甜菜碱广泛存在于动植物体内，分子结构比较简单，与蛋氨酸、胆碱的化学结构相似，都属季胺碱类物质，是甲基的高效供体，具有抗氧化，调节渗透压，调控动物体内生长调控因子的水平等作用^[1]。甜菜碱作为饲料添加剂已经广泛使用于猪禽等单胃动物，研究表明，甜菜碱可以缓解断奶仔猪应激，降低腹泻率，提高瘦肉率^[2]，郭建凤等^[3]表明商品瘦肉猪饲粮添加甜菜碱可以显著提高生长速度和饲料报酬；而甜菜碱替代部分蛋氨酸应用于肉鸡生产中，可以降低饲料成本^[4]；在水产动物中，张阳军^[5]研究表明，添加甜菜碱对罗氏沼虾是很好的诱食剂，并在提高生产性能方面有很好的作用。然而，反刍动物具有复杂的瘤胃微生态系统，甜菜碱在反刍动物的应用中表明，可以提高生产性能^[6]，并在一定程度上可以缓解隐性乳房炎^[7]。张丽等^[8]研究表明饲粮中添加甜菜碱可以提高奶牛生产性能，降低奶牛外周血中热应激蛋白70(HSP70)含量，缓解奶牛热应激。连红等^[9]研究发现复合包膜甜菜碱的添加有积累血浆中总氮的趋势，其中白蛋白和总蛋白含量显著升高，而尿素氮含量显著降低。反刍动物对饲料的消化实际就是瘤胃中的微生物对饲料进行发酵，饲料利用率的高低很大程度上取决于瘤胃发酵的程度。本试验将通过添加不同水平的甜菜碱于体外发酵的瘤胃液中，探讨甜菜碱对奶牛瘤胃发酵参数的影响，为甜菜碱在奶牛上的应用提供参考。

发酵底物：江苏省南京市某奶牛场精粗比为50 ∶ 50，干物质(DM)含量为54.60%，粗蛋白质(CP)含量为17.15%，中性洗涤纤维(NDF)含量为34.72%的全混合日粮(TMR)经烘干粉碎过1目筛，其组成及营养水平见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 全混合日粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the TMR (DM basis) % 项目 Items 含量 Content 原料 Ingredients 玉米青贮 Corn silage 17.20 青草 Fresh grass 4.93 啤酒糟 Brewers grain 4.78 苜蓿草 Alfalfa hay 13.20 小麦麸 Wheat bran 9.57 苹果粕 Apple pomace 6.75 甜菜粕 Beet sugar pulp 6.46 干草 Dry grass 4.38 棉籽 Cottonseed 1.76 玉米 Corn 10.70 蒸汽压片玉米 Steam-flaking corn 4.57 豆粕 Soybean meal 4.62 小麦 Wheat 2.18 棉籽粕 Cottonseed meal 3.13 大豆粉 Soybean powder 1.56 玉米干酒糟及其可溶物 Corn DDGS 1.56 磷酸氢钙 CaHPO4 0.68 小苏打 NaHCO3 0.34 食盐 NaCl 0.34 石粉 Limestone 0.34 氧化镁 MgO 0.28 脱霉素 Mould removing agent 0.05 预混料 Premix1) 0.62 合计 Total 100.00 营养水平 Nutrient levels2) 干物质 DM 49.7 粗蛋白质 CP 17.3 中性洗涤纤维 NDF 39.8 酸性洗涤纤维 ADF 24.2 钙 Ca 1.0 磷 P 0.6  1)每千克预混料含有 One kg of premix contained the following：VA 1 500 000 IU，VD3 300 000 IU，VE 1 800 000 IU，烟酸 nicotinic acid 2 500 mg，Cu 1 500 mg，Fe 5 600 mg，Mn 4 500 mg，Zn 9 600 mg，I 150 mg，Se 40 mg，Co 60 mg。  2)计算值 Calculated values[10]。

表1 全混合日粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the TMR (DM basis)

甜菜碱：由江苏宜兴天石饲料有限公司提供，性状为白色均匀圆形颗粒，不溶于水，易溶于有机溶剂，纯度为40%。

本试验采用单因素试验设计，试验分为3组，分别为对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组，均以300 mg TMR作为发酵底物，添加到45 mL人工瘤胃发酵液中，各组分别添加0、1.2、3.6 mg甜菜碱(纯度为40%)。

玻璃培养管：本试验的产气装置为100 mL注射器。

在试验之前，进行注射器的前处理及选择工作。首先将注射器的活塞拔出涂抹凡士林，以增加润滑度，减少摩擦，而后在同样量的底物、瘤胃液和培养液条件下培养一定时间，通过产气量选择出合适的注射器，以此来消除活塞重量不同及其与注射器管壁间的摩擦力的不同造成的误差。产气量的测定是通过发酵产生的气体将活塞顶起的高度，直接从注射器刻度读出。

人工瘤胃培养箱：由恒温水浴振荡器改装成为水浴恒温培养箱，温度、振荡速度可调。

CO₂气罐及气体：采用纯度为99.999%的CO₂气体作为厌氧条件产生和维持的气源。

恒温培养箱：作为预热玻璃培养管的装置,试验前应将玻璃培养管在预热状态下涂抹适量的凡士林，待加样后将培养管在已调试好的39 ℃培养箱中预热。

恒温水浴锅：用于采集瘤胃液时的保温。

恒温及磁力搅拌装置：恒温水温箱用于培养管在分液过程中提供缓冲环境并保证培养液的温度保持39 ℃。磁力搅拌器用于保证培养液的恒温及混合均匀。

医用纱布和漏斗：采用标准的医用纱布用于瘤胃液的过滤，采用瓷制漏斗用于瘤胃液内容物的过滤。

分析天平：用于培养底物的称量。

采用Menke等^[11]的方法准备瘤胃发酵液，人工瘤胃发酵液由常量元素溶液(A液)、微量元素溶液(B液)、缓冲液(C液)、指示剂溶液、还原剂溶液配成。各种溶液的配方见表2。将1 000 mL的分液瓶放入39 ℃水浴中，用磁力搅拌器搅拌，按以下比例和顺序配制：蒸馏水400 mL+B液0.1 mL+A液200 mL+C液200 mL+刃天青溶液1 mL+还原剂溶液40 mL。加入刃天青溶液后混合液变为红色，通入无氧CO₂并预热至39 ℃后约30 min，混合液颜色变淡或无色(在与过滤瘤胃液混合之前加入还原剂并通CO₂气体至溶液褪至完全无色即可用，且用前新鲜配制，再通CO₂至饱和)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 人工瘤胃发酵液单一溶液配方 Table 2 Formula of single solution in artificial rumen fermentation fluid 项目 Items 组成 Composition 常量元素溶液 Macroelement solution (A) Na2HPO4 5.7 g、KH2PO4 6.2 g、MgSO4·7H2O 0.6 g，加超纯水至1000.00 mL 微量元素溶液 Microelement solution (B) CaCl2·2H2O 13.2 g、CoCl2·6H2O 1.0 g、MnCl2·4H2O 10.0 g、FeCl3·6H2O 8.0 g，加超纯水至100.00 mL 缓冲液 Buffer (C) NH4HCO3 4.0 g、NaHCO3 35 g，加超纯水至1000.00 mL 指示剂溶液 Indicator solution 刃天青100 mg，加超纯水至100.00 mL 还原剂溶液 Redactor solution 1 mol/L NaOH溶液 4 mL、Na2S·9H2O 625.0 mg，加超纯水至100.00 mL

表2 人工瘤胃发酵液单一溶液配方 Table 2 Formula of single solution in artificial rumen fermentation fluid

屠宰场选择2头健康奶牛屠杀，打开瘤胃后均匀采样，经4层纱布过滤瘤胃内容物至预热至(39.00±0.25) ℃的容器中，迅速带回实验室，将瘤胃液与人工瘤胃发酵液以1 ∶ 2的体积比混合，制成混合人工瘤胃发酵液。混合人工瘤胃发酵液边加热边用磁力搅拌器搅拌，同时通入CO₂。

准确称取300 mg发酵饲料及相应量的反刍动物专用甜菜碱(对照组不添加，试验Ⅰ组添加1.2 mg，试验Ⅱ组添加3.6 mg)送入100 mL玻璃注射器内，用自制加液器向每个培养管(注射器)中分别加入(45±1) mL人工瘤胃发酵液。在注射器活塞前1/3部位均匀涂抹适量医用凡士林，39 ℃培养。为了保证测试样品具有代表性，每个样本设4个平行。

当培养至3、6、12、18、24 h时，取出培养管，快速读取活塞所处的刻度值(mL)并记录。若某一时间点读数超过80 mL时，为了防止气体超过刻度而无法读数，应在读数后及时排气并记录排气后的刻度值。

待培养管在体外培养6、12、24 h后，将各组其中4个培养管分别取出放入冰水浴中使发酵停止。将培养管中的发酵液排出至已知重量的50 mL塑料离心管，立即用pH计测定发酵液pH。发酵液经离心(1 500 r/min)15 min，取上清液分管冷冻保存以备测定发酵液的菌体蛋白、乳酸、氨氮(NH₃-N)、挥发性脂肪酸(VFA)含量。同时洗涤培养管中的残渣并将其与对应样品离心所得沉淀一起用蒸馏水悬浮，再离心，重复2次后在65 ℃烘干48 h，称重并根据差量法计算样品干物质降解率。

分别在发酵3、6、12、18和24 h测定各培养瓶的产气量;在6、12、24 h测定pH，干物质降解率，NH₃-N、VFA、乳酸和菌体蛋白含量。

产气量=某时间段产气量-对应时间段空白管产气量；采用HANNAHI221型台式酸度计测定发酵液的pH；干物质降解率采用烘干减质量法测定；NH₃-N含量采用冯宗慈改进的比色法测定^[12]；VFA含量参照胡伟莲^[13]气相色谱内标法，采用日本岛津GC-14B型气相色谱仪测定；乳酸含量的测定参照Barker等^[14]方法；菌体蛋白含量测定参照文献^{[15, 16]}测定，Lowry试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。

试验数据经Excel 2013初步整理后，用SPSS 17.0进行统计分析。试验各组之间的差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，多重比较采用最小显著差数(LSD)法，结果用平均值±标准误表示。

由表3可知，在各时间点试验组的产气量均高于对照组，其中试验Ⅱ组在3和6 h显著高于对照组(P＜0.05)，其余时间点组间差异不显著(P>0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 甜菜碱对体外发酵产气量的影响 Table 3 Effects of betaine on gas production of in vitro fermentation mL 时间 Time/h 对照组 Control group 试验Ⅰ组 Test group Ⅰ 试验Ⅱ组 Test group Ⅱ 3 16.29±0.63a 17.27±1.16ab 18.92±0.73b 6 28.46±1.32a 30.33±1.34ab 32.67±0.64b 12 45.50±1.84 45.63±1.20 48.80±0.71 18 55.50±1.57 55.63±2.03 57.60±1.33 24 63.00±0.52 64.00±1.78 66.90±1.52  同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P＞0.01)。下表同。  In the same row,values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P＞0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P＜0.05),and with different capital letter superscripts mean significant difference (P＞0.01). The same as below.

表3 甜菜碱对体外发酵产气量的影响 Table 3 Effects of betaine on gas production of in vitro fermentation

由表4可知,各组在各发酵时刻的pH均处于 正常范围(6~7)，由于发酵产物的积累发酵液的pH逐渐减小，在6 h试验Ⅱ组显著低于对照组和试验Ⅰ组(P＜0.05)，其余时间点差异不显著(P>0.05)，但均低于对照组和试验Ⅰ组；试验组的干物质降解率和菌体蛋白含量均比对照组高，其中在6 h达到显著水平(P＜0.05)；试验组NH₃-N含量在6 h均低于对照组，但差异不显著(P>0.05)，试验Ⅰ组NH₃-N含量在12 h极显著高于对照组(P＜0.01)，24 h高于对照组，差异不显著(P>0.05)，试验Ⅱ组NH₃-N含量在12 h极显著高于对照组(P＜0.01)，24 h显著高于对照组(P＜0.05)；试验组之间以及与对照组相比，乳酸含量无显著性差异(P>0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 甜菜碱对发酵液pH、干物质降解率、菌体蛋白、乳酸和氨氮含量的影响 Table 4 Effects of betaine on pH,DMD and bacteria protein,lactic acid and NH3-N contents of fermentation fluid 项目 Items 时间 Time/h 对照组 Control group 试验Ⅰ组 Test group Ⅰ 试验Ⅱ组 Test group Ⅱ pH 6 6.95±0.01a 6.94±0.01a 6.90±0.02b 12 6.89±0.01 6.90±0.02 6.86±0.01 24 6.88±0.02 6.87±0.02 6.86±0.02 干物质降解率 DMD/% 6 14.29±0.70a 17.87±1.62b 19.70±2.29b 12 29.10±2.37 33.89±4.80 29.60±5.03 24 34.55±2.26 37.28±3.22 38.02±2.56 菌体蛋白 Bacteria protein/(mg/dL) 6 10.80±0.17a 12.00±0.46b 11.88±0.19b 12 11.54±0.29 11.77±0.21 11.69±0.35 24 11.69±0.79 13.05±0.49 11.82±0.09 乳酸 Lactic acid/(mmol/L) 6 0.16±0.01 0.16±0.01 0.15±0.01 12 0.15±0.01 0.15±0.01 0.16±0.01 24 0.17±0.01 0.17±0.01 0.17±0.01 氨氮 NH3-N/(mg/dL) 6 10.56±0.28 9.98±0.16 10.12±0.16 12 9.42±0.17Aa 11.74±0.48Bb 13.56±0.30Cc 24 15.27±0.37a 16.55±0.88ab 17.48±0.47b

表4 甜菜碱对发酵液pH、干物质降解率、菌体蛋白、乳酸和氨氮含量的影响 Table 4 Effects of betaine on pH,DMD and bacteria protein,lactic acid and NH3-N contents of fermentation fluid

由表5可知，试验组发酵液中的VFA含量较对照组总体呈增加趋势。在6 h试验Ⅱ组的丁酸含量显著高于对照组(P＜0.05)；与对照组相比，在12 h试验组的异丁酸含量极显著高于对照组(P＜0.01)，异戊酸含量显著高于对照组(P＜0.05)，试验Ⅰ组戊酸含量极显著高于对照组(P＜0.01)，试验Ⅱ组显著高于对照组(P＜0.05)，试验组乙酸/丙酸极显著高于对照组(P＜0.01)；24 h试验组与对照组相比，各VFA含量无显著差异(P>0.05)。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 甜菜碱对发酵液挥发性脂肪酸含量的影响 Table 5 Effects of betaine on VFA contents of fermentation fluid 项目 Items 时间 Time/h 对照组 Control group 试验Ⅰ组 Test group Ⅰ 试验Ⅱ组 Test group Ⅱ 乙酸 Acetic acid/(mmol/L) 6 17.63±1.75 19.45±1.25 20.12±1.13 12 22.07±2.09 23.67±1.82 22.73±0.19 24 25.05±0.31 25.59±1.09 25.83±0.94 丙酸 Propionic acid/(mmol/L) 6 6.99±0.64 7.69±0.64 8.29±0.30 12 9.37±1.00 9.53±0.72 9.04±0.05 24 10.01±0.13 10.40±0.34 10.24±0.39 异丁酸 Isobutyric acid/(mmol/L) 6 0.27±0.03 0.27±0.02 0.29±0.02 12 0.31±0.01Aa 0.44±0.04Bb 0.49±0.01Bb 24 0.54±0.04 0.60±0.04 0.61±0.02 丁酸 Butyric acid/(mmol/L) 6 2.61±0.09a 2.80±0.10ab 3.02±0.04b 12 3.31±0.12 3.66±0.13 3.62±0.10 24 3.82±0.12 3.82±0.10 3.84±0.07 异戊酸 Isovaleric acid/(mmol/L) 6 0.31±0.01 0.33±0.02 0.36±0.02 12 0.41±0.01a 0.64±0.07b 0.63±0.02b 24 0.81±0.07 0.92±0.08 0.97±0.04 戊酸 Valeric acid/(mmol/L) 6 0.31±0.03 0.30±0.04 0.31±0.03 12 0.40±0.02Aa 0.54±0.04Bb 0.51±0.01ABb 24 0.53±0.05 0.57±0.07 0.62±0.05 乙酸/丙酸 Acetic acid/propionic acid 6 2.52±0.02 2.54±0.09 2.42±0.07 12 2.36±0.04Aa 2.48±0.02Bb 2.51±0.02Bb 24 2.50±0.04 2.46±0.09 2.52±0.04 总挥发性脂肪酸 TVFA/(mmol/L) 6 28.12±2.51 30.86±1.89 32.39±1.33 12 35.87±3.20 38.48±2.75 37.03±0.24 24 40.76±0.32 41.89±1.50 42.11±1.30

表5 甜菜碱对发酵液挥发性脂肪酸含量的影响 Table 5 Effects of betaine on VFA contents of fermentation fluid

近年来研究发现甜菜碱可为机体高效提供活性甲基，参与蛋白质与脂类代谢，有调节渗透压，缓解应激，促进采食等生理过程，但关于甜菜碱在反刍动物上的应用较少，其具体降解机理和作用机制还有待于进一步研究和证实。

相对稳定的瘤胃内环境是瘤胃微生物发挥正常功能的重要条件，pH过低对于瘤胃微生物正常生长、发育及发酵有不利的影响。本试验结果表明随着发酵时间的延长，发酵产物的不断积累，各组pH均呈下降的趋势，而试验组较对照组下降快。但总体来讲pH的变化范围未超出瘤胃微生物的最适生长范围^[12]，对瘤胃发酵没有产生不利影响。

瘤胃液中的氨氮是瘤胃氮代谢过程中外源蛋白质和内源含氮物质降解的重要产物，它同时也是瘤胃微生物合成菌体蛋白的原料。其含量是瘤胃内环境参数的一个重要指标，它反映了瘤胃内微生物氮的供应状况。一般情况下，瘤胃液NH₃-N含量处于动态平衡状况，但其含量常受氮进食量、饲粮蛋白质降解度、瘤胃微生物合成速度以及瘤胃对NH₃-N的吸收等因素的影响。通常情况下，如果含氮物质供应不足，则微生物生成受阻，降低动物的生产性能；而含氮物质过量，则会在瘤胃内降解产生大量不能被微生物充分利用的氨，会造成大量氨从瘤胃中吸收进入血液，最后经肝脏处理产生尿素由尿中排出，一方面造成氮源的浪费，另一方面会造成动物氨中毒。菌体蛋白是瘤胃微生物经复杂的发酵过程合成的，菌体蛋白是反刍动物最主要的氮源供应者，它可以满足动物营养需要量的40%~80%。本试验中，试验组的NH₃-N和菌体蛋白含量有升高的趋势，说明甜菜碱可以促进瘤胃发酵NH₃-N的产生，进而为菌体蛋白的合成提供足够的氮源，促进了菌体蛋白的产生。

反刍动物的最为突出的营养生理特点——瘤胃发酵是指瘤胃微生物在一定程度上将饲料的碳水化合物发酵产生VFA，将饲料的含氮化合物降解为氨^[17]，瘤胃发酵产生的VFA是反刍动物赖以生存、保持正常生长、泌乳繁殖的主要能源，可提供反刍动物总能量需要的70%~80%^[18]。通过瘤胃发酵不仅使反刍动物大量利用单胃动物和人类所不能充分利用的纤维物质，提高VFA的含量，而且使利用低质蛋白质饲料成为可能。VFA是碳水化合物在瘤胃内经多种微生物发酵的主要产物，它提供的能量几乎占反刍动物所吸收利用的营养物质总能的2/3，VFA的变化是反映乳脂率、瘤胃发酵、瘤胃消化代谢的重要指标。通常，非结构性碳水化合物(NSC)发酵的产物中丙酸的比例较高，而纤维类物质发酵以产乙酸为主^[19]。本试验发现,随着发酵时间的延长，试验组的VFA含量比对照组高，而VFA含量与pH呈反相关，试验中试验组pH的降低间接反映VFA含量的增加。甜菜碱是天然甲基供体，纯甜菜碱供甲基的效率是50%分别是胆碱和DL-蛋氨酸的2.3~4.2倍和1.5~3.3倍。早期体内和体外研究表明甜菜碱被瘤胃微生物代谢为乙酸和三甲胺^[20]，但甜菜碱在瘤胃内的降解受到试验条件和饲粮类型的影响，本研究发现添加甜菜碱可以提高奶牛瘤胃体外发酵VFA含量。

产气量和干物质降解率的多少，反映饲料的利用情况，本试验发现试验组产气量和干物质降解率都显著提高，而添加甜菜碱可以促进饲料在瘤胃的消化，进而提高饲料利用率。

乳酸是瘤胃发酵的中间产物，乳酸的及时清除对防止瘤胃酸中毒有重要意义。在瘤胃发酵过程中，乳酸不断转化为VFA，进而为动物利用，有研究报道，瘤胃液乳酸含量与VFA含量、纤维素降解率成反比^[21]。本试验发现，各组乳酸含量差距不大，说明添加甜菜碱对瘤胃发酵的乳酸产生没有影响。

添加1.2和3.6 mg的甜菜碱可以降低体外瘤胃发酵pH，提高产气量，干物质降解率，NH₃-N、菌体蛋白、VFA含量，并呈现剂量依赖性，且在发酵6 h时最为明显。