仔猪断奶时易出现采食量下降、肠绒毛萎缩、生长缓慢和腹泻等不良现象[1]，虽然抗生素在应对仔猪断奶应激时发挥了巨大作用，但由于耐药性问题日趋严重，抗生素替代品受到极大关注[2]。益生菌是一类能在宿主体内存活，通过抑制或杀死有害病原菌、改善肠道微生态环境、增强肠道屏障功能和宿主免疫机能，从而促进宿主健康的活菌制剂[3, 4, 5]。最常见的益生菌是产乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)，它们广泛存在于人和动物肠道内且有较强的产乳酸能力[5, 6]，其中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)等乳酸杆菌研究较为广泛和深入，在欧洲许多菌株已商品化生产[5]。Suo等[7]研究发现，植物乳杆菌ZJ316能显著抑制大肠杆菌和沙门氏菌生长，促进仔猪小肠绒毛发育，改善肠道形态，提高仔猪日增重和饲料转化率，减少腹泻发生；Guerra-Ordaz等[8]报道，断奶仔猪饲喂7 d植物乳杆菌后，回肠、结肠总乳酸杆菌数上升，回肠绒毛高度和杯状细胞数量上升，腹泻显著减少；Pieper等[9]报道，植物乳杆菌通过促进肠道有益菌生长，调节微生物菌群结构和多样性，促进断奶仔猪健康。但也有研究发现，不同菌种特性不尽相同，相同菌种不同菌株其作用也不尽相同[5]。为此，本研究通过给断奶前仔猪灌喂植物乳杆菌和干酪乳杆菌，研究其对仔猪生长性能、器官指数及小肠形态的影响，初步评价测试菌株对仔猪断奶的缓解作用，并为益生菌产品的开发提供基础证据。
1 材料与方法 1.1 试验动物与试验设计本试验于江苏省常州市某猪场选取同一品种(大×长)、出生日期相近的15窝7日龄仔猪，随机分为3组，分别灌喂去离子水(对照组)、1×109 CFU/头植物乳杆菌菌液(LP组)和1×109 CFU/头干酪乳杆菌菌液(LC组)，每组5个重复，每个重复为1窝仔猪(8~10头)。植物乳杆菌 与干酪乳杆菌冻干粉由北京大北农集团有限公司提供，试验于7日龄开始，21日龄断奶，35日龄结束，共29 d，于7、9、11、13、19、21、24日龄仔猪灌喂去离子水或菌液，仔猪断奶后基础饲粮组成及营养水平见表1。试验期间仔猪饲养于半封闭、漏缝地板式猪舍，自然采光，每天清扫；每天饲喂2次，试验全期自由采食、饮水。按常规程序进行仔猪免疫，试验期间腹泻仔猪不用药物治疗。
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表 1 仔猪断奶后基础饲粮组成及营养水平(饲喂基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet for post-weaning piglets (as-fed basis) |
肝脏等器官样品：于仔猪21、24和35日龄分别从对照组、LP组和LC组每个重复随机选1头仔猪，称重后屠宰，分离肝脏、胸腺、脾脏、胃、小肠(十二指肠、空肠和回肠)、大肠(盲肠和结肠)，用滤纸吸掉血液，剔除脂肪后分别称重，用于器官指数分析。
空、回肠组织样品：处死仔猪后，打开腹腔取出胃肠道，按组织学区分各肠段，剪取空肠、回肠组织各2 cm，磷酸盐缓冲液(PBS)漂去肠内容物后，置组织样于4%多聚甲醛中常温固定，用于制作常规石蜡切片测定小肠绒毛高度和隐窝深度，计算绒腺比。
1.3 指标测定及方法 1.3.1 体重和采食量于仔猪7、21、24和35日龄晨饲前以重复为单位对仔猪空腹称重，计算每窝仔猪的平均日增重(average daily gain，ADG)；根据采食量的多少决定给料量，并记录剩料量，计算平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)和料重比(feed/gain，F/G)。
1.3.2 腹泻率准确记录每天腹泻头数，1 d 1头仔猪发生腹泻记为1头次，各期每个重复腹泻总头次除以其相应的仔猪总头次，求得各组的平均值，即为各组在试验期的腹泻率。
切片后，常规苏木精-伊红(HE)染色，每头猪、每个肠段制5张切片，每张切片中至少选5个视野计量仔猪空肠、回肠的绒毛高度和隐窝深度。
1.4 统计分析数据经Excel 2007初步整理后，采用SPSS 20.0软件中的单因素方差(one-way ANOVA)模型进行分析，Tukey S-B test比较差异显著性，P<0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 植物乳杆菌和干酪乳杆菌对仔猪生长性能的影响由表2可知，仔猪灌喂植物乳杆菌和干酪乳杆菌对断奶前仔猪ADFI、ADG和F/G均无显著影响(P>0.05)，但能显著降低仔猪腹泻率(P<0.05)，与对照组相比，植物乳杆菌和干酪乳杆菌分别降低腹泻率23.88%和24.05%(P<0.05)。与对照组相比，植物乳杆菌和干酪乳杆菌显著提高断奶后仔猪ADFI和ADG(P<0.05)，显著降低F/G(P<0.05)，但对腹泻率无显著影响(P>0.05)。整个试验期，LP和LC组ADFI和ADG均显著高于对照组(P<0.05)，但3组间F/G和腹泻率差异不显著(P>0.05)，LP和LC组有降低F/G和腹泻率的趋势(P>0.05)。
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表 2 植物乳杆菌和干酪乳杆菌对仔猪生长性能和腹泻率的影响 Table 2 Effects of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus casei on growth performance and diarrhea incidence of piglets (n=5) |
由表3可知，与对照组相比，LP和LC组显著提高35日龄仔猪胸腺指数和脾脏指数(P<0.05)，对胃和大肠指数无显著影响(P>0.05)，对21和24日龄所有器官指数均无显著影响(P>0.05)。
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表 3 植物乳杆菌和干酪乳杆菌对仔猪器官指数的影响 Table 3 Effects of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus casei on visceral index of piglets (n=5) |
如表4所示，与对照组相比，LP和LC组促进了24和35日龄仔猪空肠和回肠绒毛发育，提高了绒腺比，但与21日龄相比，24日龄空肠和回肠绒毛高度、绒腺比均降低，35日龄绒毛高度和绒腺比有所恢复，说明断奶影响小肠绒毛、隐窝形态，一段时间后可自行恢复，LP和LC有助于小肠形态的快速恢复。
3 讨 论 3.1 植物乳杆菌和干酪乳杆菌对仔猪生长性能和腹泻率的影响研究结果显示，植物乳杆菌和干酪乳杆菌能提高断奶仔猪ADG和ADFI，降低F/G，这与许多前人的研究结果相似，Lee等[12]报道，当给断奶仔猪以108、109和1010 CFU/kg饲喂植物乳杆菌时，植物乳杆菌呈剂量依赖方式显著提高仔猪ADG和ADFI；Chang等[13]报道，罗伊氏乳杆菌能提高仔猪ADG 27%~34%；Huang等[14]报道，乳杆菌复合物分别提高断奶2周龄仔猪ADG 28%和ADFI 31%。在多数研究中，乳酸杆菌的饲喂剂量通常是109，相当于成年猪10~100 g的食糜，或与猪肠道食糜中乳酸菌数量相当，但Lee等[12]的研究提示我们，为取得较好的生产效果乳酸杆菌的添加量可以达到1010 CFU/kg；Yang等[15]也发现，该剂量的植物乳杆菌能显著提高大肠杆菌(E. coli)攻毒后仔猪的ADG和ADFI。根据本试验，分析测试菌株提高断奶仔猪生长性能的原因，可能是通过改善胃肠道形态如提高绒毛高度、降低隐窝深度，促进丁酸产生和增加微生物区系多样性等共同作用的结果。也有研究报道，乳酸杆菌类 的益生菌可明显促进肠内容物中乳酸杆菌的富集和增殖，从而改善肠道健康，促进断奶仔猪生长[16]，这提示在下一步的机制研究中需要引起注意。
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表 4 植物乳杆菌和干酪乳杆菌对仔猪小肠形态的影响 Table 4 Effects of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus casei on small intestine morphology of piglets (n=5) |
据报道，新生和断奶仔猪腹泻通常与肠毒性E. coli K88有关，E. coli在小肠定植释放肠毒素，破坏肠道屏障引起腹泻[17]。体内、体外乳酸杆菌的研究发现，乳酸杆菌可通过保护肠道紧密连接屏障、竞争排除病原菌、产生抗菌物质、增强宿主免疫功能，减少细胞通透性等降低腹泻的发生[15, 18, 19]，本研究发现仔猪从7日龄饲喂植物乳杆菌和干酪乳杆菌能显著降低断奶前仔猪腹泻率，但断奶后并不影响，说明测试菌株确实产生了一定抗腹泻效果，且较早使用较好，这与Yang等[15]的报道一致，他们发现仔猪出生4日龄开始饲喂植物乳杆菌能明显改善肠道屏障功能，减少E. coli攻毒后仔猪腹泻率，针对本试验腹泻率降低的机制，可通过体外测试菌与病原菌共培养试验、体内微生物菌群结构及数量和代谢产物分析、宿主免疫机能等方面进行深入探讨。
3.2 植物乳杆菌和干酪乳杆菌对仔猪器官指数的影响脾脏属外周免疫器官，脾脏的发育状况关系到体液和细胞免疫的功能能否正常发挥。胸腺属中枢免疫器官，其功能对机体的细胞免疫紧密相关[20]。本研究发现，植物乳杆菌和干酪乳杆菌能显著提高脾脏指数和胸腺指数，说明测试菌株对仔猪免疫器官发育具有一定的促进作用，但是本研究未发现测试菌株对胃肠道指数有显著影响。Lee等[12]报道，植物乳杆菌通过下调炎症因子调控断奶仔猪急性炎症期健康；Suda等[21]报道，乳酸杆菌可显著促进断奶仔猪主要组织相容性复合体Ⅱ类(MHC-Ⅱ)的表达，通过下调Toll-like样受体4(TLR4)介导的核转录因子-κB(NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性下调肠道细胞趋化因子和炎症因子的表达，在这方面我们还需拓展和借鉴，以期进一步探明测试菌株促进仔猪健康、改善生长性能的机制。
3.3 植物乳杆菌和干酪乳杆菌对断奶仔猪小肠形态的影响小肠是营养物质消化和吸收的主要场所，小肠表面积的大小直接反映小肠的吸收功能，绒毛和隐窝的形态特征是反映肠上皮细胞的成熟度及吸收功能的最常用指标，绒毛越高，隐窝越浅，表明肠道消化吸收营养物质的能力越强[22]。本研究发现，植物乳杆菌和干酪乳杆菌能显著改善断奶后仔猪空肠、回肠绒毛发育，提高绒腺比，说明一定程度上测试菌株缓解了断奶对小肠绒毛的损伤，有利于仔猪对营养物质的消化吸收。Yang等[14]发现，植物乳杆菌能显著改善E. coli攻毒造成的仔猪十二指肠和空肠绒毛变短、隐窝加深等问题，其机制可能与益生菌株保护肠道屏障结构及功能有关，也有说与肠道细胞的增殖、上皮更新和微生物区系的改变有关[23]。
4 结 论仔猪7日龄开始饲喂植物乳杆菌和干酪乳杆菌能显著提高断奶后仔猪ADFI、ADG，显著降低F/G，显著提高35日龄仔猪脾脏指数和胸腺器官指数，促进断奶后仔猪空肠和回肠绒毛发育，说明试验菌株具有促生长、抗腹泻的效果。
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