乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L. lactis)是一种常温发酵菌，是乳酸菌(latic acid bacteria,LAB)中的典型菌种。乳酸乳球菌可在动物肠道中存活并发挥重要的生理作用，但并不能在动物消化道中长期定植^[1]，是食品级医药工业中具有重要应用前景的微生物之一，被公认为安全的食品级微生物。

养猪生产中，LAB作为一种新型绿色饲料添加剂，已被证实在提高猪生产性能，改善猪肉品质等方面具有良好的效用^[2]。随着分子生物学的发展，乳酸乳球菌因具有益生作用和表达外源功能蛋白的双重功能作为载体菌具有巨大的优势。将表达外源产物的重组乳酸乳球菌饲喂给猪，可改善猪的健康状况、生产性能以及用于疾病的预防与治疗，这可为养猪产业的健康发展提供一种新的途径。

20世纪80年代开始，研究者致力于对乳酸乳球菌生物学性质和分子机制研究并已取得重大进展，近年来，关于乳酸乳球菌作为载体表达外源基因的研究也不断开展。研究已证明乳酸乳球菌具有安全性，且自分泌蛋白质少，无胞外蛋白质，有利于排出干扰和保证外源蛋白质功能正常发挥，并且全基因序列已测定，表达系统的研究也较为深入、成熟^[3]，十分适合作为载体进行运用。

根据LAB表达载体启动子类型的不同，乳酸乳球菌表达系统中外源蛋白质的表达可分为组成型、诱导型。相比而言，诱导表达系统使外源基因的时空表达得到控制，使细菌生长和外源基因的高效表达分开，因此诱导型表达更有利于外源蛋白质表达^[4]。采用诱导型启动子已实现了许多外源蛋白质在乳酸乳球菌中的大量表达，并开发出含有不同诱导型启动子的多种表达系统，如T7启动子的表达系统、乳糖诱导转录系统、温度诱导系统、噬菌体感染系统和乳链菌肽(nisin)诱导表达系统(nisin-controlled expression system，NICE)等。其中NICE系统是目前最为有效、应用最为广泛的乳酸乳球菌食品级诱导表达系统^[5]，近年来由乳酸乳球菌表达外源蛋白质大多数都利用了此系统。

根据目的基因序列及表达载体质粒多克隆位点的特点，设计并合成引物，从组织样中提取总RNA，并以之为模板，逆转录后进行PCR扩增，获得含目的基因的片段，将该片段与表达载体质粒连接，随后转化进入宿主菌细胞内，通过质粒提取、PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定分析，证明目的基因已成功插入到表达载体质粒中，获得含有目的基因的表达载体质粒。将获得的重组质粒转化入乳酸乳球菌中，经诱导表达后利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析，该重组乳酸乳球菌表达产物与预期大小是否相符，并经Western blot测定目的产物抗原特异性及产量，获得表达目的产物的重组乳酸乳球菌^{[6, 7, 8, 9]}。

EGF是一种广泛存在于动物体液与腺体中的生长因子，动物乳中的EGF含量丰富且能够促进新生动物胃、肠道发育。研究表明，EGF具有促进猪早期胚胎发育^[10]、促进断奶仔猪生长^[11]的作用。因此利用表达EGF的乳酸乳球菌(EGF-LL)来缓解因早期断奶造成的肠道黏膜损伤，促进肠道发育具有重要的应用价值。

Cheung等^[6]以pAMJ399为表达载体(启动子受pH调控)来构建EGF-LL，并给断奶小鼠口服饲喂为期9 d的EGF-LL菌液，结果表明，试验组小鼠平均体重以及十二指肠、空肠、回肠的绒毛高度高于磷酸盐缓冲液组和空载体组。重组菌发酵后的全细胞悬液胃内灌服断奶仔猪，试验组仔猪十二指肠、空肠绒毛高度显著高于对照组^[7]。本实验室以NICE系统构建表达猪源生长表皮因子(porcine epidermal growth factor，pEGF)的重组乳酸乳球菌，研究发现，21日龄断奶仔猪连续饲喂14 d诱导表达pEGF后的重组乳酸乳球菌悬混液(LL-pEGF)，试验组最终体重显著高于对照组；且试验组仔猪十二指肠、空肠、回肠的绒毛高度显著高于对照组和空载体组^[8]；进一步研究发现，LL-pEGF能影响断奶仔猪肠道功能和结构完整性相关蛋白质mRNA的表达，LL-pEGF较对照组提高了空肠和回肠肠道结构相关蛋白、氨肽酶A、氨肽酶N及养分转运蛋白mRNA的表达水平^[9] 。与mRNA表达水平结果一致，LL-pEGF组较对照组和抗生素组提高了十二指肠氨肽酶A、氨肽酶N的活性^[8]。这与Bedford等^[12]有关EGF对仔猪生产性能的影响机制研究相类似，并且EGF-LL还能降低断奶应激造成的炎症反应，调控空肠绒毛杯状细胞的增殖和成熟。

LF是一种天然活性铁结合蛋白质，研究表明，给仔猪饲喂LF具有调节肠道菌群^[13]、促进肠道细胞增殖^[14]、提高养分利用率^[15]、增强免疫力和抗氧化能力^[16]、促进仔猪早期神经发育^[17]的功能。从乳清中提取纯化获得LF的传统工艺较为复杂，如果利用基因工程宿主菌表达外源蛋白质则需纯化，但乳酸乳球菌对动物有有益作用，LF的抑菌作用对需铁量低的乳酸乳球菌不产生影响，因此利用乳酸乳球菌表达LF具有巨大的优势。

黄薇薇等^[18]在基础饲粮中搅拌添加表达LF的乳酸乳球菌发酵菌液饲喂断奶仔猪，试验21 d后结果显示，试验组仔猪较对照组与抗生素组的十二指肠、空肠绒毛高度/隐窝深度极显著提高，电镜下观察肠黏膜发现试验组仔猪肠绒毛完整，整齐度均一，肠基部致密紧凑，说明试验组仔猪肠道发育得到了改善；试验组较对照组与抗生素组仔猪的脾脏指数和胸腺指数显著提高，血清免疫球蛋白(Ig)G、肠黏液分泌型免疫球蛋白A(sIgA)含量显著提高，血清白细胞介素(IL)-1与IL-2含量增加，说明试验组仔猪免疫器官的成熟更快，免疫功能也得到增强，因此生产性能得到改善，平均日增重显著提高，料重比极显著降低。

IL是细胞因子的一大类，在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节等一系列过程中均发挥重要作用。研究表明IL具有提高免疫能力、抗病毒^[19]、抗炎症^[20]等作用。表达猪源IL-2的乳酸乳球菌成功构建为IL在养猪生产中应用提供了依据^[21]。通过分离猪外周血单核淋巴细胞，以及生物学技术获得表达猪白细胞介素-18(pIL-18)的重组乳酸乳球菌，该重组菌分泌表达的pIL-18能促进猪脾脏淋巴细胞增殖，且对病毒增殖有明显抑制作用^[22]。王美芳等^[23]成功构建了表达猪源IL-10重组植物乳酸杆菌，将倍比稀释后的菌液灌服断奶仔猪，并对仔猪进行产肠毒素大肠杆菌(ETEC)攻毒，直至发病为止停止攻毒，结果发现饲喂重组菌菌液组断奶仔猪体增重更快，且在第2、3周时血清中IgG和肠黏膜sIgA含量极显著升高，淋巴细胞转化率高，说明重组菌的菌液具有调节仔猪免疫功能作用；同时试验组仔猪IL-4含量显著提高，炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量极显著下降，说明重组菌的菌液具有抗炎作用。

利用重组乳酸乳球菌表达的功能性蛋白质还有很多，但是在养猪产业中的应用还需要进一步的研究。如猪源干扰素-γ在乳酸乳球菌中的成功表达^[24]，可为调节猪过敏性免疫反应能力，增强猪对疾病的抵抗能力提供可能性；猪脂联素球状结构域gAd也在乳酸乳球菌中成功诱导表达，将含gAd蛋白的生理盐水溶液通过尾静脉注射至高糖饲喂的小鼠体内以鉴定其生物活性，结果显示gAd蛋白具有加快糖代谢、降低血糖含量的作用^[25]，这提示我们可否将其运用于调节猪脂肪沉积，改善猪肉品质，为优质猪肉生产奠定基础；此外，多个来源的抗菌肽基因已经在乳酸乳球菌中成功表达，包括enterocin P^[26]、apidaecin^[27]、pediocin PA-1^[28]等。抗菌肽作为一类具有抗菌活性的多肽，研究表明仔猪饲粮中添加抗菌肽具有缓解早期断奶应激、减少腹泻、提高饲料报酬、促进生长、提高免疫力等的效果^[29]，种猪饲粮中添加抗菌肽能够改善种猪的繁殖性能并提高新生仔猪生长性能^{[30, 31]}。利用重组乳酸乳球菌解决传统抗菌肽提取工艺中的困难和天然资源有限的问题，选择适用于养猪生产的抗菌肽作为饲料添加剂将有助于提高生产效益；Ozkose等^[32]成功构建了表达纤维素酶的重组乳酸乳球菌，启示我们是否可以尝试用表达纤维素酶的重组乳酸乳球菌来解决由于猪体内缺乏内源性纤维素消化酶而造成的粗纤维饲料消化率低的影响，提高猪对纤维素的消化率，改善饲料报酬。

猪疾病的预防与治疗是保障养猪业健康发展的一个关键步骤，但随着集约化、现代化养殖业发展，传统的疾病预防和治疗方法不断受到挑战，寻找更安全的方式势在必行。近年来，细菌载体疫苗成为了新兴现代疫苗的重要发展方向，利用乳酸乳球菌将靶抗原或病原体特异性抗原DNA片段插入质粒载体转入菌体中诱导表达，并作为疫苗向动物体内免疫系统呈递抗原，刺激机体进行免疫应答，从而达到疾病预防和治疗的目的。

ETEC诱导的仔猪腹泻机制中起关键作用，构建含有ETEC黏附素蛋白亚基Fae G基因的重组乳酸乳球菌，将重组菌悬液通过肌肉注射仔猪，免疫后测定结果表明，仔猪血清内IgG含量显著提高，血清IgA和IgM含量适度增加，且脾脏、肠细胞淋巴结、空肠的IgG、IgA和IgM抗体分泌细胞被诱导激活^[33]，由此表明表达Fae G的重组乳酸乳球菌有希望作为一个针对ETEC的有效疫苗。

PED和TGE均是冠状病毒引起的消化道传染病。将PED病毒S基因上编码ps420蛋白的基因片段(1 495～1 916 bp)插入乳酸乳球菌表达载体，获得了表达PED病毒S基因ps420的重组乳酸乳球菌，将重组乳酸乳球菌悬液灌服家兔可有效提高血清IgG含量，从而初步证明ps420蛋白具有中和活性^[34]。同理，构建含有4个主要抗原位点的TGE病毒纤突蛋白的全序列的重组乳酸乳球菌，该蛋白具有TGE全病毒的抗原性，将表达TGEV纤突蛋白的重组乳酸乳球菌乳酸乳球菌及空质粒菌株分别口服免疫小鼠，收集粪便样品进行抗体检测，结果表明分泌型重组菌免疫的小鼠能够产生抗TGEV sIgA抗体^[35]。

还有一些常见猪疾病的抗原在乳酸乳球菌成功诱导表达。表达猪轮状病毒VP4蛋白的重组乳酸乳球菌已成功构建，小鼠通过口服重组菌悬液进行3次免疫，免疫后饲喂重组菌组小鼠的抗体浓度提高^[36]；Wang等^[37]构建了表达致病性猪圆环病毒PCV2衣壳蛋白的重组乳酸乳球菌，通过口服免疫的方式发现鼠血清PCV2特异性抗体浓度提高；Wang等^[38]以猪繁殖与呼吸综合征的ORF6基因作为目的基因，构建重组乳酸乳球菌活载体疫苗。可见，多种多样猪疾病抗原在乳酸乳球菌中不断得到表达与应用，对养猪生产中疾病的防治也会发挥越来越大的作用。

就目前而言，已有大量的外源产物在乳酸乳球菌中成功表达，在试验条件下对动物也表现出积极的作用，这不仅是作为载体菌的乳酸乳球菌对动物具有有益作用，所表达产物如细胞因子、酶类等也具有良好生物效用，还包括对动物疾病的预防治疗所展现的应用潜力。虽然用于乳酸乳球菌表达外源产物的工具和条件已相对成熟，但在实际生产中广泛应用还存在一定的问题，已有研究证明去除基因修饰过的乳酸乳球菌的表达产物对猪的作用仍然明显，且含有高浓度的乳酸乳球菌反而会影响表达产物的效用^[39]，因此生产中应用的方式还需要探究；表达的外源蛋白质(特别是一些大分子物质)分泌量不足，表达系统还需要优化；疫苗呈递载体时，免疫的剂量与免疫的次数还需要进一步研究。以及改变基因的宿主菌能否在生产中长时间存活以及是否存在潜在的生物安全问题，目前仍不清楚。但不可否认的是随着研究的不断深入，乳酸乳球菌表达系统的不断完善，诸如此类的问题将一一被解决，因此，重组乳酸乳球菌以其安全、价低的优势，可作为一种具有重要应用潜力的载体菌在安全、高效、优质的养猪产业中发挥其重大作用。