鱼类可以有效利用脂肪，具有节约蛋白质的效应。适当提高饲料中油脂水平，可一定程度减少蛋白质作为能量的消耗。但饲料中添加过多的油脂会导致鱼体脂肪沉积过多，影响鱼类健康和产品品质^{[1, 2, 3]}。饲料中添加具有表面活性作用的乳化剂，能够使进入动物肠道的油脂分散形成乳糜微粒，扩大油脂与脂肪酶的接触面积，从而提高油脂的消化吸收^[4]。水产饲料中常用的乳化剂有胆汁酸盐类、磷脂类和糖苷酯类等单一或复合的乳化剂，这些乳化剂多为动、植物直接提取或化学合成而来^{[5, 6, 7]}。而微生物源的乳化剂在饲料中的应用还鲜见报道。近年来，枯草芽孢杆菌分泌的表面活性物质——表面活性素(surfactin)成为表面活性剂领域的研究热点。它具有特殊的两亲性化学结构，其表面活性强于常见的乳化剂，是最强的生物表面活性剂之一^{[8, 9]}。表面活性素不仅具有广谱高效的抗菌活性，而且对病毒、支原体和原虫等也具有显著的抑制效果，又被称为抗菌脂肽^{[9, 10]}。目前，表面活性素在动物饲料中的应用还处于初步阶段，以往研究主要关注表面活性素的抗菌活性方面。研究表明，表面活性素适量添加到饲料中可提高爱拔益加(AA)肉鸡、断奶仔猪对脂肪的利用效率，促进蛋白质的沉积和动物生长^{[11, 12]}。而表面活性素在水产动物方面，仅有含表面活性素的复合物添加在点带石斑鱼(Epinephelus coioides)^[13]和凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)^[14]饲料中的报道，以及表面活性素添加在吉富罗非鱼饲料中的初步研究^[15]。鉴于此，本文拟通过研究在饲料中添加不同水平的表面活性素对吉富罗非鱼(genetically improved farmed tilapia,GIFT,Oreochromis niloticus)生长性能、血清生化指标及脂肪代谢的影响，探讨表面活性素的促生长效果以及对脂肪代谢的影响，为表面活性素作为新型水产饲料乳化剂的应用提供依据。

饲养试验在集美大学水产学院生态实验室进行。吉富罗非鱼购买于漳州市水产开发中心，饲喂基础饲料暂养驯化15 d之后，选取240尾体格健壮、规格均一、平均体重为(12.0±0.1) g的试验鱼，随机分成4组，分别投喂在基础饲料中添加0(对照组)、50、100和200 mg/kg表面活性素(由福建正源饲料有限公司提供，有效含量为80%)的试验饲料。每组4个重复，每个重复15尾鱼。试验期为7周。

基础饲料配方根据SC/T 1025—2004《罗非鱼配合饲料》配制，其组成及营养水平见表1。

表 1 (Table 1)

表 1 基础饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % 项目 Items 含量 Content 原料 Ingredients 鱼粉 Fish meal 10.0 豆粕 Soybean meal 27.5 米糠粕 Rice bran meal 15.0 菜籽粕 Rapeseed meal 10.0 面粉 Wheat flour 30.0 豆油 Soybean oil 3.0 氯化胆碱 Choline chloride 0.5 磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)2 1.2 食盐 NaCl 1.0 维生素预混料 Vitamin premix1) 0.8 矿物质预混料 Mineral premix2) 1.0 合计 Total 100.0 营养水平 Nutrient levels 总能 GE/(MJ/kg) 17.11 水分 Moisture 8.74 粗蛋白质 CP 33.85 粗脂肪 EE 6.68 粗灰分 Ash 11.46 钙 Ca 0.83 总磷 TP 1.19  1)维生素预混料为每千克饲料提供Vitamin premix provided the following per kg of the diet：VA 25 000 IU，VD3 3 500 IU，VE 20 mg，VK 5 mg，VB1 2.5 mg，VB2 2.5 mg，VB3 1.0 mg，VB6 0.2 mg，生物素 biotin 0.03 mg，叶酸 folic acid 0.75 mg，VB12 0.05 mg，VC 5 mg，泛酸钙 calcium pantothenate 10 mg，肌醇 inositol 100 mg。  2)矿物质预混料为每千克饲料提供Mineral premix provided the following per kg of the diet：NaCl 50 mg，MgSO4·7H2O 25 mg，NaH2PO4·2H2O 25 mg，KH2PO4 32 mg，Ca(H2PO4)2·H2O 20 mg，FeSO4 250 mg，Ca(C3H5O3)2 35 mg，ZnSO4·7H2O 3.5 mg，MnSO4·4H2O 16 mg，CuSO4·5H2O 3 mg，CoCl2·6H2O 5 mg，KIO3 0.3 mg。

表 1 基础饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

饲料原料粉碎过60目筛，各原料混合均匀后，分别添加0、50、100和200 mg/kg表面活性素，用双螺杆制粒机(CD4×1TS型，华南理工大学科技实业总厂)常温加工成直径为2.5 mm的颗粒饲料，自然风干后置于已编号的自封袋中，于-20 ℃冷藏保存备用。

试验鱼养殖于室内具有循环水的水族箱(75 cm×55 cm×60 cm，加水量约为120 L)中。每天08:30和17:30定时投喂，达表观饱食，记录每箱饲料投喂量。投喂0.5 h后吸出残料和粪便，并记录残饵量。试验用水为曝气自来水，每天换水2次，每次换水量约30%。光照为自然光源，增氧机24 h持续增氧。试验期间维持水温(27±2) ℃，pH 7.3±0.2，溶氧浓度高于6.0 mg/L，氨氮浓度低于0.2 mg/L。

饲养试验结束后，试验鱼禁食24 h，称量每个水族箱中全部试验鱼总重，随机取规格相近6尾鱼，用60 mg/L丁香酚进行麻醉处理，测量体重，尾静脉取血，4 ℃静置30 min后离心(3 000 r/min,10 min)取血清，保存于-80 ℃冰箱，待测血清生化指标。采血后的试验鱼解剖，分离出肝胰脏和肠道，保存于-80 ℃冰箱，待测消化酶、脂肪代谢关键酶的水平或活性。

组织匀浆液制备时，将冷冻于-80 ℃的吉富罗非鱼肝胰脏和肠道组织取出，先放入4 ℃冰箱中解冻，然后在冰浴的0.86%生理盐水中漂洗，去除血液，滤纸拭干，称重，按组织重(g)与0.86%生理盐水体积(mL)比(m/v)=1 ∶ 9在冰浴条件下制成10%的组织匀浆液(匀浆时间10 s/次，间隙20 s，连续5～7次)，再将10%的组织匀浆液在4 ℃条件下以3 000 r/min离心10 min，取上清液分装到1.5 mL离心管中于-20 ℃冰箱保存待测。

根据记录的试验数据，按下列公式计算各生长性能指标：

增重率(weight gain rate,WGR,%)=100×(W_t-W₀)/W₀；

特定生长率(specific growth rate,SGR,%/d)=100×(lnW_t-lnW₀)/t；

饲料系数(feed conversion ratio,FCR)=FC/(W_t-W₀)；

摄食率(feeding rate,FR,%)=100×FC/[(W₀+W_t)/2]/t；

日摄食量(daily feed intake,DFI,g/尾)=FC/t；

存活率(survival rate,SR,%)=100×N_f/N_i。

式中：W₀为每尾鱼平均初始体重(initial body weight,IBW)，g/尾；W_t为每尾鱼平均终末体重(final body weight,FBW)，g/尾；t为饲喂天数，d；FC为平均每尾鱼摄食饲料总量(feed consumption)(风干样重)，g；N_i为初始鱼尾数，尾；N_f为终末鱼尾数，尾。

肠道脂肪酶和淀粉酶活性采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒进行测定。肠道蛋白酶活性的测定采用福林-酚试剂法，以磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液调节pH，680 nm处测吸光度值。

血清尿素氮(urea nitrogen,UN)、白蛋白(albnmin,ALB)、甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)水平分别用Fearon法、溴甲酚绿法、酶偶联比色法、甘油磷酸氧化酶-过氧化物酶(GPO-PAP)法、铜试剂法测定；酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)活性均采用磷酸苯二钠比色法测定；溶菌酶(lysozyme,LZM)活性采用比浊法，利用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定。

肝胰脏脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase,FAS)和乙酰辅酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase,ACC)水平采用双抗体酶联免疫分析法测定；肝脂酶(hepatic lipase,HL)和脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)活性均采用铜试剂法测定，试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，具体操作步骤见说明书。

所有试验数据以平均值±标准差(mean±SD)表示。原始数据用Excel 2010整理后，采用SPSS 19.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，若组间存在显著差异，则采用Duncan氏法进行多重比较，P<0.05表示差异显著。

由表2可知，各添加组的FBW、WGR和SGR均显著高于对照组(P<0.05)，同时50 mg/kg添加组显著高于200 mg/kg添加组(P<0.05)。各添加组的FCR均显著低于对照组(P<0.05)，各添加组之间无显著差异(P>0.05)。50 mg/kg添加组的DFI显著高于对照组和200 mg/kg添加组(P<0.05)，与100 mg/kg添加组无显著差异(P>0.05)。各组间FR和SR无显著差异(P>0.05)。

表 2 (Table 2)

表 2 饲料中添加表面活性素对吉富罗非鱼生长性能的影响 Table 2 Effects of surfactin supplementation on growth performance of GIFT 项目 Items 表面活性素添加水平 Surfactin supplemental level/(mg/kg) 0 50 100 200 初始体重 IBW/(g/尾) 12.0±0.1 12.0±0.2 12.0±0.2 12.0±0.1 终末体重 FBW/(g/尾) 78.2±2.7a 94.0±3.3c 88.0±3.2bc 85.6±6.0b 增重率 WGR/% 551.3±21.7a 683.2±21.1c 633.1±18.2b 614.1±29.5b 特定生长率 SGR/(%/d) 3.83±0.07a 4.20±0.03c 4.07±0.05b 4.02±0.12b 饲料系数 FCR 1.31±0.06b 1.21±0.06a 1.23±0.05a 1.25±0.04a 日摄食量 DFI/(g/尾) 1.77±0.03a 2.01±0.11b 1.89±0.13ab 1.88±0.12a 摄食率 FR/% 3.89±0.11 3.80±0.09 3.79±0.05 3.84±0.23 存活率 SR/% 95.00±10.00 100.00±0.00 91.67±10.00 95.00±10.00  同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。  In the same row,values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表 2 饲料中添加表面活性素对吉富罗非鱼生长性能的影响 Table 2 Effects of surfactin supplementation on growth performance of GIFT

由表3可知，饲料中添加表面活性素对吉富罗非鱼肠道淀粉酶和蛋白酶活性无显著影响(P>0.05)。随着表面活性素添加水平的升高，吉富罗非鱼肠道脂肪酶活性呈现上升趋势，除50 mg/kg添加组外，其余各添加组均显著高于对照组(P<0.05)，但各添加组之间无显著差异(P>0.05)。

表 3 (Table 3)

表 3 饲料中添加表面活性素对吉富罗非鱼肠道消化酶活性的影响 Table 3 Effects of surfactin supplementation on digestive enzyme activeties of GIFT 项目 Items 表面活性素添加水平 Surfactin supplemental level/(mg/kg) 0 50 100 200 淀粉酶 Amylase/(U/mg prot) 1.12±0.05 1.11±0.07 1.11±0.06 1.07±0.06 脂肪酶 Lipase/(U/g prot) 4.43±0.15a 5.03±0.43ab 5.24±0.42b 5.39±0.33b 蛋白酶 Protease/(U/mg prot) 25.22±0.42 26.57±0.54 26.43±0.67 25.98±0.37

表 3 饲料中添加表面活性素对吉富罗非鱼肠道消化酶活性的影响 Table 3 Effects of surfactin supplementation on digestive enzyme activeties of GIFT

由表4可知，50 mg/kg添加组血清UN水平显著低于对照组(P<0.05)，其他添加组与对照组相比无显著差异(P>0.05)。各添加组血清ALB水平均显著高于对照组(P<0.05)，但各添加组之间差异不显著(P>0.05)。除200 mg/kg添加组外，其他添加组血清TC水平显著低于对照组(P<0.05)。各添加组血清TG水平均显著低于对照组(P<0.05)，但各添加组之间差异不显著(P>0.05)。各添加组血清FFA水平显著高于对照组 (P<0.05)，但各添加组之间无显著差异(P> 0.05)。各添加组血清ACP和AKP活性与对照组均无显著差异(P>0.05)。各添加组血清LZM活性均显著高于对照组(P<0.05)，以50 mg/kg添加组血清LZM活性最高。

表 4 (Table 4)

表 4 饲料中添加表面活性素对吉富罗非鱼血清生化指标的影响 Table 4 Effects of surfactin supplementation on serum biochemical indexes of GIFT 项目 Items 表面活性素添加水平 Surfactin supplemental level/(mg/kg) 0 50 100 200 尿素氮 UN/(mmol/L) 2.02±0.27b 1.65±0.05a 1.85±0.07ab 1.94±0.09b 白蛋白 ALB/(g/L) 13.86±1.11a 14.61±1.58b 15.76±0.56b 16.13±0.43b 总胆固醇 TC/(mmol/L) 4.51±0.15b 3.51±0.30a 3.75±0.64a 4.42±0.03b 甘油三酯 TG/(mmol/L) 7.54±0.39b 5.74±0.69a 5.75±0.21a 6.12±0.17a 游离脂肪酸 FFA/(μmol/L) 460.66±35.81a 544.58±3.35b 555.07±28.01b 552.48±19.57b 酸性磷酸酶 ACP/(U/dL) 2.84±0.24 2.91±0.44 2.93±0.12 2.80±0.31 碱性磷酸酶 AKP/(金氏单位/dL) 1.96±0.17 2.05±0.18 2.34±0.37 2.37±0.23 溶菌酶 LZM/(U/mL) 402.14±24.40a 507.14±41.11c 452.14±11.03b 470.00±17.30bc

表 4 饲料中添加表面活性素对吉富罗非鱼血清生化指标的影响 Table 4 Effects of surfactin supplementation on serum biochemical indexes of GIFT

由表5可知，各添加组肝胰脏FAS水平显著低于对照组(P<0.05)，各添加组肝胰脏ACC水平与对照组无显著差异(P>0.05)；各添加组肝胰脏HL和LPL活性显著高于对照组(P<0.05)，各添加组间这2种酶活性无显著差异(P>0.05)。

表 5 (Table 5)

表 5 饲料中添加表面活性素对吉富罗非鱼肝胰脏脂肪代谢关键酶水平或活性的影响 Table 5 Effects of surfactin supplementation on fat metabolism key enzyme contents/activities in hepatopancreas of GIFT 项目 Items 表面活性素添加水平 Surfactin supplemental level/(mg/kg) 0 50 100 200 脂肪酸合成酶 FAS/(nmol/mg) 17.93±0.77c 11.32±0.81a 13.29±0.54ab 13.81±2.13b 乙酰辅酶A羧化酶 ACC/(ng/mg) 3 407.05±308.26 3 450.01±294.00 3 344.17±238.26 3 271.17±191.86 肝脂酶 HL/(U/mg prot) 1.19±0.11a 1.81±0.18b 1.58±0.12b 1.74±0.14b 脂蛋白脂酶 LPL/(U/mg prot) 0.97±0.15a 1.62±0.14b 1.75±0.12b 1.54±0.12b

表 5 饲料中添加表面活性素对吉富罗非鱼肝胰脏脂肪代谢关键酶水平或活性的影响 Table 5 Effects of surfactin supplementation on fat metabolism key enzyme contents/activities in hepatopancreas of GIFT

本试验中，吉富罗非鱼饲料中添加50~200 mg/kg表面活性素均提高了FBW、WGR和SGR，降低了FCR，表明表面活性素具有促生长作用；其中50 mg/kg添加组的效果最佳。目前，关于表面活性素在水产饲料中应用的报道较少。研究表明，在吉富罗非鱼饲料中添加12.5~50.0 mg/kg抗菌脂肽(即表面活性素)，以50.0 mg/kg添加组促生长效果最好^[15]；在点带石斑鱼(Epinephelus coioides)饲料中添加2%含表面活性素的黄豆粉可显著提高其WGR^[13]；添加100 mg/kg的NT-6抗菌脂肽(以表面活性素、芬荠素和伊枯草菌素为活性成分)可显著提高凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的WGR和SGR^[14]。此外，在AA肉鸡饲粮中添加4 000 U/kg抗菌脂肽对肉鸡的生长发育和免疫机能具有较好的调节和促进作用^[11]；在断奶仔猪饲粮中添加4 000 U/kg抗菌脂肽能够提高其生长性能，减少断奶应激造成的腹泻，抑制肠道有害微生物，对有益微生物也有一定的抑制作用，显著影响血液激素水平和某些生化指标，能够提高机体对脂类的转化利用能力和蛋白质的沉积能力^[12]。本试验中表面活性素促生长的添加水平与前人报道存在较大差异，这可能是动物的种类、试验条件、表面活性素有效含量等不同所致。

本研究中，饲料中添加表面活性素提高了吉富罗非鱼肠道脂肪酶活性(50 mg/kg添加组除外)。这可能与饲料中添加表面活性素后，吉富罗非鱼肠道绒毛高度和黏膜基层厚度显著增加，隐窝深度变浅，小肠成熟吸收细胞的数量显著增多有关^[16]。小肠绒毛高度越高，隐窝深度越浅，即两者比值变大时，其对营养物质的吸收能力逐渐增强^{[16, 17]}；肠道成熟细胞数量与肠道消化酶活性呈正相关^[18]，肠道成熟细胞数量增加能提高消化酶活性，进而促进营养物质的消化^[19]。

表面活性素是由一个手性序列为L-L-D-L-L-D-L的七肽和一个含13~15个碳原子的β-羟基脂肪酸构成的复合物，分子质量约为1 036 u^[20]；其长脂肪酸链及肽链上的L-亮氨酸₂、D-亮氨酸₃、L-缬氨酸₄、D-亮氨酸₆、L-亮氨酸₇构成了亲油基团，环链骨架与L-谷氨酸₁和L-天冬氨酸₅ 2个酸性氨基酸残基构成亲水基团^[21]，少量表面活性素即可起到良好的乳化、起泡和增溶等效果^[10]。因此，饲料中添加表面活性素可能发挥与饲用乳化剂类似的作用。此外，表面活性素还具有抗菌、抗病毒和抗氧化等生物活性，其不仅可以阻止引起饲料变质的致病菌和腐生菌的滋生，还可能抑制吉富罗非鱼肠道中有害菌的繁殖，改善肠道健康状况^{[16, 22, 23]}，从而促进鱼体生长。

然而，随着表面活性素添加水平的增加，吉富罗非鱼生长指标并未呈上升趋势，200 mg/kg添加组吉富罗非鱼的FBW、WGR和SGR显著低于50 mg/kg添加组。研究表明，表面活性素的多种生物学活性以表面活性作用为基础。当表面活性素发挥表面活性作用时，其乳化效果与用量直接相关，在临界胶束浓度(critical micelle concentration,CMC)以下时，其乳化能力随着用量的增加而增加；但超过CMC后，乳化性能趋于稳定，即使加大用量，乳化效果也不会有太大变化^[24]。因此，本试验中添加200 mg/kg表面活性素可能已超过其CMC，乳化作用不再显著增强。此外，过量的外源乳化剂可能对机体自身胆汁酸分泌产生抑制作用，导致机体生长受到影响^[25]。

鱼类血清生化指标的变化能够动态反映鱼体的营养物质代谢和生理健康状况。当鱼类健康状况良好时，体内蛋白质代谢正常，血清UN处于较低水平^{[26, 27]}。本研究结果显示，饲料中添加表面活性素显著降低了吉富罗非鱼血清中UN水平，表明其有利于改善蛋白质的代谢，提高蛋白质沉积率^[28]。ALB是鱼类血清中重要的运输蛋白，能维持鱼类血液中胶体渗透压和免疫球蛋白水平稳定。当肝胰脏功能受损时，血清中ALB比例会下降^[29]。本试验中，饲料中添加表面活性素提高了吉富罗非鱼血清中ALB水平，表明表面活性素可以维持鱼类肝胰脏健康。

血液中的TG、TC、FFA和磷脂等脂类物质总称为血脂，其水平的变化常用来反映机体脂类代谢状况和健康水平^[30]。TG是鱼类重要的能源物质，主要参与体内能量的产生与储存，血清中TG水平较高表明肝胰脏中脂肪的分解代谢较低^[31]。TC是合成胆汁酸、维生素D和甾体激素的主要原料，并参与形成细胞膜^[32]。血清中FFA水平可衡量机体脂肪动员的程度^[33]。本研究中，饲料中添加表面活性素后吉富罗非鱼血清中TG、TC水平显著降低，FFA水平显著升高，表明添加表面活性素可促进机体对脂类物质的转化和利用，加速TC分解代谢，抑制TC在血液中的沉积，提高TG的转运和代谢，具有明显的降血脂作用。

鱼类体内的特异性免疫机制不完善，维持机体健康主要依赖于非特异性免疫机制^[34]。血清中ACP、AKP和LZM活性等是常用来评价鱼类免疫功能状况的非特异性免疫指标。本试验中，饲料中添加表面活性素后吉富罗非鱼血清中AKP活性有增强的趋势，说明表面活性素一定程度地提高了机体的免疫力^[35]。LZM是一种具有溶菌活性的碱性蛋白，具有抵抗病原微生物感染的作用，是鱼类生理防御水平的重要指标之一^[36]。本研究中，饲料中添加表面活性素提高了吉富罗非鱼血清中LZM活性，表明非特异性免疫功能增强。可见，饲料中添加表面活性素可提高吉富罗非鱼的非特异性免疫功能，这可能与表面活性素具有抗菌、抗病毒活性有关^{[15, 16]}。

鱼类的脂肪代谢主要在肝胰脏中完成，包括合成代谢、体内的转运以及分解代谢等过程。肝胰脏中相关代谢酶的水平或活性可以反映出鱼类体内脂肪的代谢状况^[37]。FAS是催化乙酰辅酶A酶促系列反应合成棕榈酸的关键酶，ACC是催化乙酰辅酶A形成丙二酰辅酶A反应最关键的酶，两者在脂肪酸合成过程中起着重要作用，控制着体内脂肪合成的强弱，从而影响机体脂肪沉积^[38]。饲料中添加表面活性素后，吉富罗非鱼肝胰脏FAS水平显著降低，表明脂肪的合成代谢受到抑制，但是对ACC水平无显著影响。HL和LPL是鱼类肝脏中参与脂肪降解的2种关键酶。HL作为配体，还可促进低密度脂蛋白和乳糜微粒残粒进入肝细胞，参与高密度脂蛋白胆固醇的逆转运和高密度脂蛋白残粒的分解^[37]。LPL是一种糖蛋白，存在于多种细胞和组织中，主要催化血浆中乳糜微粒和极低密度脂蛋白中的TG分解^[39]，产生甘油并释放出FFA，从而控制TG在各组织的量^[40]。本研究中，饲料中添加表面活性素后吉富罗非鱼肝胰脏HL和HPL活性显著升高，表明脂肪分解代谢增强。这可能与表面活性素促进载脂蛋白表达激活以及肝细胞中HL合成有关^{[10, 41]}。

饲料中添加表面活性素可提高吉富罗非鱼肠道脂肪酶活性、改善血清生化指标、调节脂肪代谢酶水平或活性，进而促进吉富罗非鱼生长。本试验条件下，建议吉富罗非鱼饲料中表面活性素添加水平为50 mg/kg。