响混菌固态发酵的最主要因素^{[16, 17, 18]}。在微生物发酵过程中，发酵时间是影响菌体蛋白生成的较大因素，酵母菌14 h后达到繁殖最高峰，枯草芽孢杆菌为24 h，乳酸菌为16 h，黑曲霉为72 h^{[19, 20, 21, 22]}。本试验采用的4种微生物有其各自最佳生长期，发酵时间过短，不足以充分发挥混菌的功能，发酵时间过长，则会造成菌体自溶，蛋白质含量下降。发酵温度对其的影响主要体现在：第一，不同的微生物有各自最适繁殖温度，混合发酵时需选择一个最佳的温度适合混合菌的生长；第二，菌体中的蛋白质、核酸等成分极易受温度的影响，温度过低抑制酶活性，细菌繁殖停滞，温度过高损伤菌体蛋白质高级结构，不利于细菌生长。氮是合成蛋白质的重要元素，在发酵培养基中添加合适的氮源是微生物菌体合成的必要条件。单一菌株筛选添加的是有机氮源——豆粕，但Chaffin等^[23]在研究中报道，微生物对无机氮源的吸收比有机氮源迅速得多，添加到培养基中对微生物的生长与有机氮源无显著差异，还能节省成本。因此正交试验中采用尿素作为氮源，结果表明，尿素作为人工合成的有机物易分解，能快速提供氮源，对本试验中微生物的生长确实具有显著的效果。菌液接种量对发酵的影响主要体现在细菌的繁殖速度，接种量太小会延长发酵周期，引起形态异常且易污染杂菌，接种量过大时前期细菌生长繁殖速度快，会造成培养基过快消耗且黏度增加，不利于溶氧，反而加速细胞衰老，影响产物合成^[10]。

从正交试验结果直观表中R值分析，影响试验结果的因素依次为D>B>A>C，尿素添加量对发酵结果的影响最大，发酵温度与发酵时间影响力相当，而菌液接种量对试验结果的影响最小。方差分析结果表明，除尿素添加量对结果影响极显著外，其他因素均无显著差异。因此由正交分析得出本试验最佳发酵工艺为A₃B₁C₃D₂，即发酵时间3 d，发酵温度28℃，菌种接种量3%，尿素添加量1%。付敏等^[11]利用混菌发酵菜籽饼研究表明，菌液接种量对发酵结果的影响不显著，接种比例的影响显著性高于料水比并高于发酵时间。苏小建等^[24]利用酵母菌发酵木薯渣得出，发酵温度对结果的影响最小，发酵时间影响最大。刘晓艳等^[25]固态发酵豆粕研究表明，对多肽得率影响最大的为发酵温度，最小的为接种量。由此表明，不同的发酵原料、不同的发酵菌种组合会得出不同的最佳发酵工艺条件，相同的是，大部分研究结果均显示菌种接种量对发酵结果影响最小。本试验结果与前人不同的是，最显著的影响因素为尿素添加量。造成这种结果的原因主要是：首先发酵环境过小，本试验全都是在150 mL的三角瓶里进行的，发酵底物的不足影响了各菌株的完全生长和对氮源的转化利用率，从而制约菌体蛋白的合成；其次本试验所选用的菌种都是对生长环境要求较粗旷的菌株，生长繁殖均容易进行，从而导致各因素间差异不显著。

最佳发酵条件下生成的产物常规成分分析结果表明，粗蛋白质含量较同等尿素添加量的发酵原料提升了85.99%，粗纤维含量下降了3.8%，能量水平上升了8.6%，氨基酸含量均提升并新合成了半胱氨酸，且绝大部分必需氨基酸有了显著的升高。这一结果与倪玉姣等^[26]和潘洪宝等^[27]对发酵饲料分成分析结果一致。分析认为，本试验中粗纤维含量下降可能是因为，以黑曲霉为主要的混合菌发酵产生的纤维素酶降解了纤维素这一大分子多糖，为发酵提供能源物质。而底物的消耗使得蛋白质在物料中的百分含量增加，同时碳水化合物的分解、蛋白质含量的增加以及底物的浓缩使产物能量值有了明显的上升。衰老凋亡的菌体自身也有丰富的营养物质，产物蛋白质数量和种类的增加，亦可引起水解产生的氨基酸含量上升，因此产物中氨基酸含量均得到了不同程度的提升。

试验结果表明，最佳单一菌株为黑曲霉41126、产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌Y111和乳酸菌，且以混菌比例为(黑曲霉41126∶产朊假丝酵母=2∶1)+(产朊假丝酵母∶乳酸菌∶枯草芽孢杆菌Y111=1∶1∶1)时进行二次发酵效果最好。

正交试验结果表明，最佳发酵工艺条件为：发酵时间3 d，发酵温度28℃，菌液接种量3%，尿素添加量1%。此条件下粗蛋白质含量达12.35%，较同等尿素添加量的原料发酵前提升了85.99%。

最佳发酵条件生成的产物营养成分分析结果表明，产物能量值提高至16.896 MJ/kg，几种必需氨基酸含量显著上升，粗纤维含量略显下降。