罗非鱼因生长快、食性杂、抗病力强、肉质鲜美、价格适中等特点，成为被联合国粮农组织(FAO)推荐向全世界推广养殖的优质鱼类，也是我国主导水产养殖品种之一。2014年我国罗非鱼产量达170万t，居世界首位。但目前优质动、植物蛋白质饲料原料的价格居高不下，致使罗非鱼养殖成本上升，利润空间减小，不利于罗非鱼行业的健康持续发展。因此，以廉价蛋白质源替代优质鱼粉、豆粕等饲料原料的研究势在必行。桑叶的蛋白质含量较高，富含功能活性物质^{[1, 2]}，且在 我国有较大的资源优势。目前，桑叶已在畜禽饲 料中广泛应用^{[3, 4]}。本课题组前期研究证实，饲料中添加10%的桑叶不会影响罗非鱼的生长性能，还可以有效调节其脂质代谢，改善肌肉品质^[5]。但桑叶的消化率较低^[6]，影响其在水产饲料中的添加量。研究发现，桑叶发酵后可以提高其替代鱼饲料中鱼粉的量^{[7, 8]}。迄今，尚未见桑叶发酵蛋白在罗非鱼上的相关研究。为此，本试验以吉富罗非鱼(GIFT,Oreochromis niloticus)为研究对象，研究桑叶发酵蛋白替代鱼粉对其生长、代谢以及血液指标的影响，以期为桑叶在水产饲料中的合理应用提供依据。

以鱼粉(秘鲁直火烘干红鱼粉，粗蛋白质含量为64.5%)、豆粕(预压浸提，粗蛋白质含量为46%)、菜籽粕(预压浸提，粗蛋白质含量为38%)和棉籽粕(预压浸提，粗蛋白质含量为46%)为主要蛋白质源，以豆油为脂肪源配制基础饲料(粗蛋白质含量为32%，总能为15 MJ/kg)。在基础饲料中用桑叶发酵蛋白(采用乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌和固氮菌进行固态发酵而成，粗蛋白质含量为22.5%)，分别替代0(对照)、40%和80%的鱼粉，相应的桑叶发酵蛋白添加水平为0、4%和8%，调节豆粕和面粉的用量，配制成3种等氮等能的试验饲料，其组成及营养水平见表1。各饲料原料粉碎过60目筛，采取逐级稀释法混合均匀，制成粒径分别为2.5和4.0 mm的硬颗粒饲料，风干后放入4 ℃冰箱中保存备用。

表 1 (Table 1)

表 1 试验饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) % 项目 Items 桑叶发酵蛋白添加水平 Fermented mulberry leaves protein supplemental level/% 0 4 8 原料 Ingredients 进口鱼粉 Imported fish meal 5.0 3.0 1.0 豆粕 Soybean meal 20.0 21.5 23.0 菜籽粕 Rapeseed meal 23.0 23.0 23.0 棉籽粕 Cottonseed meal 16.0 16.0 16.0 米糠 Rice bran 8.0 8.0 8.0 桑叶发酵蛋白Fermented mulberry leaves protein 4.0 8.0 面粉 Wheat flour 22.8 19.3 15.8 豆油 Soybean oil 2.0 2.0 2.0 维生素预混料 Vitamin premix1) 1.0 1.0 1.0 矿物质预混料 Mineral premix2) 2.0 2.0 2.0 50%氯化胆碱 50% choline chloride 0.2 0.2 0.2 合计 Total 100.0 100.0 100.0 营养水平 Nutrient levels 粗蛋白质 CP 32.5 32.3 32.1 粗脂肪 EE 4.76 5.09 5.41 粗灰分 Ash 6.37 6.75 6.71 总磷 TP 1.07 1.04 1.02 总能 GE/(MJ/kg) 15.71 15.47 15.32  1) 维生素预混料为每千克饲料提供Vitamin premix provided the following per kg of diets：VA 16.67 mg，VD3 3.33 mg，VE 26.67 mg，VC 333.33 mg，VB1 8 mg，VB6 4 mg，VB12 0.03 mg，VK3 3.33 mg，核黄素 riboflavin 3.33 mg，肌醇 inositol 66.67 mg，泛酸 pantothenic acid 20 mg，烟酸 niacin 23.33 mg，叶酸 folic acid 1.33 mg，生物素 biotin 0.04 mg，乙氧基喹啉 ethoxyquin 100 mg，次粉 wheat middling 9.39 g。  2) 矿物质预混料为每千克饲料提供Mineral premix provided the following per kg of diets：KCl 133.33 mg，KI 40 mg，CoCl2·6H2O 4.67 mg，CuSO4·5H2O 9.33 mg，FeSO4·H2O 266.67 mg，ZnSO4·H2O 133.33 mg，MnSO4·H2O 53.33 mg，Na2SeO3·5H2O 43.33 mg，MgSO4·7H2O 2 000 mg，Ca(H2PO4)2·H2O 13.33 g，NaCl 90.67 mg。

表 1 试验饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis)

试验鱼选用当年培育的体质健壮、规格整齐的雄性吉富罗非鱼(平均体重约为40 g)270尾，随机分成3个组，每个组设3个重复，每个重复30尾。在室内淡水循环水族缸(有效体积为300 L)中饲养试验鱼8周，日投饲率为体重的3%～5%，每天08:00、12:30、17:00各投喂1次。水源为曝气自来水，试验期间水温为(27.5±2.4) ℃，pH为7.6±0.5，溶解氧浓度>6.6 mg/L，氨氮浓度<0.52 mg/L，亚硝酸盐氮浓度<0.08 mg/L。

饲养试验结束后，禁食24 h后称重，每个重复随机取3尾鱼作为全鱼样品，用于体组成的测定；每个重复随机取4尾鱼，用MS-222进行麻醉，测体长、体高，分离出内脏、肝胰脏，用于形体指标的测定；每个重复随机取5尾鱼于尾静脉取血，一部分现场采用上海强生血糖仪测定全血中葡萄糖(血糖)含量，另一部分于4 000×g 4 ℃条件下离心10 min，收集血清，-20 ℃保存备用。

饲料原料及全鱼样品均在105 ℃烘干至恒重，然后采用凯氏定氮法测定粗蛋白质含量，索氏抽提法测定粗脂肪含量，高温(550 ℃)灼烧法测定粗灰分含量，采用钼黄分光光度法测定总磷含量，采用GR3500氧弹式热量计测定饲料总能。

血清代谢指标均采用全自动生化分析仪(日立7100)测定，包括谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性以及总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量。血清超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行测定。蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定。

特定生长率(SGR,%/d)=100×[ln末重(g)-ln初重(g)]/试验天数(d)；

饲料系数(FCR)=总干物质摄食量(g)/鱼体总增重(g)；

蛋白质效率(PER,%)=100×体增重(g)/蛋白质摄取量(g)；

摄食率(FR,%/d)=100×干物质摄食量(g)/{试验天数(d)×[末重(g)+初重(g)]/2}；

成活率(SR,%)=100×试验末鱼尾数(尾)/试验初鱼尾数(尾)；

肥满度(CF,%)=100×体重(g)/体长(cm)³；

脏体比(VSI,%)=100×内脏重(g)/体重(g)；

肝体比(HSI,%)=100×肝胰脏重(g)/体重(g)。

采用SPSS 17.0对所得数据用单因素方差分析(one-way ANOVA)及Tukey’s 多重比较进行处理。试验数据均以平均值±标准误表示，显著性水平设置为P<0.05。

由表2可知，桑叶发酵蛋白添加水平为4%(替代40%鱼粉)时不影响罗非鱼的生长(P>0.05)。而桑叶发酵蛋白添加水平为8%(替代80%鱼粉)时显著降低罗非鱼的末重、特定生长率和蛋白质效率(P<0.05)。各组罗非鱼的成活率均为100%，饲料系数和摄食率均无显著差异(P>0.05)。

表 2 (Table 2)

表 2 桑叶发酵蛋白对罗非鱼生长性能的影响 Table 2 Effects of fermented mulberry leaves protein on growth performance of tilapia 项目 Items 桑叶发酵蛋白添加水平 Fermented mulberry leaves protein supplemental level/% 0 4 8 初重 IBW/g 43.21±1.25 43.14±1.37 43.2±1.52 末重 FBW/g 188.20±5.21a 187.60±4.36a 178.3±3.46b 特定生长率SGR/(%/d) 2.58±0.09a 2.52±0.07a 2.43±0.05b 蛋白质效率PER/% 2.02±0.03a 1.97±0.05a 1.79±0.02b 饲料系数 FCR 1.55±0.11 1.58±0.07 1.68±0.08 摄食率 FR/(%/d) 3.45±0.13 3.53±0.15 3.66±0.16 成活率 SR/% 100 100 100  同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。下表同。  In the same row,values with no or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表 2 桑叶发酵蛋白对罗非鱼生长性能的影响 Table 2 Effects of fermented mulberry leaves protein on growth performance of tilapia

由表3可知，饲料中添加8%桑叶发酵蛋白显 著降低罗非鱼的脏体比和肝体比(P<0.05)，而添 加4%桑叶发酵蛋白则无显著影响(P>0.05)。各组罗非鱼的肥满度以及全鱼水分、粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量均无显著差异(P>0.05)。

表 3 (Table 3)

表 3 桑叶发酵蛋白对罗非鱼形体指标和体组成的影响 Table 3 Effects of fermented mulberry leaves protein on body shape indices and body composition of tilapia % 项目 Items 桑叶发酵蛋白添加水平 Fermented mulberry leaves protein supplemental level/% 0 4 8 形体指标 Body shape indices 肥满度 CF 3.57±0.06 3.51±0.03 3.49±0.05 脏体比 VSI 11.26±0.52a 10.63±0.47a 9.34±0.32b 肝体比 HSI 3.12±0.17a 2.71±0.16a 2.46±0.16b 体组成Body composition 水分 Moisture 70.23±0.78 69.34±0.59 68.72±0.63 粗蛋白质 CP 17.24±0.36 17.31±0.41 17.42±0.28 粗脂肪 EE 6.74±0.17 6.51±0.23 6.37±0.14 粗灰分 Ash 3.53±0.08 3.42±0.07 3.61±0.05

表 3 桑叶发酵蛋白对罗非鱼形体指标和体组成的影响 Table 3 Effects of fermented mulberry leaves protein on body shape indices and body composition of tilapia

由表4可知，饲料中添加高水平(8%)桑叶发酵蛋白显著降低罗非鱼血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇和血糖含量(P<0.05)，显著增加血清高密度脂蛋白胆固醇含量(P<0.05)，提高高密度脂蛋白胆固醇/总胆固醇(P<0.05)。而上述这些指标在低水平(4%)桑叶发酵蛋白添加组与对照组间无显著差异(P>0.05)。随桑叶发酵蛋白替代鱼粉水平的增加，罗非鱼血清高密度脂蛋白胆固醇/低密度脂蛋白胆固醇显著升高(P<0.05)。

表 4 (Table 4)

表 4 桑叶发酵蛋白对罗非鱼血清代谢指标和血糖含量的影响 Table 4 Effects of fermented mulberry leaves protein on serum metabolic indices and blood glucose content of tilapia % 项目 Items 桑叶发酵蛋白添加水平 Fermented mulberry leaves protein supplemental level/% 0 4 8 总胆固醇 TC/(mmol/L) 4.17±0.15a 3.94±0.17a 3.56±0.12b 甘油三酯 TG/(mmol/L) 0.35±0.04a 0.29±0.03a 0.21±0.05b 高密度脂蛋白胆固醇 HDL-C/(mmol/L) 2.16±0.07b 2.27±0.09b 2.49±0.11a 低密度脂蛋白胆固醇 LDL-C/(mmol/L) 1.05±0.06a 0.92±0.05a 0.73±0.04b 高密度脂蛋白胆固醇/总胆固醇HDL-C/TC 0.52±0.03b 0.58±0.02b 0.70±0.05a 高密度脂蛋白胆固醇/低密度脂蛋白胆固醇 HDL-C/LDL-C 2.06±0.07c 2.47±0.06b 3.41±0.12a 血糖 Blood glucose/(mmol/L) 3.93±0.21a 3.85±0.18a 3.48±0.32b

表 4 桑叶发酵蛋白对罗非鱼血清代谢指标和血糖含量的影响 Table 4 Effects of fermented mulberry leaves protein on serum metabolic indices and blood glucose content of tilapia

从本试验结果可以看出，饲料中添加高水平(8%)桑叶发酵蛋白会降低罗非鱼的生长效果。这与在蛋鸡上的研究结果一致^[4]。而研究表明饲料中添加10%桑叶不会影响罗非鱼的生长性能^[5]。这表明饲料中桑叶的添加水平因动物种类、饲料配方不同而存在差异。研究表明，桑叶发酵蛋白是印度囊鳃鲶(Heteropneustes fossilis)较好的饲料蛋白质源，与鱼下脚料配合使用能替代75%鱼粉^[7]。随后在巴塔野鲮(L. bata)^[9]研究中发现饲料中粗纤维含量低于5.63%时，桑叶发酵蛋白可以替代50%的鱼粉(基础饲料中鱼粉的比例为20%)。Kaviraj等^[8]的研究进一步证实，桑叶发酵蛋白是南亚野鲮(Labeo rohita)的优质饲料蛋白质源，与鱼类下脚料配合使用可替代饲料中80%的鱼粉。本试验结果也证实，桑叶发酵蛋白替代40%的鱼粉不会影响罗非鱼的生长。本研究结果还发现，饲料中添加高水平桑叶发酵蛋白可以显著降低罗非鱼的肝体比、脏体比，改善肝脏健康，提高胴体率，符合肉食品消费发展趋势。这些结果表明，桑叶发酵后在水产饲料中的合理利用是可行的，其替代鱼粉的比例因鱼种或试验目的不同而有所差异。尽管发酵工艺可以降低或去除桑叶中丹宁和植酸等抗营养因子的含量^[10]，但桑叶中粗纤维含量仍然较高，影响消化酶的活性，降低饲料中营养成分的消化率^{[11, 12]}。这可能是饲料中添加高水平(8%)桑叶发酵蛋白替代80%鱼粉不能改善罗非鱼生长性能的原因。

饲料中植物蛋白质源替代鱼粉往往因饲料适口性差导致试验动物摄食率降低，进而影响动物的生长性能^[13]。本研究中，饲料中添加桑叶发酵蛋白并没有影响罗非鱼的摄食量，与之前本课题组在罗非鱼^[7]上的研究结果一致。这表明桑叶发酵前后均未影响罗非鱼饲料的适口性。同样，在印度囊鳃鲶^[7]、南亚野鲮^[8]和巴塔野鲮^[10]上的研究也未发现饲料中添加桑叶发酵蛋白影响养殖鱼类摄食量的现象。

研究表明，桑叶因富含黄酮、多糖、生物碱等功能活性成分实现多种途径降糖降脂功效^{[1, 14]}。目前，桑叶已在畜禽饲料中广泛应用，不仅能够改善动物的生长性能，还可以通过调节糖脂代谢来改善肉、蛋品质^{[3, 4]}。本试验结果表明，饲料中添加桑叶发酵蛋白显著降低罗非鱼血脂含量，而且具有剂量依赖性，与本课题组之前关于桑叶在罗非鱼上的研究结果^[7]一致。这进一步阐明桑叶可调节罗非鱼体脂的转化和代谢。一些黄酮类成分被证明可以激活卵磷脂胆固醇酰基转移酶^[15]，或抑制肠道内胆固醇的吸收，提高血清高密度脂蛋白胆固醇/低密度脂蛋白胆固醇^[16]，从而加速胆固醇转运和代谢。Park等^[1]从分子水平证实桑叶提取物通过调节过氧化物酶体增殖剂激活受体(PPARs)和脂蛋白脂酶(LPL)mRNA表达来调节机体的脂质代谢。本试验中，饲料添加高水平(8%)桑叶发酵蛋白可提高罗非鱼血清高密度脂蛋白胆固醇/总胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇/低密度脂蛋白胆固醇，因此推测桑叶可能通过这些途径抑制血脂含量的升高。

桑叶中含有的生物碱1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，DNJ)^[17]和黄酮类物质^[11]能够抑制动物肠道刷状缘膜上二糖酶活性，减缓肠道对碳水化合物的消化和吸收，同时具有调控肝脏中糖代谢过程关键酶活性的作用，从而调控机体中糖、脂肪、蛋白质的代谢和转化^[18]。本试验结果显示，饲料中添加高水平(8%)桑叶发酵蛋白显著降低罗非鱼血糖含量，与本课题组相关研究结果^[7]一致。也有研究指出，桑叶中黄酮是通过提高机体抗氧化能力，促进胰岛素分泌，加快葡萄糖氧化分解这种途径来达到降低血糖含量的作用^[19]。桑叶中不同有效成分降血糖的机制不一，桑叶的降血糖作用涉及到了c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路^[20]。由此可见，桑叶降血糖的机制是比较复杂的，桑叶究竟通过何种途径起到降血糖的作用，有待于深入研究。众所周知，鱼类对碳水化合物的利用能力较低，与哺乳动物的Ⅱ型糖尿病症状相似。因此，弄清桑叶在水产动物上的降糖机制，提升鱼类对饲料糖的耐受能力，尤其是对于像罗非鱼这种典型的杂食性鱼类，具有重要的实践意义。

低鱼粉饲料(含5%鱼粉)中，桑叶发酵蛋白替代40%的鱼粉不会影响罗非鱼的生长，替代80%的鱼粉会显著抑制罗非鱼的生长，但可以降低罗非鱼的血脂和血糖含量。