南方夏季时间长，极端温度高达40 ℃以上，且潮湿多雨。肉牛皮下脂肪厚，无汗腺，体温调节能力差，在夏季高温高湿条件下极易出现热应激反应，表现为抗氧化性能下降、免疫力和产肉性能低下，肉品质变差^{[1, 2]}。因此，热应激严重影响肉牛养殖的经济效益，研究肉牛热应激防治措施对促进夏季肉牛生产、改善牛肉品质具有重要意义。

肌纤维是肌肉的重要组成部分，骨骼肌纤维的形态结构对肌肉嫩度、多汁性等肉质性状有重要影响。研究表明，高温高湿环境刺激可引起机体出现氧化应激，使骨骼肌线粒体氧自由基(ROS)大量产生，过多的ROS将损伤肌纤维膜的完整性，使肌肉持水力下降，嫩度变差^{[3, 4]}。金银花是一种清热解毒的传统中药材，其主要活性成分有绿原酸、黄酮等。研究表明，金银花提取物能清除体内过量的ROS，提高抗氧化酶的活性，调节机体抗氧化系统平衡^[5]；且其对应激引起的肝细胞、心肌细胞等结构的氧化损伤具有保护作用^[6]。但有关金银花提取物对肉牛热应激的调控作用目前尚未见报道。本试验拟以锦江黄牛为研究对象，研究金银花提取物在饲料中添加后对肉牛的抗氧化功能及骨骼肌纤维损伤的修复作用，旨在探讨金银花提取物对热应激肉牛的调控作用及其机制。

选用10头18月龄、体重(360±20) kg的健康未去势锦江黄牛公牛，由江西高安裕丰农牧有限公司提供。

金银花提取物购自西安某公司，其绿原酸含量为19.01%(图1)。

图1(Figure 1)

Fig. 1

图1 金银花提取物的液相色谱图 Fig. 1 HPLC chromatograms of honeysuckle extract

试验肉牛的营养水平按照《肉牛饲养标准》(NY/T 815—2004)^[7]设计。精料(表1)由玉米、豆粕、菜籽粕、棉籽饼、石粉、磷酸氢钙、预混料等 组成，粗料为皇竹草和啤酒糟。每天每头牛饲喂精料1.5 kg，啤酒糟(干)2 kg，皇竹草切碎后自由采食，自由饮水。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 精料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the concentrate (air-dry basis) % 原料 Ingredients 含量 Content 营养水平 Nutrition levels2) 含量 Content 玉米 Corn 69.00 干物质 DM 87.30 麦麸 Wheat bran 18.00 净能 Net energy/(MJ/kg DM) 7.52 豆粕 Soybean meal 4.00 粗蛋白质 Crude protein 12.20 棉籽饼 Cottonseed cake 3.00 中性洗涤纤维 NDF 16.05 菜籽粕 Rapeseed meal 3.00 中性洗涤纤维 ADF 6.13 石粉 Limestone 1.00 钙 Calcium 0.63 磷酸氢钙 CaHPO4 0.50 磷 Phosphorus 0.43 碳酸氢钠 NaHCO3 0.20 食盐 NaCl 0.30 预混料 Premix1) 1.00 合计 Total 100.00  1)预混料为每千克饲粮提供 Premix provided the following per kilogram of the diet：VA 2 640 IU，VD 302 IU，VE 17 mg，Fe 60 mg，Cu 10 mg，Zn 36 mg，Mn 48 mg，Co 0.12 mg，I 0.30 mg，Se 0.24 mg.  2)净能根据《肉牛饲养标准》(NY/T 815—2004)[7]计算而得，其他为实测值。The net energy was a calculated value according to Feeding Standard of Beef Cattle (NY/T 815—2004)[7],and the other nutrient levels were measured values.

表1 精料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the concentrate (air-dry basis)

时间：2014年7月1日至9月8日，包括预试期10 d，正试期60 d。

地点：江西高安裕丰农牧有限公司。

采用配对试验设计，将试验牛分成对照组和金银花组，每组5头牛。试验牛均饲喂于夏季高温高湿条件下。正试期金银花组在精料中添加0.2%的金银花提取物，试验牛在采食完全部精料和啤酒糟后，自由采食皇竹草、自由饮水。牛舍中安装有2个风扇用于防暑降温。

试验正式开始时，将温湿度表悬挂在试验牛群两边的墙壁上与牛体等高处(距地面约1.5 m)，记录08:00、14:00及20:00的温度和相对湿度。根据Berman^[8]报道的方法计算牛舍环境温湿指数(temperature humidity index,THI)。

式中：td为华氏温度，RH为相对湿度(td=she×9/5+32)。当牛舍THI＜72时表示无热应激；72≤THI≤79时为轻度热应激；79<THI≤88时为高度热应激；THI>88时为重度热应激。

试验结束后，于08:00空腹静脉采集全部试验牛的血液15 mL，3 000 r/min离心10 min分离血清，并用200 μL移液枪将血清分装到0.5 mL高压灭菌EP管中，放到-20 ℃保存备用。用于测定抗氧化指标及乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的活性。然后，将试验牛击晕后屠宰放血，分离背最长肌，取第12~13胸椎处背最长肌，迅速放入液氮中速冻，用于制作组织匀浆液，测定肌肉中抗氧化指标。

血清及肌肉中抗氧化指标采取试剂盒法测定，所有试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。其中总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性测定采用T-SOD试剂盒(WST-1法)，丙二醛(MDA)含量测定采用MDA试剂盒(TRA法)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性采用GSH-Px试剂盒(比色法)测定，总抗氧化能力(T-AOC)活性采用T-AOC检测试剂盒(比色法)测定，超氧阴离子自由基(·O^-₂)活性测定采用抑制或产生超氧阴离子自由基测定试剂盒(比色法)。血清中LDH活性采用LDH试剂盒(微板法)测定，CK活性采用CK试剂盒(比色法)测定。

取出试验牛的第12~13胸椎背最长肌，分别切成6~8小块0.5和1.0 mm³的肉块用10%的甲醛溶液和4%的戊二醛溶液固定，用于石蜡切片和超微结构的制作。

每例标本选5张组织切片，分别在100和400倍的显微镜放大倍率下，选取不重叠、不断裂的清晰视野，共选20个视野。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统直接测量数据，在400倍视野下测量肌纤维直径及肌节长度，在100倍的放大倍率下，以数上不数下，数左不数右为原则，计数拍摄图片内的肌纤维数，然后换算为1 mm²的肌纤维数，作为被测样本的肌纤维密度。

基本数据处理采用Excel 2003，试验结果分析采用SPSS 17.0中的one-way ANOVA程序进行方差分析，多重比较用Duncan氏法。

由图2可知，在肉牛试验期间，牛舍THI以14:00时最高，其平均值达到了84.14，08：00和20：00的THI平均值也均高于79，这表明夏季高温高湿环境条件可诱发动物出现热应激反应，其热应激程度为中度。

图2(Figure 2)

Fig. 2

图2 夏季试验牛饲养环境的温湿指数 Fig. 2 THI of cattle feeding environment in summer

由表2可知，金银花组的试验牛初重、末重、平均日增重与对照组之间无显著差异(P>0.05)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 金银花提取物对高温条件下肉牛增重的影响 Table 2 Effects of Honeysuckle extract on weight gain of beef cattle under hot environment 项目 Items 对照组 Control group 金银花组 Honeysuckle group 初重 Initial weight/kg 388.60±14.67 377.60±14.06 末重 Final weight/kg 427.80±15.32 419.40±10.62 平均日增重 ADG/g 653.33±62.61 696.67±80.10  同行数据肩标不同字母表示差异显著(P＜0.05),无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。  In the same row,values with different letter superscripts mean significant difference (P＜0.05),while without letter superscript mean no significant difference (P>0.05). The same as the below.

表2 金银花提取物对高温条件下肉牛增重的影响 Table 2 Effects of Honeysuckle extract on weight gain of beef cattle under hot environment

由表3可知，与对照组相比，金银花组的血清GSH-Px活性、T-AOC分别上升了17.97%和34.62%(P＜0.05)；T-SOD活性，2组之间无显著差异(P>0.05)；金银花组血清MDA含量比对照组降低了38.20%(P＜0.05)；金银花组血清CK活性比对照组下降51.24%(P＜0.05)；LDH和超氧阴离子自由基活性2组之间均无显著差异(P>0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 金银花提取物对高温条件下肉牛血清抗氧化指标的影响 Table 3 Effects of Honeysuckle extract on serum antioxidant indexes of beef cattle under hot environment 项目 Items 对照组 Control group 金银花组 Honeysuckle group 谷胱甘肽过氧化物酶 GSH-Px/(U/mL) 95.22±5.79b 112.33±3.05a 总抗氧化能力 T-AOC/(U/mL) 5.98±0.33b 8.05±0.13a 丙二醛 MDA/(nmol/mL) 2.93±0.17a 2.12±0.24b 总超氧化物歧化酶 T-SOD/(U/mL) 35.63±2.29 40.52±2.99 乳酸脱氢酶 LDH/(U/L) 954.82±31.40 908.78±24.89 肌酸激酶 CK/(U/L) 693.92±29.62a 338.35±11.91b 超氧阴离子自由基活性 ·O-2/(U/L) 251.34±7.42 234.54±5.72

表3 金银花提取物对高温条件下肉牛血清抗氧化指标的影响 Table 3 Effects of Honeysuckle extract on serum antioxidant indexes of beef cattle under hot environment

由表4可知，与对照组相比，金银花组肌肉中的GSH-Px和T-SOD活性、MDA含量均无显著差异(P>0.05)；但肌肉中T-AOC比对照组提高了59.74%(P＜0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 金银花提取物对高温条件下肉牛骨骼肌抗氧化指标的影响 Table 4 Effects of Honeysuckle extract on skeletal antioxidant indexes of beef cattle under hot environment 项目 Items 对照组 Control group 金银花组 Honeysuckle group 谷胱甘肽过氧化物酶 GSH-Px/(U/mg prot) 20.21±1.46 20.26±1.70 总抗氧化能力 T-AOC/(U/mg prot) 3.08±0.13b 4.92±0.24a 丙二醛 MDA/(nmol/mg prot) 1.41±0.05 1.61±0.09 总超氧化物歧化酶 T-SOD/(U/mg prot) 23.26±0.45 23.78±0.92

表4 金银花提取物对高温条件下肉牛骨骼肌抗氧化指标的影响 Table 4 Effects of Honeysuckle extract on skeletal antioxidant indexes of beef cattle under hot environment

由表5可知，金银花组的肉牛骨骼肌纤维直径与对照组相比无显著变化(P>0.05)，骨骼肌肌节长度比对照组增加了13.16%(P＜0.05)，肌纤维密度与对照组之间无显著差异(P>0.05)。从骨骼 肌纤维超微结构图(图3-C、图3-F)可以看出，对照组试验牛的骨骼肌纤维出现明显肿胀，肌纤维变粗，且边界不清晰；金银花组的骨骼肌纤维结构呈现恢复状态，但肌纤维间隔较宽，部分纤维结构受损。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 金银花提取物对高温条件下肉牛骨骼肌纤维形态的影响 Table 5 Effects of Honeysuckle on skeletal muscle morphology of beef cattle under hot environment 项目 Items 对照组 Control group 金银花组 Honeysuckle group 肌纤维直径 Muscle fiber diameter/μm 49.27±0.61 48.49±0.74 肌节长度 Sarcomere length/μm 2.66±0.03b 3.01±0.02a 肌纤维密度 Density of muscle fiber/(根/mm2) 348.99±32.00 403.91±47.00

表5 金银花提取物对高温条件下肉牛骨骼肌纤维形态的影响 Table 5 Effects of Honeysuckle on skeletal muscle morphology of beef cattle under hot environment

图3(Figure 3)

Fig. 3

A:对照组Control group (100×);B:对照组Control group(400×);C:对照组Control group(12 000×);D:金银花组Honeysuckle group (100×);E:金银花Honeysuckle group(400×);F:金银花组Honeysuckle group (12 000×)｡图3 高温条件下对照组和金银花组肉牛骨骼肌纤维形态 Fig. 3 Morphology of skeletal muscle of control and Honeysuckle groups under hot environment

本试验中，夏季牛舍THI的测定结果表明试验牛处于热应激状态。前期报道表明，热应激肉牛采食量下降，内分泌系统紊乱，血清中超氧化物歧化酶(SOD)、GSH-Px的活性降低，脂质过氧化产物含量升高^[9]。吴秀群等^[10]研究报道，热应激使奶牛血清SOD活性极显著下降，MDA含量显著上升。MDA是脂质过氧化反应链式终止阶段产生的小分子产物，其含量可间接反映机体组织细胞的脂质过氧化程度；而SOD和GSH-Px的活性反映了机体清除ROS的能力。金银花提取物中含有绿原酸、黄酮类化合物，这些活性物质是天然的抗氧化剂，具有清除机体过量的ROS，提高抗氧化酶的活性，调节机体抗氧化系统平衡，增加机体免疫力等作用^[11]。本研究结果显示，添加金银花提取物可使热应激肉牛的血清和肌肉中抗氧化酶GSH-Px活性和T-AOC显著升高，并降低了血清MDA含量。这表明金银花提取物可改善热应激条件下肉牛的抗氧化功能。

LDH和CK主要存在于骨骼肌中，当机体应激时，大量的ROS可影响肌细胞膜上的钙转移系统如钙离子通道、钙泵等，引起细胞内钙离子浓度异常升高，进而激活依赖钙离子的核酸内切酶，使DNA发生断裂，组织结构受损，导致血清酶如LDH和CK从组织中释放进入血液^[12]。本试验结果显示，添加金银花提取物后试验牛血清中LDH活性有下降的趋势， CK活性比对照组显著下降。这表明金银花提取物对热应激引起的肌纤维损伤具有一定的保护作用。只德贤等^[6]研究结果表明，金银花提取物可提高胰岛细胞的抗氧化能力，对外源性一氧化氮(NO)所造成的NIT-1胰岛B细胞损伤有很好的保护作用。这与本研究结果一致。

肌纤维是骨骼肌的重要组成部分，肌纤维的粗细、质地对肌肉嫩度的影响很大。研究表明，骨骼肌肌纤维越细，肉质越嫩；肌纤维越粗，肉质越差^[13]。杨博辉等^[14]分别对九龙牦牛和大通牦牛肌肉纤维直径的研究发现，肌纤维直径与肉品的柔嫩度呈现曲线相关。刘建伟^[15]在对波尔山羊肌肉组织学形状与肉品理化性状的研究中发现，动物骨骼肌肌节长度越大，肌肉越嫩。本试验结果显示，热应激状态下，肉牛骨骼肌纤维出现肿胀、边界不清晰；添加金银花提取物可一定程度上修复热应激肉牛的骨骼肌纤维的损伤，肌节长度增加，肌纤维密度提高。这提示饲粮中添加金银花提取物对热应激肉牛骨骼肌形态结构有一定的缓解和修复作用，并可能因此而改善肉牛的肌肉嫩度等肉品质。

夏季高温高湿环境可诱发肉牛热应激反应，添加0.2%金银花提取物可改善肉牛抗氧化功能，促进热应激肉牛骨骼肌纤维结构损伤的修复。